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Introducción
Diferentes especies de agave han mostrado, in vitro e in vivo, actividad antimicrobiana y antifúngica (García et al., 1999; Sánchez et al., 2005; Verástegui et al., 2008; De Rodríguez et al., 2011), antinflamatoria (Peana et al., 1997; García et al., 2000), antioxidante (Singh et al., 2003; Ben Hamissa et al., 2012), molusquicida (Brackenbury y Appleton, 1997; Abdel-Gawad et al.,1999), antidiabética (Andrade-Cetto y Heinrich, 2005) y actividad citotóxica contra algunas líneas de célula cancerígena (Yokosuka y Mimaki, 2009; Man et al., 2010; Podolak et al., 2010; Chen et al., 2011). Estas propiedades son atribuidas a ciertos fitoquímicos como saponinas, sapogeninas, compuestos fenólicos y fructanos. Además de las propiedades benéficas citadas, las saponinas de diferentes plantas son antiparasitarias, antivirales, cicatrizantes de heridas, antioxidantes, antiulcerogénicas, inmunomoderadores, hepatoprotectoras, neuroprotectoras, antimutagénicas, antiespasmódicas, hipolipemiantes y con actividades hipocolesterolémicas (Sparg et al., 2004).
Adicionalmente, la hidrólisis de fructanos podría ser una fuente de oligosacáridos prebióticos (Ávila-Fernández et al., 2011) y monosacáridos como glucosa y fructosa. Debido a que los fructanos son la principal reserva de carbohidratos solubles en agua de los agaves, su contenido representa el principal componente de varias especies (35 % a 70 % base peso seco) y dado que su hidrólisis libera de 80 % a 86 % de fructosa y de 10 % a 15 % de glucosa, son usados para la producción de jarabes, la cual es una de las aplicaciones más recientes de estas plantas (Escamilla-Treviño, 2012).
A pesar de que las hojas frescas representan alrededor de 25 % de la planta (base húmeda), ese material no se utiliza (Iñiguez-Covarrubias et al., 2001), ya que su contenido de azúcares no estructurales es inferior, comparado con la parte central del individuo, conocida tradicionalmente como cabeza o piña; sin embargo, es factible usar las hojas para la extracción de fibras, papel o la producción de biocombustibles, como el etanol (Idarraga et al., 1999; Narváez-Zapata y Sánchez-Teyer, 2009; De Paula et al., 2012).
La lechuguilla (Agave lechuguilla Torr., Asparagaceae) (Tropicos, 2017) es un recurso forestal no maderable, es un taxa nativo de las zonas áridas y semiáridas del sur de los Estados Unidos de América y del noreste de México (Castillo et al., 2011). Su área de distribución nacional cubre una superficie aproximada de 20 millones de hectáreas, comprende los estados de Coahuila, Chihuahua, Nuevo León, Durango, San Luis Potosí, Tamaulipas y Zacatecas (Castillo et al., 2011).
A. lechuguilla aporta importantes beneficios socioeconómicos a los pobladores del área rural, ya que la extracción de su fibra ha constituido una actividad de subsistencia familiar por más de 70 años y representa empleos directos (Castillo et al., 2013); además de, las ventajas que significa la comercialización de la materia prima que de ella se obtiene (Castillo et al., 2011), cuya transformación origina diversos productos, como cepillos para uso industrial y doméstico, entre otros; su mercado fundamental es el internacional, de tal manera que 93 % de su producción se exporta, principalmente a los Estados Unidos de América, los Países Bajos, Suiza y Honduras (Castillo et al., 2011), naciones donde México es el único exportador.
Tradicionalmente, la fibra de lechuguilla se obtiene del cogollo, al cual lo integran las hojas más tiernas de la planta, agrupadas en su porción central (Castillo et al., 2005; Narcia et al., 2012); esta fibra tiene menor lignificación, en comparación con la de las hojas laterales. En la actualidad, su aprovechamiento en el campo está relacionado con altos índices de marginación, por ello es necesario buscar nuevas alternativas a la extracción de fibra, como la obtención de productos químicos con valor agregado y que sería una oportunidad de mejoramiento de la calidad de vida de los pobladores de las zonas áridas y semiáridas, donde se desarrolla esta especie.
Dada la escasa información sobre su aprovechamiento para aplicaciones biotecnológicas (Hernández et al., 2005; Almaraz-Abarca et al., 2013), el objetivo de la presente investigación fue evaluar las propiedades químicas, estructurales y funcionales de la biomasa de Agave lechuguilla que permitan determinar su potencial para la extracción de antioxidantes, como productos químicos de alto valor agregado.
