Introducción

Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco, conocido en México como pinabete, es una conífera de importancia ecológica y económica, que se extiende desde Columbia Británica en Canadá hasta el centro de México (^{Hermann y Lavender 1990}; ^{Gugger et al., 2011}). En México, las poblaciones naturales de esta especie conforman el límite sur de su área de distribución y crecen en rodales pequeños y fragmentados (^{Vargas et al., 2004}). La distribución disyunta, aunado a la pérdida de bosques por cambio en el uso de suelo, ha reducido el número de individuos que participan en la reproducción, lo que ha resultado en una baja regeneración natural, por la baja producción y fertilidad de las semillas, así como de la tasa de reclutamiento de plántulas, y finalmente en altos niveles de endogamia en las poblaciones (^{Mápula et al., 1996}; ^{Zavala y Méndez, 1996}; ^{Juárez et al., 2006}; ^{Velasco et al., 2007}), particularmente hacia el límite sur de su distribución: Hidalgo, Tlaxcala, Puebla y Oaxaca. Por ello, se le cataloga como especie sujeta a protección especial en la Norma Oficial Mexicana (NOM-059-SEMARNAT-2010) (^{Semarnat, 2010}), y se le considera especie prioritaria en los programas de conservación y reforestación en el país (^{Vargas et al., 2004}) que favorezcan su regeneración, así como alternativas para su aprovechamiento sustentable.

El cultivo in vitro de tejidos vegetales ofrece importantes perspectivas para la propagación de especies forestales. Las técnicas representan el fundamento de la investigación en la propagación, mejoramiento y conservación de germoplasma. No obstante, para las coníferas sigue siendo complicado y el éxito con frecuencia se restringe a genotipos particulares dentro de las especies (^{Bonga, 2015}). La propagación de P. menziesii en esta modalidad se ha logrado mediante el uso de explantes originados de poblaciones nativas de Estados Unidos de América; se han obtenido diversos protocolos para la regeneración de brotes adventicios a partir del cultivo de embriones y cotiledones, por organogénesis directa (^{Cheng y Voqui, 1977}; ^{Cheah y Cheng, 1978}) e indirecta (^{Winton y Verhagen, 1977}), así como la proliferación y alargamientos de brotes apicales y axilares (^{Gupta y Durzan, 1985}) y embriones somáticos (^{Durzan y Gupta, 1987}).

Sin embargo, no ha sido posible transferir estos protocolos para la propagación in vitro de genotipos de procedencias mexicanas de la especie en cuestión, y el éxito a la fecha ha sido muy limitado. A partir del cultivo de embriones cigóticos maduros de semillas procedentes de dos poblaciones naturales en México (Tlaxco y Terrenate, en el estado de Tlaxcala), se logró obtener brotes adventicios al hacer doce combinaciones de los reguladores de crecimiento 6-benciladenina (BA) con ácido naftalenacético (ANA) y cinetina (K) con ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), cuyas concentraciones abarcaron de 0 a 0.5 mgL^-1 de las auxinas y de 1 a 5 mg L^-1 de citocininas. El enraizamiento fue esporádico, lo que restringió la implementación de la tecnología de propagación a mayor escala (^{Galindo et al., 2000}). Posteriormente, se llegó a la formación de callo y estructuras de tipo embrionario a partir del cultivo de embriones cigóticos maduros, aunque no mostraron evidencias histológicas, ni el desarrollo de plántulas a partir de ellas (^{Carrillo et al., 2011}). La amplia variabilidad en la respuesta morfogenética demuestra que aún se conoce muy poco acerca de la interacción de los diferentes factores del cultivo en la respuesta morfogenética de los explantes, en particular en lo que respecta a la naturaleza de los reguladores de crecimiento.

Debido al interés por consolidar un sistema de propagación in vitro que permita la regeneración de genotipos mexicanos de P. menziesii, en el presente trabajo se buscó caracterizar y comparar la respuesta morfogenética de embriones cigóticos maduros expuestos a dos combinaciones de reguladores de crecimiento; se evaluó la capacidad para inducir brotes adventicios, así como el patrón de desarrollo de los mismos respecto al tipo de tejido involucrado y el efecto de su distancia con el medio de cultivo. Mediante un análisis estructural se logró profundizar en la comprensión del origen y de los eventos celulares que ocurren previos a la diferenciación de los brotes, y que sirven para explicar el efecto que tienen los reguladores de crecimiento en mantener la capacidad organogénica.

