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Introducción
La recolección y comercialización de recursos forestales no maderables es una de las principales actividades económicas en las zonas áridas y semiáridas del noreste de México (Castillo et al., 2015). Sin embargo, el manejo inadecuado de las especies aprovechadas, así como la recolección clandestina, han tenido efectos sobre la diversidad, el área de distribución y la abundancia de dichas especies, al grado de llevarlas a diferentes niveles de riesgo de extinción (Durán y Núñez, 2015). Entre las especies amenazadas en México está Agave victoriae-reginae T. Moore (Asparagaceae) (Tropicos, 2019), conocida como “noa” o “agave de la reina”, especie perenne, endémica del Desierto Chihuahuense, distribuida en el norte de México en los estados de Coahuila, Durango y Nuevo León (Durán y Núñez, 2015).
A partir de su peculiar belleza, dicha especie ha sido el foco de atención por coleccionistas para uso ornamental (González et al., 2011). Esta situación ha llevado a este taxón a ser incluida dentro de la Norma Oficial Mexicana NOM-059-SEMARNAT-2010 bajo la categoría de “especie en peligro de extinción” (Semarnat, 2010), así como dentro del Apéndice II de la CITES (Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres) (CITES, 2017). Por ello, la reproducción asistida de plántulas de A. victoriae-reginae y la posterior reforestación en su hábitat constituye una alternativa para mitigar la pérdida de las poblaciones naturales.
La germinación es la etapa más crucial del ciclo vegetal, pues depende de un conjunto de condiciones ambientales y recursos como suelo y nutrientes, que limitan o promueven el establecimiento de la plántula sobre un sustrato, y en una escala más amplia, la regeneración de una población (Donohue et al., 2005). Por ello, el entendimiento del proceso de germinación es clave para mejorar la producción en vivero (Barnett y Varela, 2004) y de este modo, promover la conservación de las poblaciones forestales.
La madurez, la viabilidad (periodo durante el cual las semillas conservan su capacidad germinativa) y la latencia (incapacidad de germinar bajo condiciones ambientales y recursos óptimos) son factores intrínsecos de los que depende la germinación de las semillas así como de factores extrínsecos como la temperatura, el sustrato, la intensidad lumínica y la humedad (Khurana y Singh, 2001; Doria, 2010). El uso de tratamientos pregerminativos permite acelerar y homogenizar la germinación, entre los cuales se cuentan la escarificación mecánica, térmica y química, la deshidratación, la imbibición, y el uso de reguladores de crecimiento (Cubillos et al., 2011; Hernández et al., 2017).
Existen evidencias de que ciertos microorganismos tienen la capacidad de estimular la germinación y el crecimiento de las plántulas (Cubillos et al., 2011). Por un lado, el uso de hongos como Trichoderma spp. reduce la resistencia mecánica de la testa en las semillas y facilita el rompimiento de la latencia (Delgado-Sánchez et al., 2013). Por otro lado, el uso de bacterias como Bacillus spp. permite la solubilización de nutrientes como fosfatos, lo cual mejora la nutrición de los embriones (Cabra et al., 2017).
En general, el uso de tratamientos pregerminativos en semillas de especies de Agave ha sido limitado y se ha enfocado en evaluar el efecto de condiciones ambientales como la temperatura en ocho especies de este género, incluidos Agave lechuguilla Torr. y Agave cupreata Trel. et Berger (Ramírez et al., 2012), la procedencia de la semilla en Agave potatorum Zucc. (Rangel et al., 2015), o el sustrato en A. victoriae-reginae (Sánchez et al., 2017). Además, en este género, el uso de microrganismos como facilitadores de la germinación no ha sido evaluado. Por ello, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de tratamientos pregerminativos con Trichoderma spp. y Bacillus spp. sobre el porcentaje de germinación de semillas de A. victoriae-reginae. La hipótesis de esta investigación es que el uso de Trichoderma spp. y Bacillus spp. como tratamientos pregerminativos puede aumentar el PG con respecto a la siembra sin estos microorganismos.
