Las plantas del género Agave representan un recurso forestal no maderable valioso para la recuperación del suelo, en particular en zonas áridas y semiáridas. Las hojas (pencas) de los agaves están recubiertas con una capa cuticular que desempeña funciones relevantes, como: el intercambio gaseoso, control de los cambios de temperatura, como barrera contra patógenos, entre otros (^{Tafolla-Arellano et al., 2013}). La capa cuticular que cubre las pencas de Agave salmiana Otto ex Salm-Dyck otorga características muy apreciadas en la preparación de diversos platillos tradicionales; está formada por células epidérmicas, cutina, polisacáridos, ceras y estomas (^{Reina-Pinto y Yephremov, 2009}; ^{Staiger et al., 2019}; ^{Pérez-España et al., 2019}). Los estomas están formados por dos células guarda u oclusivas, que dan lugar a un poro llamado ostiolo. Las células oclusivas controlan la apertura y el cierre de los ostiolos como respuesta a las señales hormonales y ambientales para regular el intercambio de gases (^{Zeng y He, 2010}; ^{Biswapriya et al., 2015}). Los agaves presentan estomas en la cara abaxial y adaxial de las pencas (^{Hernández-Valencia et al., 2003}) que se abren durante la noche y se mantienen cerradas durante el día para evitar la pérdida excesiva de líquidos en la planta (^{Lee, 2010}).

Los hongos fitopatógenos utilizan diferentes mecanismos para la invasión de las plantas (^{Gudesblat et al., 2009}) tales como: adhesión de las esporas a la capa cuticular, formación de apresorios y de estructuras adhesivas, invasivas e infectivas, desarrollo de una alta presión de turgencia en las células invadidas (^{Mendgen et al., 2016}) y degradación de la pared celular y la capa cuticular mediante la secreción de enzimas. Algunos fitopatógenos tienen la capacidad de modular la apertura o el cierre de los estomas mediante la liberación de compuestos químicos (^{Staples y Macko, 1980}; ^{Lee et al., 1999}; ^{Bury et al., 2013}).

Actualmente, las plantas de A. salmiana presentan una enfermedad conocida como “negrilla”; ocasionada por el hongo Asterina mexicana Ellis & Everh. (Ellis and Everhart, 1900; ^{Cesaveg, 2008}), del cual existe escasa información. Los síntomas son manchas oscuras en ambas caras de las pencas que pueden llegar a necrosarlas y secarlas. El objetivo de este trabajo fue describir la importancia de la capa cuticular durante la colonización del hongo causante de la negrilla en Agave salmiana.

Las capas cuticulares se obtuvieron de pencas de plantaciones de agave en los municipios Pachuca de Soto, Apan, Cardonal (Hidalgo) y Calpulalpan (Tlaxcala), de febrero a junio de 2019. Se recolectaron tres pencas por planta de ~8 años (de acuerdo con la experiencia de los productores) por municipio, que portaran síntomas de la enfermedad. De la cara adaxial de cada penca se tomó una muestra de los sitios apical, media y base (Figura 1a). Las muestras de la capa cuticular se removieron del sitio de colecta y se mantuvieron en solución de glicerol al 2 % hasta su análisis.

Figura 1 Capa cuticular de Agave salmiana Otto ex Salm-Dyck ssp. salmiana, (a) Extracción de la capa cuticular en tres zonas de la cara adaxial: 1) zona distal, 2) zona media y 3) zona proximal; (b) Adverso de estomas, células oclusivas y células epidérmicas; (c) apresorios observados en mancha negra (4X), (d) penca deshidratada por invasión de la negrilla y (e) apresorios obstruyendo los estomas (SEM). 

El índice estomático (IE) y la densidad estomática (DE) se determinaron con un microscopio óptico (Zeigen, ZB-7300). Las cutículas se tiñeron con azul de metileno para obtener una mayor definición. El IE se calculó de acuerdo con lo recomendado por ^{Sosa et al. (2014)} a partir de la siguiente fórmula:

Donde:

NE = Número de estomas por campo de observación

CE = Número de células epidérmicas en el mismo campo de observación

La DE se determinó al calcular el número de estomas identificados en un área de 19.635 mm^-2, equivalente al campo observado (40X) en un radio de 2.5 mm. Los resultados del IE y la DE se analizaron con ANOVA y las diferencias significativas (P < 0.05) entre los grupos con la prueba Bonferroni (Software GraphPad Prism versión 5.00 para Windows, GraphPad Software Inc.).

