Material vegetal y microbiano

Las cepas microbianas fueron proporcionadas por el cepario del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD), Sede Chihuahua, Campus Cuauhtémoc, y la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Michoacán, México. Se usaron tres cepas bacterianas del género Bacillus [B. amyloliquefaciens (Ba); B. methylotrophicus (Bm) y B. subtilis subsp. Inaquosorum (Bs)]. La patogenicidad de los fitopatógenos y los efectos antagonistas de Bacillus spp., se confirmaron en estudios previos (^{Rios-Velasco et al., 2016}; ^{Ruiz-Cisneros et al., 2017}) y tres hongos fitopatógenos aislados de cultivos de jitomate, en México [Alternaria solani (As), Fusarium oxysporum (Fo) y Phytophthora infestans (Pi)].

Las semillas de jitomate (Solanum lycopersicon L. cv. Merlice), fueron provistos por la compañía DeRuiter™ (Monsanto Holland), mientras que los agentes polinizantes Bombus terrestris L. (Hymenoptera: Apidae), fueron adquiridos con Koppert México, S.A. de C.V. (El Marqués, Querétaro, México).

Establecimiento y manejo del cultivo de jitomate

El experimento se realizó en un invernadero (tipo túnel de 20 × 8 × 5 m, sin calefacción) en Cuauhtémoc, Chihuahua, México, localizado a 28°26›51»N; 106°49›43»O y 2,020 msnm. Las semillas de jitomate se germinaron en charolas de 200 cavidades hasta el estado de 2-3 hojas verdaderas. Posteriormente, se trasplantaron en bolsas de plástico negro con capacidad de 5 L con una mezcla de sustrato esterilizado (121 ºC, 15 psi, 1 h) compuesto de suelo franco, vermiculita (Termolita, S.A. de C.V., Santa Catarina, Nuevo León, México) y peat moss (Lambert Peat Moss Inc.-Turbines Lambert Inc., Quebec, Canadá) en una proporción de 1:1:1. La fertilización se realizó cada 30 días después del trasplante (dpt) [250 mL de Urea (6 g/L) (Ferti-urea, Productora de Fertilizantes del Noroeste, S.A. de C.V., Cd. Obregón, Sonora, México) y Triple 19 (2 g/L) (Poly-Feed, grado invernadero, fertilizante sólido soluble NPK 19-19-19, Haifa México, S.A. de C.V., México) y 10 mL de medio Murashige y Skoog (4.4 g/L) (Sigma-Aldrich, México)], durante el ciclo de producción 2016. La polinización fue llevada a cabo por una colmena de abejorros B. terrestris.

Inoculación del sustrato con los microorganismos

Las cepas de Bacillus se crecieron en caldo LB (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a 28 °C, en agitación constante (180 rpm) por 2 d. Para su incremento, los hongos se inocularon en un caldo nutritivo (BD Bioxon, Becton Dickinson de México, S.A. de C.V., Cuautitlán Izcalli, Estado de México, México), excepto P. infestans que se creció en un caldo de verduras V8 (jugo V8, Campbell´s™) adicionado con carbonato de calcio (3 g/L), a 28 °C, en agitación constante (180 rpm) por 5 d.

Los patógenos y antagonistas se aplicaron individualmente al sustrato de 150 macetas, a los 8 dpt, de acuerdo con las concentraciones mostradas en la Tabla 1. Se aplicaron 30 mL (4.5-6.0×10¹⁰ UFC) de la suspensión de la bacteria antagonista y 20 mL (2.6-7.8×10⁷ conidias) de la suspensión del fitopatógeno. Se usaron 10 plantas para cada microorganismo (antagonista o fitopatógeno), donde cada planta fue una unidad experimental (T2-T7, Tabla 1) y 90 plantas para las pruebas de interacción entre antagonistas y patógenos (T8-T16, Tabla 1). Adicionalmente, se usaron 10 plantas sin inóculo, como testigos (T1, Tabla 1).

Los tratamientos de interacción (antagonistas vs patógenos), consistieron en la aplicación el patógeno correspondiente a los 18 dpt (10 d después de la aplicación de las cepas de Bacillus). La población de antagonistas se mantuvo mediante tres aplicaciones del inóculo a intervalos de 20 d, después de la primera inoculación. Cabe resaltar que los fitopatógenos se inocularon en una ocasión. Las plantas se mantuvieron bajo condiciones de invernadero y se evaluaron durante el ciclo de producción (abril a octubre 2016).

