Área de estudio

Se establecieron tres parcelas de muestreo, una para cada especie de pino, las cuales se detallan a continuación:

1. Bosque Escuela, Iturbide Nuevo León; bosque de pinos con Pinus pseudostrobus Lindl., otras especies localizadas dentro de la parcela: Quercus canbyi Trel., Amelanchier denticulata (Kunth) K. Koch, Arbutus xalapensis Kunth, Prunus serotina Ehrh. 24º42’51” N, 099º51’67” O; 1 630 msnm.

2. Pablillo, Galeana, Nuevo León; bosque de pinos con Pinus arizonica var. stormiae Mart. 24º36’51” N, 100º00’16” O; 2 000 msnm.

3. Pablillo, Galeana, Nuevo León; bosque de pinos con Pinus cembroides Zucc. 24º37’11” N, 100º00’38 O; 2 000 msnm.

Muestreo de hojas

Cada 15 días, durante un año, se recolectaron en las parcelas seleccionadas 10 fascículos al azar de los siguientes tipos de hojas: hojas verdes, hojas senescentes, hojas muertas aun adheridas al árbol, hojas muertas "colgantes", aquéllas que no han llegado al mantillo y están suspendidas sobre la vegetación, hojas del mantillo que aún no inician el proceso de degradación (L), hojas del mantillo de la capa intermedia con algunos signos de degradación (F1), hojas del mantillo de la capa inferior con signos avanzados de degradación (F2).

Las muestras se utilizaron para el aislamiento de hongos por los métodos que se describen a continuación.

Aislamiento de hongos de las hojas en medio de cultivo

En el laboratorio, se tomaron las medidas de todas las hojas recolectadas y se seleccionaron al azar tres hojas por muestra y se procesaron para el aislamiento de los hongos, mediante una modificación al protocolo propuesto por ^{Kowalski y Zych (2002)}. Las hojas se esterilizaron, superficialmente, con etanol al 96 % por un minuto. A continuación se trataron luego con hipoclorito de sodio al 3 %, por 10 minutos. Por último, se sumergieron en etanol al 70 %, por 30 segundos. Las hojas tratadas se cortaron transversalmente con una navaja esterilizada (flameada en el mechero). El número de cortes varió según su tamaño. Los cortes se colocaron, con la ayuda de unas pinzas esterilizadas (flameadas en el mechero), en una caja de Petri con extracto de malta agar al 2.5 % y se incubaron a 22 °C, en una incubadora Shellab L120, por el tiempo necesario hasta la observación de colonias a simple vista.

Se contaron todas las colonias obtenidas y se identificaron mediante técnicas rutinarias de micología, a partir de observación directa al microscopio compuesto de preparaciones montadas en ácido láctico, en glicerina alcohol agua (GAW), o en agua destilada. Se utilizaron las obras de ^{Sutton (1980)}, ^{Minter (1981)}, ^{Dennis (1981)}, ^{Ellis (1971}, ¹⁹⁷⁶), ^{Arx (1981)} y ^{Nag Raj (1993)}; y se consultó la página web del Index Fungorum (2018) (http://www.indexfungorum.org/) para corroborar los nombres de las especies y los autores de las mismas.

Se realizaron subcultivos de todas las morfoespecies presentes en las cajas, con el propósito de obtener vouchers de los hongos estudiados, los cuales se depositaron en la colección de cepas del Herbario Micológico de la Facultad de Ciencias Forestales (CFNL); así como, de aquellos cultivos, en los que no fue posible la determinación de la especie por no contar, en su momento, con estructuras morfológicas que permitieran su identificación.