Materiales y Métodos

Resultados

Al evaluar la respuesta de los explantes a los dos tratamientos, no se encontraron diferencias en el número de embriones que respondieron (P< 0.05): en ANA/BA, 75.8 % formaron brotes, mientras 73.7 % lo hicieron con 2,4-D/K (Cuadro 1). Para ambos tratamientos, el número de brotes con primordios foliares claramente diferenciados aumentó en el transcurso de 90 a 130 días, aunque solo fue significativamente mayor en los tratamientos con ANA/BA (P< 0.05), en los que el promedio de nueve brotes que se observó en inicio, se duplicó a los 130 días (Cuadro 1); en contraste, en 2,4-D/K, prácticamente no se incrementaron a través del tiempo (P< 0.05).

Tanto los cotiledones como el hipocotilo aportaron un número similar de brotes, aunque en ANA/BA se contabilizaron más (P< 0.05). No obstante, los brotes formados a partir de embriones tratados con 2,4-D/K tuvieron una apariencia más vigorosa, al alargarse más rápidamente (Figura 1A y 1B).

Figura 1 Brotes adventicios formados después de 130 días de cultivo tratados con 0.53/13.32 µM de A) ANA/BA, o B) 2,4-D/K. 

Por otra parte, se comparó el efecto de la distancia de los tejidos embrionarios sobre el medio de cultivo en su respuesta morfogenética. Se observó que el número de brotes adventicios formados a partir de los cotiledones e hipocotilo de la SCM fue similar para ambos tratamientos; aproximadamente 37 % de los brotes que se desarrollaron en ANA/BA y 53 % en 2,4-D/K se iniciaron de esta superficie. En ANA/BA se obtuvo un número significativamente mayor a partir de los tejidos de la SAM (P< 0.05) (Cuadro 2).

Análisis histológico

El estudio histológico de los explantes a distintos tiempos de cultivo mostró su origen adventicio por organogénesis directa. Si bien el patrón de desarrollo fue similar, la temporalidad de la aparición de las diferentes estructuras difirió entre los tratamientos y tipos de tejidos (cotiledones vs. hipocotilo), y fue más tardía en 2,4-D/K y en los cotiledones. Frecuentemente se observó la reactivación del meristemo apical del embrión a partir del cual se diferenció una yema apical, mientras que la cofia se hipertrofió y con el tiempo degeneró.

Los cortes longitudinales de los embriones al momento de ser sembrados (Figura 2) evidenciaron que la epidermis tiene un solo estrato de células rectangulares, aplanadas longitudinalmente, que rodean al tejido fundamental y a los haces provasculares centrales. Las células del tejido fundamental son parenquimáticas, cúbicas, dispuestas ordenadamente a lo largo del eje, con pocos espacios intercelulares, núcleo conspicuo, citoplasma denso; mientras que la región del tejido provascular presentó células nucleadas con forma alargada. Ambos tipos celulares contenían abundante material de reserva. El meristemo apical del brote tiene la forma característica de domo, conformado por células isodiamétricas, densamente citoplásmicas, de núcleo prominente. En esta etapa, no se observó actividad mitótica en ninguna de las regiones mencionadas.

Cot = Cotiledones; hco = Hipocotilo; ma = Meristemo apical; mr = Meristemo radicular; epi = Epidermis; subepi = Subepidermis/tejido fundamental; pvasc = Haz provascular.

Figura 2 Corte longitudinal de embrión maduro de Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco y acercamiento de las capas de células que lo conforman. 

El tercer y hasta el cuarto día de cultivo se caracterizaron por la reactivación de la actividad mitótica a través del explante, con divisiones celulares anticlinales en el tejido fundamental y provascular del hipocotilo, que probablemente aportaron al alargamiento del embrión. Asimismo, se advirtió la aparición de vacuolas, así como una notoria disminución en la cantidad de material de reserva en el tejido fundamental.

Entre el cuarto y el sexto día de cultivo surgieron divisiones celulares localizadas, periclinales y anticlinales, en las capas subepidérmicas (Figura 3A) y epidérmicas (Figura 3B) del eje embrionario, principalmente en las regiones intercotiledonarias y en la región media-distal del hipocotilo. La respuesta en los cotiledones fue más lenta que en el hipocotilo y las divisiones celulares fueron dispersas.