Mediciones agronómicas

Al final del ciclo de producción, las plantas se evaluaron para altura y peso de la parte aérea, longitud y peso de raíz y diámetro de tallo. La clorofila (unidades SPAD) se estimó cuatro veces (cada 20 dpt) en 10 hojas al azar por planta, de cada tratamiento, usando un medidor de clorofila Spad 502DL Plus (Konica Minolta Brand, Spectrum Technologies, Inc., Aurora Illinois, EUA). También se registró el número de frutos producidos por planta y con base en esto, se calculó el rendimiento, considerando todos los frutos cosechados a través del tiempo durante el periodo de evaluación.

Los jitomates se cosecharon en el punto rojo, de acuerdo a las especificaciones del Departamento de Agricultura de Estados Unidos de América (^{USDA, 2015}) y se almacenaron por 3 d a 4 °C hasta su análisis. Los frutos fueron evaluados para peso, diámetro polar y ecuatorial, color, número y peso de semillas, sólidos solubles totales (SST; °Brix), acidez titulable (% ácido cítrico), firmeza y espesor del mesocarpio. Los diámetros polar y ecuatorial se midieron usando un medidor de diámetro (Cranston Machinery Co., Oak Grove, Oregon, EUA). El color [L* (luminosidad de negro a blanco), a* (va de rojo a verde) y b* (va de azul a amarillo)]. se midió en cuatro puntos equidistantes en el eje ecuatorial de cada fruto, usando un colorímetro Minolta CR300. El número de semillas se determinó en 10 frutos al azar de cada tratamiento. Los sólidos solubles totales (SST, °Brix) se determinaron, usando un refractómetro digital de mesa PAL-1 (Atago Co. Ltd., Tokyo Japón). Para la acidez titulable, se homogeneizaron 10 g de pulpa (a partir de 20 frutos tomados al azar de cada tratamiento) con 250 mL de agua destilada estéril y 50 mL de la solución obtenida se titularon con NaOH al 0.1 N, usando fenolftaleína al 0.5 % como indicador de color. La acidez titulable se expresó como porcentaje de ácido cítrico (^{NMX-F-102-S-1978}). Para la firmeza de los frutos, se evaluaron 50 jitomates tomados al azar de cada tratamiento y se determinó mediante una prueba de punción usando un analizador de textura Ta XTPlus (Texture Analyzer, Surrey, RU), iniciando a 30 cm/min, a una distancia de 15 cm en dos puntos opuestos a lo largo del plano ecuatorial y se registró la fuerza máxima (N). El espesor del mesocarpio se determinó en cuatro secciones de 10 frutos al azar de cada tratamiento, usando un Vernier digital (Knova 0-150 mm).

Análisis bromatológico

Se obtuvo una muestra compuesta de 250 g a partir de 20 frutos tomados al azar de cada tratamiento. Las muestras se colocaron en bolsas Ziploc™ y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. Subsecuentemente, las muestras se homogeneizaron usando una licuadora LB10 (Waring Laboratory, Torrington, CT, USA) y se obtuvieron sub-muestras de puré (de 1 a 10 g, dependiendo de la determinación). Estas se sometieron a mediciones de humedad, cenizas, proteínas (N × 6.25), grasas y fibra total, de acuerdo a los métodos oficiales (925.10, 923.03, 991.20 y 920.35) de la Association of Official Analytical Chemistry (^{AOAC, 2002}).

Análisis estadístico

El experimento consistió de 16 tratamientos (Tabla 1). Los ensayos se realizaron con 10 plantas de jitomate por tratamiento, considerando a cada planta como una unidad experimental, usando un diseño completamente al azar. Los datos se analizaron usando el software Statistical Analysis System versión 9.0 (^{SAS, 2002}) para balancear el análisis de varianza (ANOVA), y las medias se separaron mediante la prueba de Tukey (p=0.05). Las mediciones en frutos, se determinaron por triplicado y los datos obtenidos se sometieron a un ANOVA y una prueba de separación de medias por Tukey (p=0.05).