Material y Métodos
Recolección de la materia prima y preparación de muestras
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-008-SEMARNAT-1996 que limita el aprovechamiento del cogollo de Agave lechuguilla Torr., la recolección de las muestras de las poblaciones naturales se llevó a cabo durante el mes de marzo en el ejido Paredón del municipio Ramos Arizpe, Coahuila, México (25°55'47" N 101°55'47" O), ubicado a una altitud de 728 m, con 33 °C de temperatura media anual, y 269 mm de precipitación media anual. Su clima corresponde a muy seco o árido, con invierno fresco ( García, 1973), su tipo de vegetación es un matorral desértico rosetófilo (Marroquín et al., 1981).
Las muestras recolectadas se lavaron con agua de grifo para eliminar tierra e impurezas. Una vez secas, se recortaron manualmente a una dimensión de aproximadamente 1- 2 cm2, y colocaron en un horno de convección Koleff-KL10 hasta alcanzar una humedad <10 % (p/p). Las muestras deshidratadas fueron molidas en un molino de corte Retsch-SM100 a un tamaño de partícula promedio de 2 mm. La muestra obtenida se homogenizó y almacenó en contenedores de plástico, a temperatura ambiente.
Determinación de la composición química
La determinación de extractivos se realizó de acuerdo a Sluiter et al. (2008), con agua ultrapura y etanol absoluto como disolventes en dos etapas secuenciales. La de celulosa, hemicelulosa y lignina se hizo con base en los procedimientos del Laboratorio Nacional de Energías Renovables (Sluiter et al., 2012), con una modificación (Mussatto et al., 2011): 500 mg del material se hidrolizó con H2SO4 al 72 % (p/p), durante 7 minutos a 50 °C. Subsecuentemente, el hidrolizado se diluyó a 4 % (p/p) con agua destilada. Una segunda hidrólisis se efectuó autoclavando la mezcla de reacción, a 121 °C durante 1 h; la solución resultante se filtró a través de filtros de 0.2-µm, y la fracción líquida fue analizada por HPLC para la determinación de glucosa (celulosa), arabinosa, manosa, galactosa y xilosa (hemicelulosa), de acuerdo a Mussatto y Roberto (2006).
El contenido de lignina ácido soluble (libre de cenizas), se calculó según lo descrito por Mussatto y Roberto (2006). La fracción sólida recuperada después de la filtración se considera lignina ácido insoluble. El valor de lignina total se obtuvo de la suma de lignina insoluble y soluble.
El contenido de cenizas se estimó por incineración de las muestras a 550 °C, durante 4 h (Horwitz y Latimer, 2005).
Potencial antioxidante
Los extractos de A. lechuguilla (licores) se obtuvieron utilizando 2 gramos (base seca) de muestra con 40 mL de cada disolvente: 1) metanol, 2) etanol y 3) acetona al 60 % (v/v) para los tres casos. Cada tratamiento se llevó a cabo a un intervalo de temperatura de 60 a 65 °C, durante 90 min con agitación magnética. El control, consistió en la misma cantidad de muestra sometida a tratamiento con 40 mL de NaOH al 2 %, en una autoclave a 120 °C por 90 min. Después de este tiempo, los cuatro extractos se separaron por centrifugación a 2 500 rpm durante 20 min y fueron filtrados a través de filtros de 0.22 μm.
La capacidad antioxidante de los extractos se determinó por dos métodos espectrofotométricos: el ensayo de radical libre estable (DPPH) y el ensayo de poder reductor (FRAP), fueron adaptados para una microplaca de 96 orificios (Martins et al., 2012). La capacidad antioxidante total (CAT) se evaluó mediante el método descrito por Prieto et al. (1999).
Caracterización estructural
Los espectros FTIR se registraron con el espectrómetro FTIR (Agilent, Cary 630, EE.UU.); los FTIR en el modo de banda de absorción en el intervalo de 650-4 000 cm-1, con una resolución de 4 cm-1 y 32 exploraciones. Consecutivamente, los espectros FTIR resultantes se analizaron, normalizaron y se representaron en el software Origin (OriginLab®, 2016).
Morfología superficial
Las partículas de A. lechuguilla se observaron mediante microscopía electrónica de barrido (MEB), con un microscopio con cañón de emisión de campo de fuente de electrones de ultra alta resolución (Nova 200 Nano SEM, FEI Company). Previo a los análisis, las muestras se cubrieron con una película delgada (35 nm) de Au-Pd (80-20 % en peso). Las imágenes se obtuvieron aplicando una tensión de aceleración de 10 kV, con aumentos de 200 y 2 000.
Resultados y Discusión
Grupos Químicos y Disposición de Vinculación de los Componentes
Los análisis FTIR confirmaron que los cogollos de A. lechuguilla tienen bandas de absorción típicas de materiales lignocelulósicos; aunque sus magnitudes difieren (Adel et al., 2010).