A.Formación de conjuntos de células en la capa subepidérmica a los seis días de cultivo (100X); B. Divisiones periclinales y anticlinales de la capa epidérmica (epi), así como promeristemoides (pm) en las capas subepdiérmicas (20X); C. Meristemoide en el hipocotilo de la superficie en contacto con el medio a los después de 14 días de cultivo (10X); D. Región meristemática en el hipocotilo de la superficie alejada del medio después de 16 días de cultivo (10X).

Figura 3 Análisis estructural de las etapas tempranas de la formación de brotes adventicios a partir del cultivo in vitro de embriones cigóticos maduros de Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco.  

A partir del sexto día, tanto en ANA/BA como en 2,4-D/K, el patrón morfogenético varió en función de la distancia del tejido con respecto al medio de cultivo. En la SAM se evidenciaron las primeras agrupaciones celulares y promeristemoides (estructuras de 4-6 células) (Figura 3B), que se iniciaron a partir de la activación mitótica de una o muy pocas células y revelaron una distribución dispersa en el tejido fundamental. Estas estructuras se formaron primero en la región media-distal del hipocotilo y posteriormente se extendieron a los cotiledones. A partir de los 12 días en ANA/BA y de los 14 días en 2,4-D/K, se detectaron los primeros meristemoides, con forma de domo, que dieron a la superficie del embrión una apariencia nodular (Figura 3C).

La epidermis formó parte de dichas estructuras al donar células mediante divisiones anticlinales. El cuerpo de los meristemoides creció por medio de divisiones periclinales y anticlinales de células del tejido fundamental. En los cotiledones, la actividad meristemática inició después de diez días de cultivo en ANA/BA, usualmente sobre la superficie abaxial y en el extremo de los mismos; mientras que en los tratamientos con 2,4-D/K, se presentó después de 16 a 22 días de cultivo y se limitó al ápice.

Por su parte, en la SCM se formaron áreas meristemáticas amplias (Figura 3D), que se caracterizaron por células pequeñas, de citoplasma denso y núcleo prominente, que se iniciaron a partir de divisiones anticlinales y periclinales de la epidermis, y de anticlinales, periclinales y oblicuas en las primeras dos capas subepidérmicas. En ANA/BA y 2,4-D/K, este patrón comenzó en la región media del hipocotilo a partir de los seis días, y después de los 10 a 12 días de cultivo en las regiones intercotiledonarias; mientras que los cotiledones respondieron tardíamente, a los 14 y 16 días en ANA/BA y 2,4-D/K, respectivamente. Después de 16 días alcanzaron un grosor de ocho a diez células y abarcaron la longitud total del embrión (sin la cofia), dándole una apariencia irregular, aun si las células se mantuvieron relativamente organizadas y contenidas por la epidermis (Figura 4A). A partir de los 22 y hasta los 45 días de cultivo, de éstas áreas se originaron estructuras nodulares de apariencia meristemática, de cuya superficie se diferenciaron yemas apicales; aunque en la mayoría de los casos la epidermis del embrión constituyó parte de la estructura, se observaron otras, posiblemente proembriones, que emergieron a la superficie despúes de romper la epidermis (Figura 4B).

A. Primordios de brotes formados sobre cotiledones después de 30 días de cultivo (4X); B. Estructura nodular meristemática formado en la superficie del hipocotilo de la SCM después de 30 días; la flecha señala la ruptura de la epidermis (10X); C. Formación de brotes a lo largo del hipocotilo y cotiledones después de 40 días (5X); D. Nódulo meristemático mostrando la diferenciación de traqueida (flecha), Normanski 50X; E. Acercamiento de un brote formándose sobre un cotiledón en la superficie alejada del medio (SAM), así como nódulo meristemático (flecha) (10X); F. Acercamiento de brotes formándose a partir de un área meristemática (am) de la superficie en contacto con el medio (SCM) (20X).

Figura 4 Etapas tardías del proceso de la formación de brotes adventicios a partir de embriones de Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco cultivados.  

