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Introducción
Pinus pinceana Gordon, es una especie endémica de México, la cual proporciona una excelente oportunidad para estudiar los efectos de la fragmentación y los patrones genéticos de variación entre sus poblaciones. Se distribuye sobre una distancia superior a 750 km de norte a sur (Favela y Thomas, 2013); su extensión es por encima de 20 000 km2, pero debido a su distribución discontinua y dispersa, el área que ocupa es probablemente menor a 2 000 km2. Se presentan en tres áreas principales: el norte (Coahuila, Zacatecas, Nuevo León), centro (San Luis Potosí) y el sur (Hidalgo y Querétaro); separadas por montañas y grandes extensiones de zonas áridas. P. pinceana no solo se presenta de forma dispersa en las comunidades, si no que de forma fragmentada y aislada por barreras geográficas, lo que se supone dificulta el intercambio genético o conectividad entre sus poblaciones, especialmente, en la parte Norte (Coahuila) en donde se acentúa su aislamiento por grandes extensiones de zonas áridas y se detiene su distribución presentándose las poblaciones más septentrionales.
El aislamiento genético favorece la diferenciación de las poblaciones por efectos de deriva genética, como lo demuestran estudios de diversidad genética de la especie mediante isoenzimas (Ledig et al., 2001; Molina-Freaner et al., 2001) y con microsatélites de ADN de cloroplasto. La disimilitud ambiental entre regiones sugiere la posibilidad de que la selección natural haya ocasionado diferencias entre las poblaciones con características de importancia adaptativa a factores específicos de estrés ambiental (Ledig et al., 2001).
Los bosques de Pinus pinceana están incluidos en el listado de hábitats naturales en peligro que exigen medidas específicas de conservación, clasificada como “LRnt” en la lista roja de la IUCN Red List, que significa en bajo riesgo (IUCN, 2001); además tiene categoría de sujeta a protección en la Norma Oficial Mexicana NOM-059-SEMARNAT-2010 (DOF, 2010), en parte porque sus poblaciones se distribuyen en forma fragmentada, en pequeños rodales y quizá por la falta de estudios sobre su variabilidad genética. Aunado a lo anterior, diversos autores documentan que es vulnerable, dado que en algunas áreas visitadas se presenta poca regeneración natural (Perry, 1991; Villarreal et al., 2009). Asimismo, es importante en la economía de los habitantes de las comunidades cercanas, pues obtienen ingresos por la venta de la semilla comestible (piñón blanco) y la utilizan como fuente de leña y combustible.
Pinus pinceana se ha sido estudiado, previamente, con técnicas moleculares como isoenzimas (Ledig et al., 2001; Ramírez-Herrera 2007). Por lo tanto, en el presente trabajo se utilizan los marcadores de RAPD, para evaluar la variación de sus poblaciones norteñas, inlcuyendo las más septentrionales y exclusivamente las que ocurren en la Sierra Madre Oriental, además se considera, por primera vez, una población recientemente registrada en el estado de Nuevo León. Analizar solo la parte norte de la distribución de las especies dará la oportunidad de conocer, si existe una estructura poblacional, así como evaluar las poblaciones más septentrionales y las más aisladas.
Los marcadores nucleares RAPD se han usado para analizar la variación genética de especies y poblaciones del género Pinus (Newton et al., 2002; Kurt et al., 2011; Cipriano et al., 2013; Kovacevic et al., 2013; Zhang et al., 2013); así como para reconstruir la relación filogenética de algunos taxa (Favela, 2004; Castro-Félix, 2008). La técnica de RAPD no requiere previo conocimiento del genoma por utilizar, tienen, además, la ventaja de ser marcadores multilocus arbitrarios que generan un gran número de marcadores polimórficos por la amplificación o no amplificación de secuencia de ADN dispersos por todo el genoma (Williams et al., 1990; Vos et al., 1995), de los cuales se obtiene información más precisa de la que se infiere basada en un solo gen (Koopman, 2005). No obstante, los resultados de RAPD pueden ser engañosos, por la presencia de contaminantes (hongos), lo cual es crucial para medir la reproducibilidad de los datos.
Otros posibles inconvenientes son la no homología de los fragmentos comigrantes y su naturaleza dominante (ausencia/presencia de bandas). Sin embargo, una exhaustiva búsqueda de literatura demuestra la congruencia general de los datos obtenidos con RAPD con los de microsatélites, a través de una amplia gama de grupos taxonómicos (Nerendrula y Nkongolo, 2012; Zhang et al., 2013; Cichorz et al., 2014; Tomar et al., 2014), esto indica que son aceptables en análisis de variabilidad genética de poblaciones.