Dada su naturaleza compleja, sus espectros FTIR suelen estar separados en dos secciones principales; -OH y -CH que se extienden en la región de 3 800-2 700 cm-1, y la región de huella digital que se asigna a las vibraciones de estiramiento de diferentes grupos de componentes de estos materiales lignocelulósicos a 1 800-800 cm-1 (Poletto et al., 2012).
El pico amplio entre 3400 cm-1 se relaciona con el grupo hidroxilo de la vibración de estiramiento de O-H. Las señales entre 2 920 cm-1 y 2 850 cm-1 se observan, comúnmente, en muestras de biomasa lignocelulósica y corresponden a grupos metil y metileno (-CH3 y -CH4), respectivamente; sin embargo, para muestras A. lechuguilla esas señales aparecieron en 2 914 cm-1, lo cual es atribuible al mayor contenido extractivo de esta materia prima, ya que algunos compuestos en extractivos orgánicos, como ésteres metílicos de ácidos grasos y ésteres metílicos de ácido fenólico, contienen grupos metil y metileno (Poletto et al., 2012).
Las señales registradas en 1 735 cm-1, 1 375 cm-1, 1 240 cm-1, 1 165 cm-1 y 1 060 cm-1 son características del estiramiento y torsión de diferentes grupos de carbohidratos. Para las bandas de A. lechuguilla atribuibles al estiramiento simétrico y asimétrico del C-O-C en enlaces glucosídicos, se presentaron a 1 100 cm-1 y 1 095 cm-1 y corresponden a los enlaces β-1,4-glicosídicos que unen unidades de la glucosa en celulosa y hemicelulosa (Figura 1).
Morfología superficial
Las imágenes obtenidas por microscopía electrónica de barrido revelaron una estructura rígida en A. lechuguilla (Figura 2). Las pequeñas fracturas observadas pueden atribuirse al proceso de la molienda (Figura 2a), y las pequeñas formas cristalinas (Figura 2b) serían pequeños cristales de oxalato de calcio, comúnmente, presentes en este tipo de biomasa (Pérez-Pimienta et al., 2016).
Composición química
Después de la eliminación de los compuestos extractivos, el material perdió 45.34 % de su peso original, que corresponde a componentes no estructurales como la sacarosa, nitrato/nitritos, proteína, ceniza, clorofila y compuestos grasos propios de la planta (Sluiter et al., 2012).
La humedad relativa del material, posterior al proceso de secado, fue de 4.33 %. La fracción de celulosa se calculó con base en la glucosa detectada por HPLC (0.55 g L-1), la hemicelulosa se determinó a partir de la concentración de xilosa (0.22 g L-1), galactosa (0.18 g L-1), arabinosa (0.068 g L-1) y manosa (0.08 g L-1). El contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina total (base seca) en las muestras fueron de 17.72 %, 17.15 y 7.32 %, respectivamente (Cuadro 1).
Potencial antioxidante
El potencial antioxidante de A. lechuguilla se evaluó utilizando tres de los métodos más comunes de ensayo (DPPH, FRAP y CAT). El DPPH ha sido ampliamente utilizado como un parámetro rápido, confiable y reproducible para medir la capacidad antioxidante in vitro de compuestos puros, así como extractos de plantas (Burda y Oleszek, 2001; Ara y Nur, 2009). Los resultados del ensayo DPPH se presentan en la Figura 3; los valores se proporcionan en términos de % de inhibición por DPPH. Se evidencia que los tratamientos con soluciones de metanol, etanol y acetona fueron del orden de 89.47 %, 90.09 % y 89.75 %, respectivamente; mientras que, el licor proveniente del tratamiento con NaOH tuvo un valor de DPPH bajo (32.148 %) (Figura 3).
Figura 3 Porcentaje de inhibición por reactivo DPPH de diferentes extractos de Agave lechuguilla Torr.
Los resultados obtenidos expresados en mM Fe(II) g-1 biomasa (base seca) fueron de 0.51, 0.51, 1.6 y 0.46, respectivamente, para los extractos obtenidos mediante los tratamientos con metanol, etanol, acetona y NaOH respectivamente.