Hongos de las hojas en cámaras húmedas

De cada muestra recolectada quincenalmente en los sitios de muestreo y por tipo de hoja, se seleccionó al azar un fascículo de hojas y se colocó en cámara húmeda, la cual consistió en una caja de Petri con papel estraza esterilizado humedecido con agua destilada estéril. Estas cajas se mantuvieron en condiciones húmedas por un mes. Después de este tiempo se pusieron en un congelador Acros modelo ART14JKX a una temperatura de 5 °C por una semana para prevenir una infestación por ácaros. Enseguida, las muestras se examinaron en un microscopio Karl Zeiss Axiostar Plus, de acuerdo a las técnicas micológicas de rutina (^{Hawksworth, 1974}). La identificación de las especies se hizo con base en la literatura especializada las (^{Sutton, 1980}; ^{Minter, 1981}; ^{Dennis, 1981}; ^{Ellis, 1971}, ¹⁹⁷⁶; ^{Arx, 1981}; ^{Nag Raj, 1993}).

La información por colecta y tipo de hoja se integró en una hoja de cálculo de Excel 2013, para estimar la riqueza, abundancia y frecuencia de los hongos asociados a las hojas. La riqueza correspondió al número de especies de hongos observadas (total, por tipo de hojas, por especie de pino); la abundancia absoluta (Aba) al número de individuos por especie, con respecto al número total de individuos presentes en el área de estudio (ni). La frecuencia absoluta se obtuvo a partir del número de puntos con la especie entre el total de puntos muestreados; para comparar el patrón de hongos en cada una de las hojas estudiadas, se realizó un análisis de conglomerados, con el programa estadístico PAST3 (^{Hammer et al., 2001}).

Diversidad de hongos mediante el método de cultivo en placa de Petri

Se realizaron 26 muestreos de hojas para cada una de las especies consideradas. Se procesaron 1 638 muestras para las tres especies de pinos.

El análisis incluyó un total de 23 332 colonias de hongos (Cuadro 1).

Asimismo, se obtuvieron 1 953 subcultivos, de los cuales se determinaron 57 taxones fúngicos, de ellos 56 se adscriben al Phyla Ascomycota y solo uno (Gymnopus androsaceus) al Basidiomycota. ^{Voříšková y Baldrian (2013)} indican que Ascomycota fue el más abundante en hojas verdes y en senescentes, con 88.5 % y 99.5 % de amplificaciones, respectivamente. Lo cual coincide con este trabajo; si bien, dichos autores usaron un método molecular para la determinación de los hongos.

^{Haňáčková et al. (2015)} con el método de cultivo y uno molecular concluyeron que con ambos se obtuvieron especies dominantes similares y en el estadio temprano de la degradación, los ascomicetos son predominantes, y los basidiomicetos solo se presentan ocasionalmente, lo cual, también coincide con los resultados aquí documentados.

Se registraron 40 taxones de hongos para Pinus arizonica, 28 para P. cembroides y 32 para P. pseudostrobus. La lista completa se detalla en el Cuadro 2. Las especies más abundantes fueron Lophodermium australe Dearn., Pestalotia stevensonii Peck y Rhizosphaera kalkhoffii Bubák; mientras que Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries, Alternaria alternata (Fr.) Keissl. y Ceuthospora sp. fueron las más frecuentes. ^{Yuan y Chen (2014)} señalan a los taxa de Lophodermium como pioneras frecuentes en las hojas y que juegan un papel importante en la degradación de la hojarasca.

El taxón que presentó la mayor riqueza de hongos fue P. arizonica, seguido de P. pseudostrobus y P. cembroides. Sin embargo, la cantidad más grande de colonias se registró en P. pseudostrobus seguido de P. arizonica. El número de colonias en P. cembroides, comparado con los otros pinos, fue de 10 a 11 veces menor. Lo anterior puede relacionarse con la longitud de la hoja. Los promedios de largo de hojas muestreadas fueron de 173.9 mm, para P. pseudostrobus; 156.1mm, para P. arizonica; y de 27 mm, para P. cembroides. Los números mínimo, promedio y máximo de especies de hongos por especie de pino y tipo de hoja se presentan en el Cuadro 3.