Los objetivos del presente estudio fueron: a) documentar cómo la diversidad, diferenciación y distancia genética de RAPD se distribuye en las poblaciones norteñas de Pinus pinceana, incluyendo una población recientemente descubierta en el estado de Nuevo León, b) comparar los datos sobre diversidad genética, previamente, registrados para otras poblaciones de P. pinceana y con otros marcadores moleculares, a fin de analizar el comportamiento de los resultados de la población de Nuevo León; y c) inferir sí existe conectividad entre las poblaciones.
Materiales y Métodos
Material biológico
Se analizaron seis poblaciones que representan la distribución de P. pinceana en el norte de México (Cuadro 1), específicamente, aquéllas que se ubican en los estados de Zacatecas, Coahuila y la recientemente registrada para el estado de Nuevo León (Figura 1) (Favela, 2009). En cada localidad se seleccionaron al azar 30 individuos espaciados entre ellos 10 m, de los cuales se tomaron, manualmente, 10g de hojas maduras, que se almacenaron en bolsas de plástico con 10g de sílica gel.
Figura 1 Distribución geográfica de las poblaciones muestreadas de Pinus pinceana Gordon en la Sierra Madre Oriental.
Cuadro 1 Lista de poblaciones de Pinus pinceana Gordon muestreadas en la Sierra Madre Oriental.
| Localidad | Coordenadas | Altitud(m) | ||
|---|---|---|---|---|
| N | O | |||
| 1 | La Noria, Cuatro Ciénegas, Coahuila | 25°23'08'' | 101°10'03'' | 2 050 |
| 2 | La Palmosa, Cuatro Ciénegas, Coahuila | 25°17'29'' | 101°10'03'' | 2 340 |
| 3 | La Casita, Parras, Coahuila | 25°15'08'' | 101°34'08'' | 2 200 |
| 4 | El Jaralito, Gral. Cepeda, Coahuila | 25°21'42'' | 101°27'76'' | 2 500 |
| 5 | Cañón del Moroso, Santa Catarina, Nuevo León | 25°37'46'' | 100°31'34'' | 1 500 |
| 6 | Las Lajas, Concepción del Oro, Zacatecas | 24°33'35'' | 101°26'25'' | 2 400 |
Extracción de ADN
El ADN se extrajo de 1 g. de hojas secas de los 30 individuos recolectados en cada una de las poblaciones, siguiendo el método de Doyle y Doyle (1990), con adición de acetato de amonio para remover los excesos de carbohidratos (Hollingsworth et al., 1999).
Análisis de RAPD
Para seleccionar los oligos por utilizar en todas las muestras se probaron 15 decanonucleótidos de secuencia arbitraria de las series OPA, OPB, OPC, OPG y OPP de operón para RAPD (Operon RAPD kits technologies, Alameda), para ello se usaron 16 individuos escogidos de los 180 existentes, para finalmente seleccionar seis que mostraron patrones de bandeos claros y reproducibles para llevar a cabo los análisis correspondientes.
Las reacciones de PCR se prepararon en un volumen final de 25 µL, cuya mezcla consistió de los siguientes reactivos: 20 ng de ADN genómico en buffer 1X (Invitrogen 10X) con 2.5 mM MgCl2, 0.2 nM dNTP´s, 0.50 M de primer, 2 % formamida, y 1 Unidad Taq polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Se incluyó un tubo control sin ADN genómico, con todos los componentes de la reacción, para de esta forma descartar la contaminación.
Condiciones de PCR
La amplificación del ADN se hizo con un termociclador programable (Thermo Electron Px2 Thermal Cycler PCR PCYL220 Issue 1, HBPX2110). Las condiciones de reacción para RAPD que se utilizaron fueron: 94 °C (2 min) para la separación inicial de las cadenas de ADN, posteriormente, se agregaron 2 ciclos touchdown en la que la temperatura de alineamiento de la reacción decreció 2 °C cada ciclo; enseguida 41 ciclos de 93 °C (30 seg), 35 °C (1 min), 72 °C (2 min) y 72 °C (5 min) para la extensión final.
