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La micorriza es la asociación simbiótica que existe entre las raíces de una planta y miembros del reino Fungi, mediante la cual se lleva un intercambio de nutrientes minerales y carbohidratos derivados de la fotosíntesis (Brundrett et al., 1996). En esta interacción ecológica, el micelio del hongo, mediante su red extensa de hifas contribuye en la función de la raíz para aprovechar y asimilar eficientemente los nutrimentos minerales del suelo (Alarcón y Ferrera, 2000).
Existen varios tipos, entre ellos, la ectomicorriza se presenta, principalmente, en especies de coníferas y algunas latifoliadas como los encinos (Landis y Amaranthus, 2009; García et al., 2012). Su existencia mejora los sistemas radicales, en particular las raíces finas, donde se lleva a cabo la mayor absorción de nutrientes (Simard et al., 2002). Lo anterior se correlaciona con la supervivencia y el crecimiento de las plantas durante los primeros años, después de su establecimiento en campo, sobre todo en sitios degradados (Ortega et al., 2004; Menkis et al., 2007).
En los últimos años, la inoculación inducida de hongos para la formación de ectomicorrizas es una práctica que se ha implementado en la producción de planta en viveros forestales (Rodríguez, 2008); incluso, la existencia de ectomicorrizas es un criterio para evaluar la calidad de planta destinada a los programas de reforestación (SE, 2014). Sin embargo, esta actividad genera un esfuerzo y costos adicionales durante la producción (Menkis et al., 2005); por ello, es necesario definir los taxa fúngicos con mayor capacidad de colonización, así como las dosis óptimas de inoculación y los métodos de aplicación más eficientes.
Los hongos del género Russula forman ectomicorrizas, de manera natural, en los bosques de pino-encino (Matabuena, 2005). En el estado de Durango, Russula spp. se desarrolla en las mismas áreas de distribución de Pinus engelmannii Carr., el cual es un taxon de importancia comercial y muy reproducido en vivero para los programas de reforestación (Bustamante et al., 2012; Sigala et al., 2015). Los objetivos del estudio que se documenta fueron determinar el efecto de la inoculación inducida con Russula delica Fr. sobre la calidad morfológica de la planta de Pinus engelmannii, y definir si es posible establecer una asociación entre ambas especies en condiciones de vivero para, en su caso, determinar la dosis y método de aplicación que promueva una mejor micorrización.
Recolecta y preparación del material fúngico
Los esporomas de Russula delica se obtuvieron de un bosque de pino-encino del municipio Pueblo Nuevo, Durango, sobre las coordenadas 23°44.89' N y 105°32.27' O y una altitud de 2 836 m. El material fue transportado en hieleras al vivero forestal del Campo Experimental Valle del Guadiana del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), localizado en Durango, Dgo. (23°44.39' N - 104°37.42' O, altitud de 1 879 m). El material se limpió, diseccionó en trozos de tamaño homogéneo y se colocó en un deshidratador solar a una temperatura de 35 °C, hasta alcanzar una consistencia crujiente. A continuación, se molió en un molino eléctrico Thomas Model 4 Wiley ® Mill para forraje y se pasó por un tamiz de 1 mm para uniformizar la granulometría.
La presencia de esporas, se verificó en una suspensión preparada con 0.1 g de los esporomas molidos en Polisorbato 80 al 0.1 %, se agitó con ayuda de un bortex, durante un minuto y se hicieron observaciones en microscopio óptico American Optical ® One Ten Micro Star (40x). El número de esporas se contabilizó en una cámara de Neubauer. La cantidad promedio fue de 162 x 106 esporas por gramo.
Producción de planta
Se llevó a cabo en el vivero forestal del Campo Experimental Valle del Guadiana (INIFAP). La mezcla de sustrato utilizada consistió en 50 % de turba, 40 % de corteza de pino compostada y 10 % de perlita expandida; y se agregó fertilizante de liberación controlada (8 meses de liberación, 18-6-12 N-P-K + microelementos), en una proporción de 4 kg m-3 de sustrato, la cual es una dosis, generalmente, usada para la producción de Pinus engelmannii en los viveros forestales del estado de Durango. Los contenedores fueron charolas de poliestireno de 77 cavidades (162 mL por cavidad), mismas que se desinfectaron con una solución de cloro al 10 % e impregnaron con sulfato de cobre (4 kg por 100 L de agua).
La siembra se realizó en octubre de 2013; previamente, la semilla fuere mojada en agua durante 24 horas y desinfectada con cloro al 10 % por 15 minutos. Una vez establecida la germinación, se aplicaron riegos cada tercer día. Asimismo, se aplicaron fertilizantes hidrosolubles dos veces por semana a razón de 1 g L-1 de agua, de acuerdo a las prácticas convencionales para la producción de planta de pino. En los tres primeros meses se suministró la fórmula 7-40-19 (N-P-K), en los siguientes seis meses se adicionó la fórmula 20-10-20 (N-P-K) y en los últimos tres meses 4-25-35 (N-P-K).