Promoción de crecimiento vegetal y rendimiento de la planta

Las tres cepas de Bacillus mostraron efectos positivos en al menos una de las variables agronómicas evaluadas (Figuras 1 y 2). El peso fresco y seco de las plantas varió de 104 a 246.6 g y de 29.7 a 47.9 g, respectivamente. Las plantas inoculadas con B. subtilis obtuvieron los valores más altos, causando el efecto más notable en dichas variables de respuesta, comparadas con las plantas testigo (Figura 1). La misma cepa promovió la mayor longitud de raíz (45 cm) y altura (1.45 m; Figura 1). También las plantas tratadas con B. amyloliquefaciens, mostraron un estímulo significativo en altura (1.42 m; Figura 1). Los tres fitopatógenos redujeron hasta en un 25 % la altura de la planta con relación a las del testigo (Figura 1). Además, las plantas tratadas con A. solani y P. infestans resultaron en los valores más bajos para longitud de raíz, con 29 y 30 cm, respectivamente, comparativamente a los testigos (35 cm), pero inferiores a las tratadas con las cepas de Bacillus (Figura 1).

Figura 1 Variables de crecimiento (altura, pesos fresco y seco) estimadas en Lycopersicon esculentum L. cv. Merlice, inoculados con cepas de Bacillus solas y en interacción con hongos fitopatógenos: a) plantas; b) raíces. Los datos se presentan como medias ± error estándar. 

Figura 2 Efectos en variables agronómicas (diámetro de tallo, clorofila (unidades SPAD), y frutos/planta) de plantas de jitomate inoculadas con cepas de Bacillus solas y en interacción con hongos fitopatógenos. Los datos se presentan como medias ± error estándar. 

Asimismo, las plantas tratadas con las cepas de Bacillus mostraron los valores más altos en diámetro de tallo, clorofila en hojas y rendimiento, comparadas con aquellas inoculadas con los fitopatógenos solos y en interacción (Bacillus spp. vs fitopatógenos; Figura 2). Bacillus amyloliquefaciens promovió el mayor rendimiento de frutos (63,000 kg Ha^-1), seguido por B. subtilis (52,000 kg Ha^-1; Figura 2). En el resto de los tratamientos los rendimientos fueron variables (Figura 2).

Los efectos positivos, resultado de la inoculación de cepas de Bacillus pueden deberse a sus múltiples atributos como excelentes colonizadores de raíces, mejoradores del crecimiento de raíz, promotores del rendimiento del cultivo, inductores de resistencia al estrés abiótico, entre otros (^{Beneduzi et al., 2012}). Por su parte, las raíces producen exudados que estimulan el crecimiento de los agentes de control biológico en una manera de sinergismo (^{Widnyana & Javandira, 2016}; ^{Yuan et al., 2015}).

En nuestro estudio, algunas variables agronómicas tales como el crecimiento vegetal, la clorofila en hojas, el rendimiento (número y diámetro de frutos), masa radicular y diámetro de tallo fueron incrementadas por las cepas de Bacillus. Bacillus amyloliquefaciens promovió el mayor rendimiento y tamaño de frutos, comparado con aquellos obtenidos de las plantas testigo. ^{Mena-Violante & Olalde-Portugal (2007)} reportaron un incrementó en el rendimiento por planta y el peso de los frutos en 25 % y 18 %, respectivamente, al aplicar la cepa B. subtilis BEB-13bs. ^{Gül et al. (2008)} y ^{Myresiotis et al. (2014)} demostraron que la aplicación de B. amyloliquefaciens en plantas de jitomate, incrementaron el rendimiento en 8-9 %. Efectos similares por Bacillus en el rendimiento han sido reportados en otros cultivos (^{Esitken et al., 2010}). Esto podría atribuirse a la capacidad de algunas cepas de Bacillus para producir hormonas tales como auxinas, citocininas y giberelinas, las cuales promueven el crecimiento de las raíces y el desarrollo de frutos. También pueden solubilizar fosfatos inorgánicos y mineralizar los fosfatos orgánicos, entre otros nutrientes, favoreciendo el crecimiento de las plantas (^{Esitken et al., 2010}). Además de su capacidad para producir biosurfactinas (lipopéptidos), responsables de incrementar la movilidad de Bacillus para una rápida colonización radicular (^{Lugtenberg & Kamilova, 2009}; ^{Ahemad & Kibret, 2014}).