Materiales y Métodos
Especie de estudio
Agave victoriae-reginae T. Moore. Planta pequeña, compacta, simple o surculosa o cespitosa, acaulescente de tallo corto (muy variable bajo cultivo). Hojas cortas, de color verde con llamativas marcas blancas, generalmente muy imbricadas, 15-20 (-25) × 4-6 cm. lineal ovado, redondeado en el ápice, rígido, grueso, plano a cóncavo en la parte superior, redondeado a agudo en la parte inferior; margen corneo blanco, generalmente sin dientes, de 2-5 cm de ancho, continuo hasta la base; espinas terminales 1-3, 1.5-3 cm de largo, trígono-cónicas, subuladas, muy anchas en la base, con base amplia, ampliamente cóncavas en la cara superior, con quillas redondeadas debajo, negras: inflorescencia espigada, erecta 3-5 m de altura, densamente florecida en la mitad superior del eje, el pedúnculo con brácteas cartáceas deltoides largas atenuadas; flores en pares o tríadas cortas, bifurcadas, pedicelos robustos, 40-46 mm de largo; gruesamente fusiforme, con cuello corto; tubo poco profundo, extendido, 3 × 8-10 mm; tépalos casi iguales, 18-20 × 5-6 mm, lineales, apiculados redondeados, extendidos, luego envolviendo los filamentos en la post-antesis y erectos, el interior fuertemente aquillado, filamentos de 45-50 mm de largo, insertados en el borde del tubo; anteras de 18-21 mm de largo, amarillas o bronceadas, céntricas o excéntricas; cápsulas ovoides a oblongas, 17-20 × 10-13 mm, redondeadas en la base, apiculadas: semilla 3-5 × 2.5-3.5 mm, hemisféricas a lacriformes, con nervaduras en ambas caras, ala marginal inferior (Gentry, 1982).
Colecta de germoplasma
Se realizó una cosecha masal de semillas de A. victoriae-reginae directamente de las cápsulas que indicaban la dehiscencia de ejemplares (plantas) del jardín botánico del Sitio Experimental “La Sauceda”, perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), localizado en el municipio Ramos Arizpe, Coahuila, en las coordenadas 101°18’58.45’’ O y 25°50’48.45’’ N, a una altitud de 1 024 m. Las condiciones ambientales para este lugar según la clasificación climática de Köppen, modificada por García (1973), el clima es predominantemente seco semicálido y templado (BWK) con una temperatura media anual de 18.5 °C y precipitación promedio anual de 198.7 mm; evaporación promedio anual de 1 349 mm (Díaz et al., 2007). El germoplasma se recolectó en el año 2018 y se almacenó en un recipiente plástico transparente (10 × 10 cm) y hermético a temperatura ambiente (25° C promedio) durante un año, dentro del Campo Experimental Saltillo del INIFAP, en el municipio Saltillo, Coahuila.
Tratamientos pregerminativos
Se aplicaron tres tratamientos pregerminativos a las semillas: T1 (Consorcio de especies de Trichoderma), T2 (Consorcio de especies de Bacillus) y T3 (testigo a base de solo agua corriente directa del grifo). Los microorganismos se adquirieron en forma de complejos bioestimulantes comerciales; para el caso de Trichoderma fue Prevence ® (Trichoderma harzianum Rifal 1969, T. asperellum Samuels, Lieckf. & Nirenberg y T. yunnanense Z. F.Yu & K. Q. Zhang, equivalente a 1 × 1012 esporas ml-1) y para Bacillus fue Bioshield-R TM (Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835) Cohn 1872, B. amyloliquefaciens Priest et al., 1987, B. licheniformis (Weigmann, 1898) Chester 1901, B megaterium de Bary 1884 y B. mycoides Flügge 1886, (equivalente a 1 × 109 UFC ml-1). Las semillas de Agave se sumergieron en una solución final compuesta por 1×106 UFC durante un minuto, y se dejaron secar a temperatura ambiente.
Diseño experimental
Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con tres repeticiones de 100 semillas cada una. Las semillas tratadas con los microorganimos se sembraron en contenedores de plástico transparentes de 25 × 10 cm con cubierta, y como sustrato se utilizó Sphagnum peat moss (Premier®) en una capa de 5 cm de espesor humedecido a capacidad de campo. Después de la siembra, cada uno de los contenedores se mantuvo a una temperatura 26 ± 2 °C y condiciones de 12 h luz y 12 h de oscuridad, bajo condiciones de laboratorio.