A pesar de que las soluciones que se utilizaron en los tratamientos son mezclas binarias agua-solvente, no todas presentan las mismas características fisicoquímicas, ya que la polaridad propia de cada solvente (o mezcla de ellos) tiene una relación directa con la cantidad y calidad de compuestos antioxidantes que pueden ser extraídos por el mismo (Aliyu et al., 2012). El orden de jerarquía en cuanto a polaridad para este trabajo es Acetona> Metanol>Etanol. Lo anterior se relaciona con la concentración de antioxidantes detectada por el método FRAP en los licores resultantes de las extracciones con solventes, ya que la concentración mayor resultó con el método con acetona (1.60 mM Fe(II) g-1 de biomasa), y los valores de los licores obtenidos con metanol y etanol fueron de 0.51 mM Fe(II) g-1 de biomasa, ambos presentan una polaridad muy similar. Por último, el valor de 0.46 mM Fe(II) g-1 de biomasa en el tratamiento con NaOH, responde, no obstante, a no usar ningún solvente para su extracción, la interacción de la temperatura utilizada y el agua presente en la solución lograron extraer una fracción de compuestos antioxidantes.
Figura 4 Capacidad antioxidante de diferentes extractos de Agave lechuguilla Torr. detectados por el método FRAP.
En la Figura 5 se muestra los resultados de la capacidad antioxidante total medida por el método del fosfomolibdeno, el cual se basa en la reducción de Mo (IV) a Mo (V) por el extracto, con la subsecuente formación del complejo fostato verdoso/Mo (V) a pH ácido. Dicho modelo evalúa tanto la capacidad antioxidante de compuestos hidrosolubles como liposolubles, de ahí su nombre de capacidad antioxidante total (Aliyu et al., 2012). Los registros indican que existe una relación entre el método de extracción y el solvente utilizado en la concentración de agentes antioxidantes en el licor resultante; es decir, que la extracción por el método con acetona concentró 1.75 mg de compuestos antioxidantes equivalentes a la α-tocoferol, capaces de reducir el compuesto oxidante en la matriz de reacción.
Figura 5 Capacidad antioxidante de diferentes extractos de Agave lechuguilla Torr. detectados por el método Antioxidante Total.
Cada uno de los métodos aplicados evalúa el potencial antioxidante de una muestra biológica de diferentes maneras, y cada uno de ellos se basa en diversas reacciones. A pesar de que el ensayo de DPPH mostró poca diferencia en las tres diferentes extracciones, existe una correlación entre los resultados de la capacidad antioxidante total y los ensayos de FRAP, en los que el extracto de acetona registró valores más altos comparados con los extractos de metanol y etanol. Esto significaría que, en las mismas condiciones, los compuestos antioxidantes de A. lechuguilla detectados tienen más afinidad con la acetona. Además, las condiciones de temperatura de las extracciones fueron favorables para la acetona, cuyo punto de ebullición es más bajo que el del metanol y el etanol; de tal manera que se generan mayores presiones de vapor en los recipientes, lo que conduce a mayores tasas de extracción gas-sólido.
El tratamiento con NaOH presentó, en general, valores de capacidad antioxidante más bajos, que el resto de las muestras. La diferencia para las muestras tratadas con solventes y la muestra con NaOH es atribuible a que el tiempo de operación fue superior, ya que en la literatura se cita que la extracción de este tipo de compuestos depende no solo la temperatura, si no del tiempo de contacto de las muestras herbáceas con el solvente (Ben Hamissa et al., 2012); pese que para el tratamiento con NaOH, la temperatura y el tiempo de operación total del proceso fue mayor que los tratamientos con solventes, las reacciones en las que participan los antioxidantes extraídos de plantas son dependientes del pH, ya que el transporte de electrones está limitado en un ambiente saturado de -OH; es decir, altamente oxidado, el cual tiende a degradar los compuestos fenólicos y a generar sustancias altamente oxidantes, debido a la deslignificación; es por ello que el licor resultante tendrá una capacidad antioxidante menor (Yokoyama et al., 2007; Aliakbarian et al., 2009).
Conclusiones
La biomasa de A. lechuguilla presenta una composición característica de materiales herbáceos, los cuales contienen una menor cantidad de carbohidratos estructurales en comparación con muestras maderables. La biomasa contiene una cantidad de compuestos extractivos importante (>45 %), lo cual resulta de que la lechuguilla crece en condiciones áridas y de poca precipitación; por lo tanto, requiere de mecanismos de preservación en los que intervienen, de alguna manera, materiales como los compuestos antioxidantes o las grasas. Los licores resultantes de las extracciones con solventes presentan una cantidad considerable de compuestos antioxidantes, contenidos precisamente en la fracción de extractivos, lo cual abre nuevas posibilidades de estudio para este recurso forestal no maderable.
A pesar de que el tratamiento alcalino disminuye la capacidad antioxidante en los licores, este proceso de extracción de compuestos de alto valor agregado se puede acoplar al sistema de producción de biocombustibles como etanol de segunda generación (2G) y ajustarse a un modelo de biorrefinería. Sin embargo, para su aplicación se requieren de estudios más detallados y una evaluación de factibilidad técnico-económica.