Los primeros brotes (conformados por un domo apical con primordios foliares) se distinguieron en el hipocotilo a partir de los 14 días de cultivo, aunque el proceso se generalizó entre los 20 y los 30 días en 2,4-D/K y ANA/BA, respectivamente; mientras que en los cotiledones se inició después de los 35 a los 40 días. Cortes longitudinales a los 45 días mostró que si bien muchos brotes estaban claramente diferenciados, el proceso de diferenciación fue asincrónico, particularmente en ANA/BA, ya que a esta fecha aún era posible identificar meristemoides o primordios en etapas tempranas de desarrollo, lo que prolongó el período de iniciación y el crecimiento de brotes y explica incremento notorio en número entre 90 y 130 días (Cuadro 2). En contraste, en los explantes sometidos a 2,4-D/K rara vez se evidenciaron meristemoides en etapas tardías del cultivo.

Se reconoció el inicio de brotes a partir de los nódulos meristemáticos después de los 60 días en cultivo (Figura 4C -F), para indicar su capacidad morfogenética. Se identificó la acumulación de taninos condensados alrededor de los meristemoides y yemas, así como la formación de novo de traqueidas asociadas, aún antes de que se evidenciaran los primordios foliares; sin embargo, rara vez se conectaron con el sistema vascular embrionario.

En el presente trabajo se advirtieron, también, los cambios celulares indicativos de la pérdida de la competencia, y por lo tanto, el comienzo de la recalcitrancia. Desde el día seis de cultivo, las células que no respondieron meristemáticamente formaron grandes vacuolas en su interior, y desplazaron al núcleo presionándolo contra la pared celular. En etapas tardías del cultivo, presentaron un arreglo laxo e irregular y la acumulación de polisacáridos en la matriz extracelular circundante, así mismo, muchas de ellas, sobre todo en la epidermis y cerca de los meristemoides y zonas meristemáticas, reunieron taninos en su interior.

Discusión

El cultivo in vitro de embriones cigóticos completos representa una alternativa viable de propagación de genotipos mexicanos de P. menziesii ya que aumenta el número de brotes, y potencialmente, el número de plantas que se pueden obtener de un solo embrión. ^{Galindo et al. (2000)} indican que la organogénesis a partir de embriones de dicha especie ocurre dentro de un intervalo de concentraciones de auxinas y citocininas relativamente amplio, tanto en ANA/BA como 2,4-D/K, aunque el número de brotes, la supervivencia y la velocidad de crecimiento de los mismos difiere.

La capacidad de responder morfogenéticamente fue similar para ambos tratamientos, y se inició en los tejidos epidérmicos y subepidérmicos, tanto del hipocotilo como de los cotiledones. En general, esto contrasta con otros estudios en Pseudotsuga, en los que regularmente se utilizan cotiledones de embriones germinados in vitro como principal explante (^{Cheng y Voqui, 1977}). Los resultados del presente trabajo demuestran que el manejo del embrión cigótico completo permite el aprovechamiento de diferentes regiones ontogenéticamente predeterminadas para el crecimiento, que mantiene a las células en estado competente y puede representar una alternativa útil para la propagación in vitro en especies o genotipos recalcitrantes.

Se confirmó que el uso de BA promovió la formación de un mayor número de brotes, aunque en el tratamiento con K, adquirieron una apariencia más vigorosa. Datos similares se verificaron para otras especies con las cuales se comparó el efecto de diferentes tipos de citocininas sobre el crecimiento de brotes adventicios, incluyendo genotipos de P. menziesii de Estados Unidos de América (^{Cheng y Voqui, 1977}), así como varias especies de Pinus (^{Pelletier y Laliberté, 2000}; ^{Montalbán et al., 2011}) y Picea (^{López et al., 2000}).

El menor número de brotes observado en 2,4-D/K después de 130 días de cultivo significa que el período durante el cual las células del explante se mantienen competentes es menor que en los cultivos de ANA/BA. Esto se corroboró con el análisis histológico, con el que se pudo evidenciar que en ANA/BA los explantes producen meristemoides aún en etapas tardías de cultivo. Aunque no se conocen las causas de dicha respuesta, en otros sistemas se ha consignado que la capacidad de los explantes para absorber y metabolizar citocininas varía según el tipo de regulador, el tiempo de cultivo y el desarrollo del explante (^{Cortizo et al. 2009}), lo cual se vea probablemente también afectado por el tipo de citocinina. No se puede descartar que el empleo de 2,4-D, considerado un inductor de callo y embriogénesis, pudo influir en una pérdida más rápida de la competencia, particularmente en los cotiledones.