Las hojas muertas en el suelo y las hojas grises, en todos los casos presentaron la riqueza más alta. A las hojas verdes les correspondió la menor riqueza, lo cual fue particularmente notorio para P. cembroides. Conforme avanza el grado de descomposición de las hojas, el número de especies de hongos siempre disminuyó. ^{Tokumasu et al. (1994)} citan resultados similares, consignan que las hojas colgantes y las del suelo mostraron el mayor número de aislamientos.

Al considerar la cantidad de colonias, las hojas muertas colgantes y las hojas muertas en el suelo tuvieron el mayor número. Las hojas fragmentadas y las verdes fueron las que menos colonias registraron (Figura 1).

Figura 1 Número de colonias por tipo de hoja en las especies de pino estudiadas. 

En cuanto a los patrones de riqueza de hongos en los siete tipos de hojas, en el análisis de conglomerados (Figura 2) se distinguen tres grupos: uno formado por las hojas verdes y senescentes, otro por las hojas muertas (adheridas, colgantes y en el suelo) y un tercero solo por las hojas fragmentadas.

Figura 2 Análisis de conglomerados de la riqueza de hongos en los tipos de hojas en las tres especies de pinos estudiadas 

Diversidad de hongos de la hojarasca mediante el uso de cámaras húmedas

Se realizaron 27 muestreos para Pinus arizonica y P. cembroides y 26 para P. pseudostrobus. Se analizaron un total de 400 muestras, en las que se identificaron 28 taxones de hongos de las hojas adheridas, las hojas colgantes y las hojas muertas en el suelo. La lista completa de los especies se presenta en el Cuadro 4.

Se registraron nueve especies para Pinus cembroides, de las cuales Rhizosphaera kalkhoffii, Pestalotia stevensonii y Preussia sp. fueron las más comunes en hojas adheridas. Desmazierella acicola y Discosia strobilina fueron los hongos más comúnmente encontrados en hojas en el suelo (Cuadro 5). ^{Tokumasu et al. (1994)} observaron patrones similares para Pinus sylvestris en Europa y citaron la presencia de D. acicola en hojas en el suelo.

En P. pseudostrobus se identificaron 14 especies fúngicas: Lophodermium australe, Niesslia exilis y Gymnopus androsaceus fueron las más abundantes en hojas adheridas; y Lophodermium australe y Discosia strobilina en las hojas en el suelo.

En P. arizonica se registraron 18 taxones. Esta especie de pino presentó la más alta riqueza, también le correspondieron las frecuencias absolutas más bajas.

Se observaron patrones definidos para las tres especies de pinos (Figura 3). Solo Discosia strobilina y Preussia sp. fueron comunes en los pinos estudiados.

Figura 3 Análisis de conglomerados de la riqueza de hongos de las hojas en las tres especies de pinos. 

La comparación de los resultados obtenidos mediante las dos técnicas empleadas, la cámara húmeda (método directo) resultó más efectiva para la determinación de las especies de hongos. ^{Parungao et al. (2002)} llegaron a conclusiones similares, en su estudio sobre diversidad de hongos en un bosque tropical. El aislamiento en medio de cultivo (método indirecto), aun cuando permitió obtener el doble de los taxones con el método directo, presentó la desventaja de que muchos cultivos no formaron estructuras reproductivas, por eso la lista de especies no identificadas fue grande (50.87 %) Este problema lo discuten ^{Bills y Polishook (1994)} y ^{Polishook et al. (1996)}, quienes consignan entre 37 y 45 % de taxones no identificables. Asimismo, se definieron mejores patrones para cada especie de pino mediante la técnica de la cámara húmeda. Muchos de los taxa registrados por la técnica de la cámara húmeda no se aislaron en medio de cultivo. Un ejemplo de ello fue Desmazierella acicola, muy frecuente en las hojas muertas de Pinus cembroides; la cual, ^{Ponge (1991)} también señaló como un hongo frecuente en hojas muertas de Pinus sylvestris en el suelo. Con ambos taxones se identificaron 13 especies; de ellas, Lophodermium australe fue el hongo más abundante.