Tratamientos y diseño experimental
Se evaluaron dos métodos de aplicación (en sustrato y en riego) y cuatro dosis de inoculante (0, 0.75, 1.50 y 2.25 g por charola) (Cuadro 1). La dosis baja se estimó con base en la inoculación de 100 000 plantas con 1 kg de material inoculante, a partir de esto se calcularon las dosis media y alta, duplicándola y triplicándola, respectivamente. El diseño experimental fue al azar, con un arreglo factorial de los tratamientos 2 x 4 (dos métodos de aplicación y cuatro dosis). Por cada tratamiento se hicieron cuatro repeticiones, cada una de ellas correspondió a una charola con 77 plantas.
Variables de respuesta y análisis estadístico
A los 12 meses (358 días) después de la siembra, se realizó un muestreo destructivo en el que se extrajeron cuatro plantas seleccionadas al azar, en cada repetición, para evaluar las variables morfológicas: diámetro del cuello de la raíz (mm), biomasa seca de la raíz (g) y el índice de calidad de Dickson (ICD) (Dickson et al., 1960). Además, se calculó el porcentaje de micorrización en la raíz, mediante el método de Grand y Harvey (Carrera y López, 2004) que consiste en determinar la relación del número de raíces con micorrizas entre el número total de raíces, multiplicado por 100.
Los datos se sometieron a un análisis de varianza, previa comprobación de los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas. El modelo estadístico fue el siguiente:
Donde:
Yij = Variable de respuesta
μ = Efecto medio general
τ i = Efecto atribuido al i-ésimo método de aplicación
η j = Efecto atribuido a la j-ésima dosis de inoculante t
τη ij = Interacción entre el método de aplicación y dosis de inoculante
ε ij = Término de error aleatorio
En el caso de las variables que tuvieron diferencias significativas a una probabilidad de 95 %, se efectuó una comparación múltiple de medias con prueba de Tukey. El análisis estadístico se realizó con el procedimiento GLM de SAS versión 9.3 (2009).
El análisis de varianza evidenció diferencias significativas (p<0.05) entre los métodos de aplicación y entre dosis de inoculante para todas las variables morfológicas evaluadas. El porcentaje de micorrización presentó diferencias altamente significativas (p<0.0001) entre los métodos de aplicación, las dosis y sus interacciones (Cuadro 2).
Cuadro 2 Valores de p de los análisis de varianza para el efecto de la inoculación sobre la variables de calidad de planta de Pinus engelmannii Carr. en vivero.
BSR=Biomasa seca de raíz; ICD = Índice de Calidad de Dickson; PM = Porcentaje de micorrización.
Las variables morfológicas de calidad de planta, diámetro al cuello de la raíz, biomasa seca de la raíz e índice de calidad de Dickson (ICD) registraron promedios mayores con la aplicación en riego; no obstante su respuesta difirió, debido a las dosis del inoculante. El diámetro del cuello de la raíz fue mayor en el testigo, con diferencias significativas en comparación con la dosis alta; en cambio, para la biomasa anhidra de la raíz e ICD, el tratamiento con mejores resultados fue la dosis baja, con diferencias significativas sobre las media y alta, así como con el testigo (Cuadro 3).
Cuadro 3 Valores de p de los análisis de varianza para el efecto de la inoculación con Russula delica Fr. sobre la variables de calidad de planta de Pinus engelmannii Carr.
BSR = Biomasa seca de raíz; ICD = Índice de Calidad de Dickson. Letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas entre niveles de cada factor, mediante, la prueba de Tukey (p<0.05).
En todos los tratamientos, se obtuvieron promedios de diámetro mayores de 6.0 mm; valores que representan un buen indicador de calidad de planta, ya que, de acuerdo con lo recomendado por Prieto et al. (2009), las plantas con diámetro superior a 5 mm son más resistentes al doblamiento y toleran mejor los daños por plagas y fauna nociva; además, el diámetro define la robustez del tallo y se relaciona directamente con el vigor y supervivencia de las plantas en campo.
El porcentaje de micorrización más alto se observó cuando se inoculó el sustrato, con diferencias altamente significativas sobre el riego. Esta variable se incrementó a medida que aumentó la dosis del inoculante, con altas diferencias sobre el testigo. También, se evidenció un efecto significativo de la interacción entre el método de aplicación y la dosis del inoculante, lo cual indica que la respuesta inducida por la dosis de inoculante dependerá de cómo se suministre. En la Figura 1 se aprecia que para el riego, cuyos valores de micorrización varían de 6.1 a 7.9 %, la dosis de inoculante no presenta diferencias significativas; sin embargo, para el sustrato, los porcentajes (30.1 a 40.8 %) variaron significativamente en función de la dosis utilizada.
Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos, determinadas mediante la prueba de Tukey (p<0.05).