La formación de brotes adventicios siguió el patrón descrito (^{Cheah y Cheng 1978}; ^{Yeung et al., 1981}; ^{Villalobos et al., 1985}; ^{von Arnold y Grönroos, 1986}; ^{López et al., 2000}) que inició con la reactivación mitótica de una o dos células que fomaron, en orden secuencial, promeristemoides, meristemoides y luego el domo apical integrado por el meristemo y los primordios foliares.

Sin embargo, la distribución espacial y la asincronía temporal del proceso morfogenético evidenció la importancia de la posición de las células con respecto al medio de cultivo para su competencia. Si bien se desarrollaron brotes tanto en la superficie alejada del medio, como en la que estaba en contacto directo con la misma, en los primeros, se iniciaron a partir de meristemoides individuales, mientras que en los segundos, en ANA/BA en particular, se formaron amplias zonas meristemáticas que diferenciaron brotes en etapas tardías del cultivo. Esto concuerda con la hipótiesis de que el establecimiento de gradientes hormonales y nutrimentales en los explantes es un factor importante en la inducción de la competencia celular y la posterior determinación organogénica (^{Yeung et al., 1981}; ^{Joy y Thorpe, 1999}).

Según ^{von Arnold y Grönroos (1986)} las áreas meristemáticas son el resultado de la exposición supraóptima y prolongada a citocininas, por lo que la formación de meristemoides distintivos, se obtiene al reducir el tiempo de exposición a estos reguladores de crecimiento. En Pinus banksiana Lamb., se describe que las células en contacto con el medio proliferan, pero nunca dan origen a brotes (^{Pelletier y Laliberté, 2000}), lo cual contrasta con las observaciones del presente trabajo.

Finalmente, se probó que la mayoría de los brotes formados tuvieron un origen multicelular, ya que los meristemoides se constituyeron por células donadas por la epidermis y por la subepidermis. Esto contrasta con registros previos del desarrollo de brotes a partir de explantes de cotiledón de P. menziesii, con un origen subepidérmico y que emergen al romper la epidermis (^{Cheah y Cheng, 1978}), lo que sugiere una pérdida de la competencia de la epidermis en tejido diferenciado o con mayor grado de maduración.

En el estudio realizado, la epidermis experimentó una actividad mitótica importante, con divisiones anticlinales y periclinales, que donaron células tanto a la superficie del embrión como al tejido fundamental y las regiones meristemáticas en desarrollo. Tal comportamiento se ha observado en sistemas de micropropagación propuestos para Pinus radiata D. Don (^{Villalobos et al, 1985}), Pinus strobus L. (^{Flinn et al., 1988}) y Abies amabilis Douglas ex Forbes (^{Kulchetscky et al., 1995}). Aunque este tipo de reacción se estimuló con los tratamientos de inducción, es posible que también se haya facilitado por una predisposición de la epidermis a responder meristemáticamente, proceso que describió ^{Allen (1947)} en uno de los pocos trabajos publicados sobre la embriogénesis cigótica para el género. El origen multicelular de las estructuras puede tener un fuerte impacto sobre futuras estrategias de mejoramiento, particularmente si se consideran vías como la transformación genética, ya que la obtención de quimeras es altamente probable.

Conclusiones

Este trabajo hace un seguimiento del inicio y etapas tempranas de la formación de bortes adventicios a partir del cultivo de embriones cigóticos maduros completos de P. menziesii, en respuesta a los tratamientos con ANA/BA y 2,4-D/K. El análisis histológico contribuye a la comprensión de los eventos celulares que preceden la generación de nuevos órganos, así como a la pérdida de competencia morfogenética e inicio de la recalcitrancia.

El número de brotes formados en ANA/BA es más alto que en 2,4-D/K, si bien el proceso fue más asincrónico. El análisis histológico muestra que el proceso de caulogénesis ocurre vía organogénesis directa y los brotes tienen un origen multicelular, ya que se conforman por células tanto de la epidermis como de las capas celulares subepidérmicas, lo que da lugar a zonas meristemáticas o meristemoides, según su distancia del medio de cultivo.

La pérdida de la competencia celular ocurre primero en 2,4-D/K, y el mayor número de brotes formados en ANA/BA resulta de una actividad meristemática prolongada.

Los estudios de esta índole constituyen la base de futuras investigaciones para la optimización de las técnicas de cultivo con importantes implicaciones al proveer un contexto estructural para abordar los eventos fisiológicos y moleculares que regulan la morfogénesis tanto in vitro como ex vitro.