Se registró el número de semillas germinadas cada 24 horas para determinar el porcentaje de germinación (PG), el cual se calculó mediante la ecuación:
Donde:
PG = Porcentaje de germinación (%)
SG = Número de semillas germinadas
ST = Número total de semillas
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de covarianza para evaluar el efecto de los tratamientos pregerminativos y el tiempo después de la siembra sobre el PG de las semillas tratadas (α=0.05), mediante el paquete estadístico R (3.4.3) (R Core Team, 2017).
Resultados
El análisis de covarianza mostró que el tratamiento y el tiempo influyeron significativamente sobre la germinación de las semillas (Cuadro 1). El tratamiento con el consorcio de Trichoderma y Bacillus (P < 0.001) determinó un PG final estadísticamente mayor que el testigo, con un incremento de la germinación de 14.8 % y 17.1 %, respectivamente. El tiempo de germinación después de la siembra también influyó en el PG (P < 0.001), durante los primeros días se observó un incremento notable de la germinación, para luego seguir una tendencia de estabilización después del 12° día de la siembra.
Cuadro 1 Efecto del tratamiento y tiempo en el porcentaje de germinación de Agave victoriae-reginae T. Moore.
| Factor de variación | GL | SC | PSC | Valor de F | Valor de P |
|---|---|---|---|---|---|
| Tratamiento | 2 | 2 989 | 1 495 | 13.221 | <0.001 |
| Tiempo | 1 | 34 515 | 34 515 | 305.297 | <0.001 |
| Tratamiento-tiempo | 2 | 244 | 122 | 1.081 | 0.345 |
| Residuales | 75 | 8 479 | 113 |
GL =Grados de libertad; SC = Suma de cuadrados; PSC = Promedio de SC.
La germinación de las semillas de A. victoriae comenzó en el 5° día después de la siembra, con 29.6 %, 19.6 % y 12.6 % para las semillas tratadas con Trichoderma spp., Bacillus spp. y testigo, respectivamente. Entre el 8° y 12° día, se apreció un incremento exponencial de la germinación, y posteriormente, el aumento de la germinación comenzó un relativo periodo de estabilización hasta finalizar a los 26 días, cuando el PG alcanzó 85 % para semillas tratadas con Trichoderma spp., 86.7 % con Bacillus spp. y 74 % con el tratamiento testigo (agua corriente del grifo) (Figura 1).
Figura 1 Porcentaje de germinación de semillas de Agave victoriae-reginae T. Moore según el tratamiento con respecto al tiempo.
El tipo de tratamiento no influyó sobre el tiempo de germinación (P >0.345), ya que los tres tratamientos siguieron trayectorias temporales similares, pero sí hubo evidencias significativas de que el uso de microorganismos aceleró el PG en los primeros días, por ejemplo, en el 5° día, el PG con Trichoderma spp. fue 29.7 %, cifra superior a la registrada con el testigo en el 10° día (28 %). También en los últimos días de germinación, el testigo alcanzó un PG de 74% a los 26 días, mientras que con microorganismos este valor fue superado a los 17 días (79.3 % con Trichoderma spp. y 77 % con Bacillus spp.). Durante los primeros 12 días, hubo diferencias significativas entre los tres tratamientos. Después de este periodo, los PG con los microorganismos fueron similares, pero sí difirieron con respecto al testigo.
Discusión
Los PG totales de los tres tratamientos fueron mayores a los calculados para Agave mapisaga Trel. (70 %) y A. angustifolia Haw. subsp. tequilana (F.A.C. Weber), con 28 % de germinación (Ramírez et al., 2016), en los cuales no se usaron tratamientos pregerminativos con microorganismos. Además, las semillas de A. victoriae-reginae fueron viables después de un año de haber sido recolectadas. Debido a que en las semillas almacenadas ocurren procesos metabólicos como transpiración y metabolismos que originan un envejecimiento natural, y, consecuentemente, la viabilidad tiende a disminuir con el paso del tiempo (Moncaleano et al., 2013), es posible que si se siembran las semillas de A. victoriae-reginae durante el año de recolecta se logren PG más altos. Sin embargo, los resultados de este estudio sugieren que es posible almacenar las semillas al menos durante un año, y tener PG aceptables.