Figura 1 Porcentaje de micorrización en plantas de Pinus engelmannii Carr. en respuesta a la inoculación inducida con Russula delica Fr.
Los resultados mostraron una tendencia a disminuir la calidad de planta a medida que se aumentaron las dosis de inoculante, principalmente el diámetro al cuello de la raíz. En contraparte, Montes et al. (2001) en un estudio similar citan mayor diámetro en plantas de P. engelmannii inoculadas con Glomus intraradices N. C. Schenck & G. S. Sm., hongo que forma micorriza arbuscular, en comparación con aquellas que no fueron inoculadas; sin embargo, Chilvers et al. (1987) consideran que las ectomicorrizas tienen mejor capacidad que las arbusculares para efectuar inoculaciones secundarias debido a su propagación por hifas a través de las raíces.
Por otra parte, la biomasa de la raíz se incrementó cuando se inoculó con una dosis baja, en comparación con el testigo, lo cual se atribuye a que la micorriza modifica la raíz e incrementa el peso seco (Hernández y Salas, 2009), lo que se considera un buen indicador, ya que las plantas con más biomasa de la raíz tienen mayor supervivencia en campo (Davis y Jacobs, 2005). En cambio, cuando se emplearon las dosis media y alta fue menor e incluso no presentaron diferencias significativas sobre el testigo; resultados que coinciden con lo señalado por Chávez et al. (2009), quienes inocularon Pinus radiata D. Don con Rhizopogon luteolus Fr. & Nordholm, Suillus bellinii (Inzenga) Watling y Suillus luteus L. (Fries) Gray, en dosis de hasta 1 x 107 esporas por planta, y registraron diferencias no significativas para la biomasa de la raíz. Los mismos efectos consignan para el ICD, y una mejor calidad de planta con dosis bajas de inoculante. Lo anterior se relaciona con el hecho de que las variables de materia seca son las más fuertemente correlacionadas con el ICD (Bionotto et al., 2010). Lo anterior indica que la inoculación con dosis altas no siempre resulta en un buen desarrollo de la planta, y puede limitar su crecimiento. Al respecto, los valores bajos en plantas micorrizadas podría atribuirse a las altas demandas de carbohidratos de los hongos (Dosskey et al., 1991). El mismo comportamiento ha sido documentado en diferentes especies de coníferas (Rincón et al., 2005; Menkis et al., 2010), en las cuales se ha observado una disminución de las tasas de crecimiento en plantas con abundantes micorrizas. García et al. (2010) al inocular Eucalyptus urophylla S. T. Blake con Glomus intraradices y Pisolithus tinctorius (Pers.) Coker & Couch señalan ICD superiores en planta sin micorrizas.
No obstante, en este estudio es importante hacer notar que existe una diferencia entre el uso de inoculante y su omisión. Se prueba que una dosis baja puede ser recomendable para estimular la formación de micorrizas y mejorar la condición de la planta para su establecimiento en campo. Varios autores han demostrado que las plantas micorrizadas tienen mayor probabilidad de supervivencia en los sitios de plantación, debido a que se incrementa la disponibilidad de nutrientes (Menkis et al., 2011), y el estatus hídrico en las plantas mejora (Ortega et al., 2004); aunque, la eficiencia de la ectomicorriza dependerá, también, de las características físicas y químicas de los suelos (Teste et al., 2004).
Finalmente, se observó una diferencia alta entre los métodos de aplicación sobre la formación de micorrizas; si bien, la inoculación mediante el riego generó indicadores de calidad de planta superiores, el método en la mezcla de sustratos es una opción apropiada para hacer más eficiente la inoculación, aun con dosis más bajas, lo que incide en un ahorro en el uso del inoculante. Con base en lo anterior, las nuevas investigaciones se deberán enfocar a definir las mejores prácticas culturales, como el uso de sustratos, envases, rutinas de fertilización y riegos que propicien la colonización eficiente de hongos ectomicorrízicos, así como a evaluar el desempeño de las plantas micorrizadas en los sitios de plantación.
Se determinó un efecto significativo del método de aplicación y la dosis de inoculante de Russula delica sobre la calidad de planta de Pinus engelmannii en condiciones de vivero. La adición a través del riego con una dosis baja (0.75 g por charola) propicia una mejor calidad morfológica de la planta. El porcentaje de micorrización más alto se obtiene con la inoculación en sustrato, lo que sugiere la posibilidad de probar dosis más bajas que garanticen la colonización de los hongos ectomicorrízicos.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Contribuciones por autor
Laura Elena Martínez Nevárez: establecimiento y manejo del ensayo en vivero, toma de datos, análisis y redacción del manuscrito; Homero Sarmiento López: definición del diseño experimental y tratamientos; José Ángel Sigala Rodríguez: análisis de datos, elaboración de gráficas y cuadros y documentación bibliográfica; Sergio Rosales Mata: recolección y beneficio de hongos y establecimiento del ensayo en vivero; José Bernardo Montoya Ayón: revisión del manuscrito.