Detección y procesamiento de productos de PCR con RAPD
Las amplificaciones se realizaron de forma replicada para cada primer y población, con el protocolo estandarizado. Las muestras de ADN de población se colocaron intercaladas en los geles de agarosa. Los productos amplificados fueron separados en electroforesis de gel de agarosa al 1.8 % en buffer TBE 1x, con una diferencia de potencial constante de 135 voltios, durante 2 horas 30 minutos. Se tiñeron los geles posteriormente, por 15 minutos en buffer SB 1X con bromuro de etidio, y por último, los patrones de bandeo se visualizaron bajo luz UV, donde se fotografiaron en un transiluminador (MultiDoc-It™ Imaging System, UVP®, USA).
Análisis de datos
Con el patrón de bandas obtenido por la separación durante la electroforesis de los diferentes fragmentos amplificados, se construyó una matriz presencia-ausencia, registrándose visualmente como bandas presentes (1), que serían todos los homocigotos dominantes (AA) y heterocigotos (Aa); las bandas ausentes como (0), correspondientes a homocigotos recesivos (aa). Se desarrollaron matrices binarias para cada primer y población, después se utilizaron para estimar la variabilidad genética y estructura de las poblaciones de P. pinceana.
La matriz binaria se analizó con el programa POPGENE v32 (Yeh et al., 1997) para medir la variabilidad genética. Los valores de variación genética para cada población fueron: el índice de diversidad de Shannon (I) (Lewontin, 1972) y el porcentaje de loci polimórfico (P). El análisis estadístico de diversidad genética de Nei (1973) se usó para calcular la diferenciación genética entre poblaciones (Gst).
A partir de la matriz binaria se calculó la distancia genética (Jaccard), para después someterla a un análisis de Coordenadas Principales (PCO) en el programa PAST ver.3 (Hammer et al. 2001), el cual produce una representación visual de la relación genética dentro y entre las poblaciones. Además, se construyó un dendrograma utilizando el método UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic averages) basado en la distancia genética de pares. El análisis de boostrap se hizo con 1 000 repeticiones, ambos análisis fueron realizados utilizando el programa FAMD (Fingerprint Analysis with Missing Data) v1.25 (Schlüter y Harris, 2006).
En el caso de la estructura de la población, se llevó a cabo el análisis de varianza molecular (AMOVA), esto para evaluar la variación entre y dentro de las poblaciones mediante el programa Arlequín (Schneider et al., 2000). Los niveles de significancia para AMOVA son computados por permutaciones no paramétricas del set de datos con 1 000 permutaciones. El programa Arlequin genera un estadísticos-ɸ (Excoffier et al., 1992), el cual es análogo a Fst de Wrigth (Wrigth, 1951). Este método ha sido usado con datos de RAPD (Favela, 2004, 2010).
Resultados
Amplificación con marcadores RAPD
De los 15 primers ensayados, seis produjeron patrones reproducibles de bandas de fácil resolución, los cuales se utilizaron con 180 individuos muestreados. Los seis primers generaron un total de 76 bandas con tamaños que variaron de 1 500 a 250 pb. Se obtuvo un rango de bandas de 10 - 16 por primer.
Análisis de datos
Diversidad genética. El análisis de diversidad genética de las poblaciones empleando POPGENE reveló que la población de Cuatrocienégas, Coahuila presenta mayor diversidad genética, como se muestra en el Cuadro 2, con altos valores de I (I= 0.44 y I = 0.43). El valor más bajo correspondió a la población de Las Lajas, Zacatecas (I= 0.37).
El promedio de loci polimórficos (P) de las poblaciones varió de 77.32 - 84.21 %, la población de La Noria Cuatrocienégas, Coahuila fue la de mayor polimorfismo, y la menos polimórfica la de Las Lajas, Zacatecas (Cuadro 2).
Es importante mencionar que las poblaciones que mantienen los valores de diversidad más altos son las de La Noria y La Palmosa, en Cuatrociénegas, Coahuila, ambas se encuentran en la franja más norteña o septentrional del intervalo de distribución de P. pinceana.
Cuadro 2 Estimadores de diversidad genética para cada una de las seis poblaciones de Pinus pinceana Gordon, en México a partir de RAPD.
| Población | N | Índice de Shannon (I) | Porcentaje de loci polimórfico (P) |
|---|---|---|---|
| La Noria | 30 | 0.44 | 84.21 |
| La Palmosa | 30 | 0.43 | 77.63 |
| La Casita | 30 | 0.39 | 78.95 |
| El Jaralito | 30 | 0.41 | 78.95 |
| Cañón del Moroso | 30 | 0.41 | 81.58 |
| Las Lajas | 30 | 0.37 | 76.32 |
| Total | 180 | 0.48 | 94.74 |
N = Número de individuos utilizados en el análisis de cada población.
