Artículos

 

Micropropagación de Epithelantha micromeris (Engelm.) F.A.C. Weber ex Britt. & Rose cactácea ornamental y recurso fitogenético del desierto chihuahuense

 

Micropropagation of Epithelantha micromeris (Engelm.) F. A. C. Weber ex Britt. & Rose, Ornamental cactus and phytogenetic resource of the chihuahuan desert

 

Eulalia Edith Villavicencio Gutiérrez¹, Areli González Cortés² y Miguel Agustín Carranza Pérez³

 

¹ Campo Experimental Saltillo. CIRNE-INIFAP. Correo-e: villavicencio.edith@inifap.gob.mx

² Centro de Capacitación de Tecnología de Granos y Semillas. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro.

³ Departamento de Botánica. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro.

 

Fecha de recepción: 16 de abril de 2012;
Fecha de aceptación: 7 de octubre de 2012

 

RESUMEN

Se desarrolló un protocolo para la micropropagación de Epithelantha micromeris, cactácea en estatus de riesgo, que comprende cuatro etapas: establecimiento, multiplicación, enraizamiento y aclimatación, a fin de obtener plantas con tamaño uniforme en cantidad suficiente y con buena calidad fitosanitaria. El método de propagación presentado es eficiente respecto al tradicional y constituye una nueva tecnología de producción cuya aplicación es factible en el sistema-producto ornamental, bajo el esquema de laboratorio-invernadero. Las semillas de E. micromeris son quiescentes y pueden establecerse in vitro en el medio MS a 50%, en el cual registra un PG máximo de 60%, que supera a su homólogo adicionado con fitohormonas (AG₃); esto significa que el taxón no requiere promotores para germinar. La inducción de brotes se logró mediante segmentos de epicotilo, como explantes, en medio de cultivo MS con diferentes tratamientos. Se determinó que el tipo y la concentración de fitohormona influyen en la tasa de multiplicación, pues se formaron hasta 15 brotes por explante; la cinetina (KIN) en interacción 10:1 con AIB en baja concentración es la promotora de ese efecto. Durante el enraizamiento in vitro se observó que la aplicación de 1.5 x 106 UFC mL^-1 de Azospirillum brasilense tiene un efecto positivo en el proceso rizogénico: se originaron hasta nueve raíces por planta, con 2.3 cm de longitud. A partir de esta metodología es posible regenerar especies en estatus de riesgo de importancia ecológica para el Desierto Chihuahuense y optimizar los procesos biológicos para la producción de plantas de ornato.

Palabras clave: Azospirillum brasilense, cinetina, Epithelantha micromeris (Engelm.) F.A.C. Weber ex Britt. & Rose, fitohormonas, medio Murashige y Skoog, micropropagación.

 

ABSTRACT

A protocol which comprises four stages was made for the micropropagation of Epithelantha micromeris, a cactus in risk status, in order to obtain a good number of plants in a healthy phytosanitary condition, with uniform size to attain a successful acclimatization. The proposed propagation method is efficient compared to the traditional one. It is a new production technology which is feasible to apply in the ornamental product-system, under the scheme of laboratory-greenhouse. The seeds of this species are quiescent and can be established in vitro on a 50% MS medium in which it can get a maximum of 60% PG, which surpasses its counterpart supplemented with phytohormones (GA₃); this means that the species does not need promoters for germination. The induction of shoots was obtained from epicotyl segments as explants in MS medium with different treatments. It was determined that the type and concentration of phytohormone has an influence upon the multiplication rate, generating up to 15 shoots per explant; kinetin (KIN) in interaction with AIB 10:1 in low concentration is the promoter of this effect. During the in vitro rooting it was observed that the application of 1.5 x 106 CFU ml^-1 of Azospirillum brasilense has a positive effect on the rhizogenic process, generating up to 9 roots 2.3 cm long by plant. This methodology regenerates species in risk status of ecological importance for the Chihuahuan Desert and improves biological processes for the production of ornamental plants.

Key words: Azospirillum brasilense, kinetine, Epithelantha micromeris (Engelm.) F. A. C. Weber ex Britt. & Rose, phytohormones, Murashige and Skoog medium, micropropagation.

 

INTRODUCCIÓN

Epithelantha micromeris (Engelm.) F. A. C. Weber ex Britt. & Rose es una cactácea apreciada por coleccionistas nacionales y extranjeros por su morfología como planta de ornato. Se distribuye en el Desierto Chihuahuense, desde el oeste de Texas y Nuevo México en Estados Unidos de América, hasta el norte de México en los estados de Coahuila, Chihuahua, Nuevo León y San Luís Potosí, en donde están presentes variantes endémicas.

Las plantas de esta especie son pequeñas, de 6 cm de diámetro, con tallo simple o cespitoso; espinas pectinadas, radiales, agrupadas en aréolas; flores diurnas, de 25 mm de longitud, color rosa pálido, y atractivos frutos rojos que contrastan con el aspecto gris cenizo de todo el organismo (Hunt et al., 2006). A causa de su rareza, estos cactus globosos son valorados por los productores de plantas ornamentales y viveristas como un producto con demanda en los mercados nacional e internacional (Leszczyñska, 1990).

De acuerdo a las categorías de riesgo establecidas en la NOM-059 –SEMARNAT- 2010 es una especie amenazada de extinción (SEMARNAT, 2010), y también está clasificada en el apéndice II de la Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (CITES) (CITES, 1990).

Dado que E. micromeris es de crecimiento lento en su hábitat natural, se necesitan varios años para que una planta alcance su tamaño adulto y pueda reproducirse; además, por el estatus de riesgo en el que está clasificada es preciso determinar estrategias para su conservación y la de sus variedades ex situ.