Los fitopatógenos redujeron en gran medida las variables agronómicas evaluadas, así como los parámetros de calidad del fruto. Las plantas inoculadas con A. solani y P. infestans mostraron un efecto negativo en las variables agronómicas, principalmente en altura de la planta, longitud de raíz, diámetro de tallo, rendimiento y el número y tamaño de frutos. El rendimiento en plantas tratadas con fitopatógenos, fue 31 % menor que en los testigos, variando de 33,000 a 39,000 kg Ha^-1. Las plantas tratadas con F. oxysporum mostraron el rendimiento más bajo (Figura 2). Esto puede atribuirse a la deficiente asimilación nutrimental de las plantas enfermas causado por las micotoxinas (ácido fusárico), y enzimas (cutinasas y esterasas) producidas por los fitopatógenos (^{Beneduzi et al., 2012}).

Por otra parte, el rendimiento en plantas tratadas con las cepas de Bacillus y subsecuentemente con los fitopatógenos, fue menor que el observado con las cepas de Bacillus solas y los testigos. Sin embargo, se redujeron los síntomas de la enfermedad causada por los fitopatógenos e incluso se promovió el crecimiento vegetal en algunos tratamientos (Figura 1). Esto pudo deberse a que algunas cepas de Bacillus son altamente competitivas y capaces de colonizar la rizosfera formando una capa protectora en las raíces produciendo compuestos fungicidas, que actúa como una barrera natural contra los fitopatógenos (^{Widnyana & Javandira, 2016}).

Calidad del fruto

Los datos obtenidos para los diámetros polar y ecuatorial de frutos, se muestran en la Figura 3. El tamaño de los frutos de plantas inoculadas con las cepas de Bacillus, fue mayor (21 %) que en el resto de los tratamientos. Los frutos más grandes fueron producidos por plantas inoculadas con B. subtilis (>55 mm de diámetro). En contraste, las plantas inoculadas con los patógenos, produjeron frutos de menor tamaño. Los frutos de plantas tratadas con B. subtilis, tuvieron el mayor espesor de mesocarpio, mientras que aquellos de plantas inoculadas con los patógenos, fueron más delgados. El mesocarpio más delgado se observó en frutos de plantas tratadas con A. solani (Figura 3).

Figura 3 Efectos en las variables agronómicas (diámetros polar y ecuatorial, número de semillas/fruto, peso de semillas y espesor de mesocarpio) de frutos de jitomate obtenidos de plantas inoculadas con cepas de Bacillus solas y en interacción con hongos fitopatógenos. Los datos se presentan como medias ± error estándar. 

El número de semillas por fruto fluctuó de 38 a 151 (Figura 3). El mayor número se obtuvo del tratamiento con B. methylotrophicus. El peso de semillas por fruto fluctuó de 0.18 a 1.04 g. El mayor peso se obtuvo en los frutos de plantas tratadas con las cepas de Bacillus, en particular con B. methylotrophicus, mientras que los más bajos se observaron en las plantas inoculadas con F. oxysporum y de la interacción B. amyloliquefaciens vs A. solani. Al respecto, ^{Tewksbury et al. (2008)} mencionan que los patógenos pueden reducir el número y tamaño de las semillas en los frutos, o incluso, obtener semillas vacías, presumiblemente como consecuencia de una deficiencia en la asimilación de los nutrientes causada por la enfermedad.

En general, los SST y la acidez titulable no mostraron una tendencia clara, aunque los SST fueron mayores en los frutos de plantas tratadas con los patógenos A. solani y P. infestans. Esto puede deberse a una mayor velocidad de hidrólisis de carbohidratos, lo cual puede tener implicaciones en el mercado del jitomate fresco (^{Tigist et al., 2013}). La acidez titulable fue mayor en frutos de plantas tratadas con las tres cepas de Bacillus, que los testigos (Tabla 2). Donde los valores más altos se observaron en frutos de plantas tratadas con B. amyloliquefaciens (0.48 % ácido cítrico), mientras que los valores más bajos se observaron en frutos de plantas tratadas con F. oxysporum (0.24 % ácido cítrico; Tabla 2).