Diferenciación genética
El coeficiente total de diferenciación genética (Gst) entre las poblaciones fue de 0.15. Este valor describe cómo la variación es repartida entre las poblaciones estudiadas y se mide entre 0 a 1, en el que más cercano a 0 implica que las poblaciones comparten más genes y cuanto más se acerque a 1, más alejadas están y comparten menos material genético.
Estructura genética de las poblaciones de P. pinceana
El AMOVA indica que (85.18 % de la variación total se registra dentro de las poblaciones (P< 0.001). Y significativamente, 14. 82 % de la variación restante se localiza entre las seis poblaciones de P. pinceana (P< 0.001) (Cuadro 3). Se observó un valor de Fst (0.1482), equivalente al valor de Gst (0.15) citado anteriormente.
Cuadro 3 AMOVA basado en el análisis de marcadores RAPD a partir de seis poblaciones de Pinus pinceana Gordon.
| Fuente de variación | g.l. | Suma de cuadrados | Componentes de la varianza | Porcentaje de variación (%) | P |
|---|---|---|---|---|---|
| Entre poblaciones | 5 | 319.470 | 1.89 | 14.82 | p<0.001 |
| Dentro de poblaciones | 162 | 1 763.25 | 10.88 | 85.18 | p<0.001 |
| Total | 167 | 2 082.72 | 12.77 | ||
| FST = 0.1481 |
a = Niveles de significancia basado en 1 000 interacciones.
Distancia genética
La distancia de Jaccard se usó para realizar un análisis de coordenadas principales, el cual es una representación gráfica de la relación genética entre las seis poblaciones de P. pinceana analizadas. Los primeros dos componentes principales de la distancia de RAPD describen 4.64 y 4.24 % de la variación, respectivamente. Las muestras de los individuos de cada población se representaron como una dispersión continua, con las poblaciones de La Noria, La Palmosa, La Casita y el Jaralito del estado de Coahuila. Las poblaciones provenientes del Cañón del Moroso, Nuevo León y Las Lajas de Zacatecas se distinguen claramente separadas del resto de las poblaciones en un grupo diferente (Figura 2).
Figura 2 Gráfico de coordenadas principales de la distancia genética para seis poblaciones de Pinus pinceana Gordon (coeficiente de similitud de Jaccard).
El dendrograma que se muestra en la Figura 3, que se obtuvo de la matriz de pares de distancia genética mediante el método de agrupamiento de pares no ponderado con la media aritmética reveló que las poblaciones de Coahuila están más cercanas, forman dos clados: el de las poblaciones de Cuatrocienégas (La Noria y La Palmosa) y otro por las poblaciones de Parras y General Cepeda (La Casita y el Jaralito). Igualmente, las poblaciones de Nuevo León (Cañón el Moroso) y la de Zacatecas (Las Lajas) constituyen un clado aparte, las cuales son cercanas genéticamente. Los valores de boostrap para cada población fueron altamente significativas y varían entre 96 y 100.
Discusión
En el presente estudio, los marcadores RAPD usados mostraron ser una técnica rápida y eficiente para el estudio de la genética de poblaciones de P. pinceana, por su alto polimorfismo visualizado en geles de agarosa. A partir de ellos se logró medir la variación genética a través de sus componentes: diversidad, diferenciación y distancia genética.
Diversidad genética entre poblaciones de Pinus pinceana
Estimada mediante el índice de Shannon (I=0.48) sigue un patrón en el que las poblaciones más norteñas tienen los valores mayores de diversidad: La Noria y La Palmosa (0.44 y 0.43), le siguen El Jaralito y Sta. Catarina (0.41), La Casita y Las Lajas (0.39 y 0.37), lo cual permite inferir que la fragmentación pudo iniciar la divergencia entre las poblaciones, lo que generó alguna de ellas nuevos y únicos alelos, como resultado del aislamiento.
Sin embargo, al comparar el índice de Shannon obtenido para todas las poblaciones estudiadas (0.48) no difieren en promedio con otras especies de pinos (0.45) y de otras coníferas y latifoliadas (0.53) (Araucaria, Fitzorya y Cedrela) (Gillies et al., 1997; Allunt et al., 1999; Bekessy et al., 2002).