Para el análisis de la microestructura, las capas cuticulares se deshidrataron en una estufa con vacío (Shel-Lab, Mod. 1407) a 40 °C y 45 kPa. Posteriormente, se fijaron con cinta de carbón a una platina de aluminio, se recubrieron con oro-paladio y se observaron con un microscopio electrónico de barrido (SEM, Modelo JEOL JMS-5600LV).

La distribución de los estomas en la capa cuticular de la cara abaxial mostró homogeneidad en las zonas analizadas. En las micrografías de la capa cuticular de A. salmiana ssp. salmiana con un grosor de 121 mm ± 2.8, se reconoció la presencia de ceras, células epidérmicas y estomas. El espesor promedio registrado para la cutícula de A. tequilana F. A. C. Weber es de 8.67 μm para la cara abaxial (^{Hernández-Valencia et al., 2003}).

La DE evidenció homogeneidad en las zonas analizadas. Los estomas de tipo tetracítico, el tamaño de los ostiolos de 57.9 mm ± 5 de largo y 23.75 mm ± 1.25 de ancho y las células epidérmicas poligonales isodiamétricas (Figura 1b) son similares a lo consignado por ^{Vargas-Rodríguez et al. (2017)} y por ^{Chávez-Güitrón et al. (2019)}. La diferencia del tamaño de los ostiolos se atribuye a variaciones en el grosor y distribución de la cera cuticular, a la especie y a las condiciones ambientales en las que se desarrollan las plantas (^{García, 2007}; ^{Bernardino-Nicanor et al., 2012}).

Macroscópicamente, la enfermedad de la negrilla se observa como manchas grises que con el tiempo se tornan de color negro (Figura 1d). Al interior de la mancha se identifica la existencia de apresorios (hifas modificadas) especializadas en la invasión del tejido vegetal (Figura 1c) que se acumulan en la penca de maguey y obstruyen los estomas; además se observan otras hifas adheridas a la capa cuticular (Figura 1e).

La DE (22.67 a 27.67 estomas mm^-2) no presentó diferencias significativas entre las zonas de la cara adaxial de las pencas analizadas, ni entre municipios (Figura 2a); los valores (mm^-2) fueron similares con lo reconocido para otras especies de Agave, como: A. mapisaga Trel in L. H. Bailey (20-50 estomas; ^{Nobel, 1994}), A. deserti Engelm. (34 estomas; ^{Gentry y Sauck, 1978}) y A. atrovirens Karw. ex Salm-Dyck (29-30 estomas; ^{Bernardino-Nicanor et al., 2012}); pero difieren de A. promontorii Trel. (18 estomas) y A. sisalana Perrine (11 estomas; ^{Neto y Martins, 2012}).

Figura 2 Índice y densidad estomática en la capa cuticular de Agave salmiana Otto ex Salm-Dyck ssp. salmiana en diferentes municipios. 

El IE para A. salmiana ssp. salmiana es de 10.61-14.15 (Figura 2b) mientras que para A. tequilana es de entre 5.72 y 6.68 estomas/células epidérmicas (^{Hernández-Valencia et al., 2003}). Ambos parámetros (IE y DE) están influenciados por diversas condiciones ambientales y nutricionales (^{Wilkinson, 1979}; ^{Roth et al., 1986}).

En los cortes paradermales y transversales se advirtió que la capa cuticular actúa como barrera mecánica e impide el paso de las estructuras reproductoras del hongo patógeno al interior de la penca. Con las micrografías en SEM, se detectó que las hifas y los apresorios del fitopatógeno solo se manifiestan del lado anverso de la capa cuticular, ya que no se lograron identificar en el lado reverso. Además, se observó que los apresorios se localizan, principalmente, en los estomas, lo que sugiere que el mecanismo de invasión de este hongo consiste en desecar las pencas mediante la modulación de los estomas, al impedir que cumplan el ciclo día-noche de forma adecuada en las plantas afectadas.

Las micrografías SEM muestran la importancia de la capa cuticular como barrera mecánica al evitar que las hifas ingresen a las capas más internas de la penca; por lo tanto, la infección queda restringida al lado anverso de la capa cuticular.

La DE coincide con los registros para otras especies de Agave. Sin embargo, este es el primer reporte sobre la importancia de la capa cuticular de Agave salmiana ssp. salmiana durante su interacción con el hongo fitopatógeno responsable de la enfermedad de la negrilla. Es necesario realizar estudios complementarios para proponer alternativas que permitan evitar o controlar la invasión fúngica