La firmeza de los frutos fluctuó de 23.3 a 59.2 N sin mostrar una tendencia clara. Los frutos de plantas tratadas con B. subtilis, mostraron los valores más altos, resultando en un incremento en la firmeza en 1.6 veces comparado con los frutos testigo. Los frutos más blandos se obtuvieron de plantas tratadas con F. oxysporum (Tabla 2). Resultados similares fueron obtenidos por ^{Mena-Violante & Olalde-Portugal (2007)} en plantas de tomate inoculadas con B. subtilis. De acuerdo con estos autores, los frutos más firmes son más resistentes al ataque de microorganismos patógenos, lo cual mejora su vida de anaquel. Este efecto puede ser atribuido a cambios en la producción de fitohormonas, principalmente etileno, el cual es responsable de la expresión de genes de la maduración en las plantas. El color de los frutos no se vio afectado por los microorganismos evaluados (Tabla 2), lo cual es consistente con la literatura existente. Este es el atributo de calidad más estrechamente relacionado con la apariencia, contenido de azúcar, acidez, pH, textura, sabor y jugosidad (^{Araujo et al., 2014}).

Composición bromatológica de frutos

El contenido de humedad en frutos de plantas tratadas con las cepas de Bacillus fluctuó de 95.5 a 96.8 %. Las plantas tratadas con B. methylotrophicus produjeron frutos con el menor contenido de agua (Tabla 3). Sin embargo, el contenido de humedad en frutos de plantas tratadas con las cepas de Bacillus y en interacción con los fitopatógenos fue superior al 98 %. Esto puede atribuirse al estrés hídrico inducido en las plantas, por la enfermedad causada por dichos patógenos, lo cual podría inhibir la transpiración normal de las plantas y sus frutos (^{Yadeta & Thomma, 2013}).

El contenido de cenizas fue mayor en frutos de plantas tratadas con cepas de Bacillus en un 95 %, que aquellos obtenidos de los tratamientos de interacción (Bacillus vs fitopatógenos) y de las plantas testigo (Tabla 3).

El contenido de proteínas fluctuó de 0.33 a 0.93 % (Tabla 3), donde se observó que los jitomates de plantas tratadas con las cepas de Bacillus, contenían más proteína (0.68-0.93 %), que aquellos obtenidos de las plantas testigo. Los frutos de plantas tratadas con patógenos tuvieron un alto contenido de proteínas, excepto con el tratamiento de A. solani, resultando en los valores más bajos (Tabla 3). Mientras que el contenido de grasas (lípidos) fluctuó de 0.02 a 0.18 % sin una tendencia clara (Tabla 3), donde el valor más alto fue observado en jitomates de plantas tratadas con B. methylotrophicus. La composición bromatológica de los frutos analizados, fue similar a lo reportado en la literatura (^{Guil-Guerrero & Rebolloso-Fuentes, 2009}; ^{Pinela et al., 2012}). ^{Pinela et al. (2012)}, reportaron altos niveles de humedad, fluctuando de 90.6 a 93.7 %, el contenido de cenizas fluctuó entre 0.54 y 0.74, un contenido bajo de grasas fluctuando de 0.03 a 0.17 en cultivares de jitomate. Adicionalmente, ^{Hernández-Suárez et al. (2007)} mencionan que muchos factores como el cultivar y las prácticas culturales, pueden influir en la composición bromatológica de los frutos de jitomate, principalmente en la concentración de minerales (cenizas), proteína y contenido de grasa. Por lo tanto, la capacidad de las cepas de Bacillus para fijar el nitrógeno, solubilizar minerales como el fósforo y producir hormonas que regulen el crecimiento vegetal, puede estar involucrada en el incremento del contenido de proteínas y cenizas en los frutos (^{Sivasakthi et al., 2014}). Por otra parte, la eficacia de las bacterias antagonistas evaluadas bajo condiciones de invernadero, sin calefacción pudieron verse afectadas por la temperatura, humedad interna y concentraciones de los microorganismos antagonistas y fitopatógenos (^{Inam-ul-Haq et al., 2009}).