El porcentaje de loci polimórfico es otro indicador importante para determinar el nivel de variación genética de un área, pues una especie con un valor alto muestra una elevada capacidad de adaptación al medio ambiente y por el contrario una con una capacidad débil de adaptación pudiera ser eliminada por selección natural (Zhang et al., 2013); para P. pinceana fue relativamente alto (79.80 %) en contraste con otras especies de pinos piñoneros como P. culminicola Andresen & Beaman (57.3 %), (Favela, 2010), P. cembroides var. bicolor Little y P. johannis M.-F. Robert con 69.9 y 78.1 %, respectivamente (Favela, 2004). Esto indica que cada población contiene una fracción considerable de la diversidad genética de la especie, con valores superiores que lo documentado para especies endémicas (Hamrick et al., 1992; Hamrick y Godt, 1996).
En general la variación genética, en términos de los diferentes índices de diversidad, muestra un patrón geográfico, pues se observan los valores más altos en las poblaciones de Coahuila; de ellas, las más norteñas, La Noria y La Palmosa de Cuatrociénegas, presentan el valor más alto seguida por las de La Casita y El Jaralito, lo que las separa de las de Nuevo León y Zacatecas, probablemente, debido a que existen barreras geográficas que han favorecido su aislamiento, y a que el flujo de información entre poblaciones está determinado por la distancia geográfica. Sin embargo, no dejan de compartir alelos, quizás porque todas fueron una en su origen y con el tiempo esta población original se fragmentó, hecho que favoreció el inicio de la divergencia de las poblaciones, que a su vez generó, en algunas, nuevos y únicos alelos, pues logra concluir la estructura genética para la especie como una estructura fragmentada en tres parches dado que en su estudio incluye seis poblaciones, cada una las cuales marcan la fragmentación separándolas, en dos por cada parche, del norte, centro y sur de la distribución geográfica.
Diferenciación genética entre poblaciones de Pinus pinceana
Para estimar la proporción de la variación genética dentro y entre las poblaciones se emplea el estadístico (Fst), especialmente, útil para datos dominantes como RAPD (Excoffier, 2001), el cual varía en un intervalo de 0-1, si los valores se acercan a 0, indica que las frecuencias alélicas son iguales en todas la poblaciones, no ha habido diferenciación; y el máximo posible es de 1, cuando cada población está fija en alelos diferentes (Piñero et al., 2008). El valor en las poblaciones estudiadas (0.15) fue comparable con el Fst (0.152) registrado por Ledig et al. (2001), pero más bajo que los estimados por Molina-Freaner (2001) (0.24) y Ramírez-Herrera (2007) (0.16) para Pinus pinceana, mediante Isoenzimas; y para otros taxa de Pinus que se localizan en poblaciones aisladas y dispersas (Hamrick, 2004).
Este valor indica que 15 % de la diversidad genética de la especie corresponde a la existente entre poblaciones, y es muy cercano al estimado para otro pino piñonero, P. rzedowskii Madrigal & M.Caball. (17 %) (Delgado et al., 1999), taxón endémico de México que también se distribuye en poblaciones fragmentadas y aisladas. Es importante mencionar que un Fst superior a 0.10 es considerado como un indicador de una fuerte diferenciación genética interpoblacional, lo cual es poco común en especies alógamas, como es el caso del género Pinus (Hamrick et al., 1992; Ledig, 1998). Solo en algunas coníferas, con una distribución natural restringida o una fuerte fragmentación de sus poblaciones, se han documentado con valores similares de diferenciación genética entre poblaciones (Ledig, 1998).
La mayor parte de la variación en las poblaciones de Pinus pinceana se registró dentro de ellas (85.18 %). Este resultado es similar al consignado para otros pinos (Ledig, 1998; Favela, 2010) y especies de plantas leñosas (Hamrick et al., 1992). Además, son comparables con datos obtenidos a partir de RAPD, en los que la mayoría de las especies examinadas muestran altos niveles de variación genética intrapoblacional (Xue et al., 2006; Favela, 2010). Mientras que el grado de variación genética entre poblaciones fue de 14.82 %. Los altos niveles de diversidad y diferenciación entre poblaciones parece ser común en taxa de coníferas mexicanas. (Ledig et al., 2001; Fazekas y Yeh, 2006; Favela, 2010).
Distancias genéticas y geográficas entre poblaciones de Pinus pinceana
En el gráfico (Figura 2) correspondiente al coeficiente de similitud de Jaccard y sometido al análisis de PC, evidencia una separación de las poblaciones de Nuevo León y Zacatecas de las de Coahuila, lo cual indica que son las más alejadas genéticamente. Dado lo anterior, es posible inferir que existe un mayor flujo genético entre las poblaciones de Coahuila (La Noria, La Palmosa, La casita en Parras y El Jaralito), con respecto a las de Nuevo León (Cañón del Moroso) y Zacatecas (Las Lajas). Estudios previos (Ramírez-Herrera, 2007) muestran, también, separación con las poblaciones de Sierra de Parras y Las Norias, respectivamente.