Además, bajo las condiciones ambientales prevalecientes durante el experimento, se puede afirmar que las semillas no presentaron latencia, característica propia de otras especies de Agave que habitan en las zonas áridas, como Agave lechuguilla Torr. (Freeman et al., 1977) y Agave parryi Engelm. var. parryi (Freeman, 1975). La ausencia de latencia en las semillas evaluadas en este estudio es similar a la registrada para semillas almacenadas durante dos años de Agave salmiana Otto ex Salm-Dyck, que tuvieron menor latencia que aquellas sembradas en el mismo año de recolección: dichas diferencias son atribuibles al efecto de la temperatura de almacenamiento (Peña et al., 2006).
El tiempo de inicio de la germinación fue similar al consignado en otro estudio con A. victoriae-reginae (Sánchez et al., 2017), que varió entre 3 y 4 días. El tiempo posterior a la siembra influyó significativamente sobre los PG en el cual se identificaron diferencias significativas entre los tres tratamientos antes de los 12 días, expresado en un periodo de aceleración de la germinación; mientras, en la segunda mitad del tiempo evaluado no hubo diferencias entre Bacillus spp. y Trichoderma spp., pero sí con el testigo. Este comportamiento es similar al de otras especies de Agave, con un periodo de rápido crecimiento seguido por una saturación de la curva de germinación (Ramírez et al., 2012; Ramírez et al., 2016).
El incremento del PG durante los primeros días del ensayo podrían atribuirse a que las semillas más grandes pudieron haber sido las primeras en germinar, por ser las genotípicamente más vigorosas (Sánchez et al., 2011). Otro factor pudo ser la alta humedad por el contenedor con cubierta utilizado, lo que favoreció las condiciones de humedad ideales para detonar la germinación (Castillo et al., 2014).
La respuesta de A. victoriae-reginae a los microorganismos incorporados como tratamientos pregerminativos fue satisfactoria, lo que indica que el uso de Trichoderma spp. y Bacillus spp. puede mejorar la producción en vivero de esta especie. Estos resultados coinciden con los registrados en Opuntia streptacantha Lem, otra planta de zonas semiáridas, en la que los hongos tienen la capacidad de disolver la testa, sin afectar el endocarpio, lo cual facilita la emergencia del embrión (Delgado-Sánchez et al., 2010). Además, los hongos y las bacterias liberan exudados radicales, entre los cuales están azúcares, mucilago, ácidos orgánicos, y aminoácidos, que pueden aportar nutrientes para los embriones, e incluso promover el posterior crecimiento de las plántulas (Ahmad et al., 2008; Gómez et al., 2013).
Además, algunos de los biocompuestos producidos por estos inoculantes, como sustancias antimicrobianas o que estimulan el sistema inmune de la plántula, inhiben el desarrollo de fitopatógenos, lo que representa una ventaja para las nuevas plántulas (Guillén et al., 2006). Por lo tanto, el manejo de Trichoderma spp. y Bacillus spp., utilizados ampliamente en la agricultura (Moreno et al., 2018), es muy recomendable para promover la germinación de semillas de A. victoriae-reginae, pues incrementan el PG.
En plantaciones forestales con especies de coníferas, la incorporación de microorganismos como micorrizas también ha mostrado aumentos en la supervivencia de las plántulas (Gómez et al., 2013). Esto demuestra el gran papel que tienen los microorganismos durante las primeras etapas del ciclo de vida de especies vegetales como pináceas y también de los agaves, a través de interacciones bióticas como el mutualismo (Sieber, 2007). Por ello, es de vital importancia introducir este tipo de microorganismos en la producción de especies forestales en vivero (Ortega et al., 2004).
Debido a que las semillas de A. victoriae-reginae responden favorablemente al uso de Trichoderma spp. y Bacillus spp., es factible la producción en vivero de esta especie, lo que significa una gran oportunidad para la recuperación de las poblaciones de esta especie en peligro de extinción. En estudios posteriores será importante evaluar el efecto de otras condiciones ambientales, como la humedad, temperatura y luminosidad sobre la germinación de las semillas de esta especie y otras en riesgo.
Conclusiones
La germinación de semillas de A. victoriae-reginae respondió favorablemente al tratamiento con Trichoderma spp. y Bacillus spp., incrementaron los PG. Estas características representan una gran oportunidad para la reproducción asistida de esta especie en riesgo y la recuperación de las poblaciones naturales a largo plazo.