Hollingsworth y Ennos (2004), argumentan que el agrupamiento de individuos de diferentes poblaciones en el mismo clado en un árbol se interpreta como evidencia del flujo genético entre poblaciones. En el árbol obtenido mediante el método UPGMA se observa eso mismo, ya que se forman dos clados, en el primero se agrupan las poblaciones de Coahuila, dentro del cual se presentan dos subclados uno con las poblaciones de Cuatro Ciénegas; localidades de La Noria y La Palmosa, y otro con las de Parras y Gral. Cepeda; en un solo grupo las localidades de Cañón del Moroso, Sta. Catarina, Nuevo León y las Lajas, Zacatecas. Esto permite inferir que entre las poblaciones de Nuevo León y Zacatecas existe un mayor flujo genético, con respecto a las poblaciones de Coahuila. Lo anterior es un dato importante, pues en estudios anteriores (Ledig, 2001; Ramírez-Herrera, 2007) las poblaciones de Zacatecas se separaban en los grupos de poblaciones norteñas, junto con las de Coahuila.
La variación entre las poblaciones puede deberse a las diferencias ecológicas en cada uno de los dos grupos. El primero corresponde a regiones con menor cantidad de lluvia (350 a 400mm), comparado con las del segundo grupo (400 a 500mm) y, en general, a las regiones climáticas y orográficas que se definen por la Sierra Madre Oriental.
Diversos estudios sobre P. pinceana registran datos similares, en los que separan las poblaciones norteñas (Coahuila) de las del centro y sur de México; y, ahora, con los resultados obtenidos de la población recientemente descrita de Nuevo León (Favela et al., 2009) es evidente como se separa con la de Zacatecas.
En las investigaciones de Ledig et al. (2001), se logra distinguir la formación de dos clados que separan claramente, las poblaciones del norte de las del sur, y en subclados las poblaciones de Las Lajas y de Parras, Coahuila, también incluidas en este estudio. De igual forma Ramírez-Herrera (2007) presenta un gráfico en donde se forman dos clados: uno que separa a las poblaciones del norte y otro con las del centro y sur; en las del norte se observan dos subclados que separan en uno de ellos a la población de Las Norias, población considerada en este estudio; en el otro subclado se integran las de Zacatecas. Finalmente, Villarreal et al., (2009) concluyen que existen dos grupos de piñonares de P. pinceana, con base en sus diferencias florísticas y de distribución: los de la región norte (Coahuila, Zacatecas y San Luis Potosí) y los de la región sur (Querétaro e Hidalgo).
Conclusiones
La variación genética en las poblaciones de Pinus pinceana es alta y tiene concordancia con estudios previos.
El grado de diferenciación genética entre las poblaciones de P. pinceana es baja, pero consistente con valores registrados para otras especies de coníferas. La diferenciación presente sugiere que aun y cuando las poblaciones de P. pinceana son restringidas, aisladas y fragmentadas, el flujo genético entre las poblaciones, por lo menos en la actualidad, no ha conducido a la pérdida dramática de la variación genética y la diferenciación de las poblaciones.
Las medidas de distancia genética entre las poblaciones de Pinus pinceana muestran que las poblaciones de Coahuila tienen un mayor flujo genético entre ellas y que están más alejadas genéticamente de las de Nuevo León y Zacatecas. Esto sugiere la existencia de dos fragmentos (poblaciones de Coahuila y poblaciones de Nuevo León y Zacatecas) y la influencia de alguna barrera fisiográfica en esa parte de la Sierra Madre Oriental.
En general, se concluye que, no obstante que la técnica de RAPD ha sido controversial, es confiable, dado que los resultados y valores obtenidos no se alejan a los previamente registrados con otros marcadores moleculares. Por lo tanto, si bien Pinus pinceana ha sido categorizada como una especie vulnerable y con poblaciones fragmentadas, las analizadas hasta el momento conservan su conectividad genética.
Futuros estudios que incluyan factores bióticos y abióticos que pudieran estar involucrados en patrones de especiación, particularmente, parámetros orográficos y geológicos darán la pauta para entender la influencia de las barreras geográficas sobre la especie. Sería interesante, también, estudiar las interacciones bióticas que pudieran influir en la diversificación de la especie.