Esta modalidad es el medio más significativo y generalizado para preservar los recursos fitogenéticos (CRGAA, 2011). Se basa en custodiar el material biológico vivo en bancos de semillas, bancos de cultivo in vitro y colecciones de plantas (en campo, viveros o jardines botánicos). Los dos primeros constituyen uno de los métodos más convenientes para mantener vigente el germoplasma, ya que permiten almacenar una gran variabilidad genética de forma económica y práctica; sin embargo, en especies como E. micromeris, cuyas poblaciones naturales son escasas y su porcentaje de germinación es bajo por factores ecológicos, es necesario implementar procedimientos como el cultivo de tejidos vegetales (CTV) para lograr este fin (Villavicencio et al., 2006).

El CTV in vitro o micropropagación parte del fundamento de la totipotencialidad de las células vegetales; es decir, por medio de explantes es posible desarrollar plantas normales y completas (Moebius-Goldammer et al., 2003).

Los estudios iniciales de cultivo in vitro en cactáceas las realizaron Minocha y Mehra (1974), quienes intentaron, sin éxito, generar brotes adventicios de Mammillaria woodsii R. T. Craig; ellos consiguieron la formación de callo a partir de yemas, plántulas y partes florales. Posteriormente, Mauseth y Halperin (1975) y Mauseth (1976) evaluaron el control hormonal durante la diferenciación, y demostraron que los brotes adventicios de Opuntia polyacantha Haw. se desarrollan y crecen hasta convertirse en plántula; por otra parte, Clayton et al. (1990) y Dabekaussen et al. (1991) analizaron los factores que inciden en la activación de las areolas en taxa de esta familia botánica. En 2005 se logró la micropropagación de ocho especies y subespecies del género Turbinicarpus, por medio del cultivo de yemas axilares en letargo (Dávila et al., 2005). Así mismo, diversos autores han señalado los elementos que afectan la activación de areolas y han identificado discrepancias en la eficiencia de los métodos de micropropagación, que se expresan en el número de brotes por explante (Vyskot y Jara, 1984; De la Rosa y García, 1994; Giusti et al., 2002; Moebius-Goldammer et al., 2003).

Para la micropropagación de cactáceas se pueden usar como explantes yemas axilares contenidas en las areolas o mamilas procedentes de plantas de vivero (Vyskot y Jara, 1984; Escobar, 1985; Mohamed, 2002) y campo (Clayton et al., 1990), o de plántulas germinadas in vitro (Mata et al., 2001; Villavicencio et al., 2009).

Esta es una forma rápida de obtener individuos en cantidades suficientes para la producción intensiva de plantas de ornato, como se efectúa con orquídeas, cuna de moisés (Spathiphyllum wallisii Regel) y helechos (Sagawa y Kunisaki, 1990).

Por medio del CTV es posible satisfacer la demanda de plantas de E. micromeris, disminuir la presión que existe sobre sus poblaciones naturales y, así, contribuir a su rescate y conservación.

Dada la importancia ecológica y económica de esta cactácea en las zonas semiáridas del Desierto Chihuahuense y en el sector ornamental, se desarrolló un protocolo para su micropropagación que consideró el efecto in vitro del inoculante de Azospirillum sp., bacteria que incide en el proceso rizogénico de plantas propagadas in vivo, como se ha comprobado en Triticum aestivum L., Zea mays L., así como in vitro, entre las que destacan Simmondsia chinensis (Link) C.K. Schneid. (jojoba), Saccharum officinarum L. (caña de azúcar), Solanum tuberosum L. (papa) y Manihot esculenta Crantz (mandioca) (Carletti et al., 2003; Díaz-Zorita et al., 2004; Okon, 1994).

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material genético

Se utilizaron semillas de una colecta masal de poblaciones naturales ubicadas en los municipios Parra de la Fuente, Ramos Arizpe, General Cepeda y Viesca en el estado de Coahuila. En cada localidad se llevó a cabo una caracterización del medio físico que incluyó: altitud, precipitación, temperatura, textura del suelo, pendiente, orientación de la pendiente y vegetación asociada (Figura 1, Cuadro 1).

 

Etapa 1. Establecimiento de semillas en cultivo aséptico

Se evaluó la germinación in vitro de E. micromeris mediante un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial 2 x 2, en el cual el factor A fueron dos tipos de medio, MBG1= MS (Murashige y Skoog, 1962) al 50% y MBG2= 0.6% agar + 87.64 mM de C₁₂H₂₂O₁₁). El factor B consistió en dos tratamientos sin ácido giberélico (C1= 0.0 μm de AG₃) y con aplicación de ácido giberélico (C2= 8.65 μmde AG₃) adicionado al medio de cultivo como promotor de la germinación.

Las semillas utilizadas, procedentes de la colecta masal realizada durante 120 días, se desinfectaron de acuerdo al protocolo de Villavicencio et al. (2009); la unidad experimental fue de 30 semillas y tres repeticiones por tratamiento. Los datos se tomaron cada siete días en un lapso de seis semanas. Las variables consideradas fueron la velocidad (VG) y el porcentaje de germinación (PG).

 

Etapa 2. Multiplicación o inducción de brotes

Se utilizó el medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) adicionado con una relación citocinina-auxina 10:1 en diferentes niveles de concentración. A través de un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial 2x8 se establecieron segmentos de epicotilo obtenido de las plántulas germinadas in vitro en el medio de inducción de brotes (MIB) respectivo. El factor A comprendió dos tipos de fitohormona (F): 6-bencil aminopurina (BA) con 11 niveles de concentración (T1=0.5, T2=0.7, T3=0.9, T4=1.1, T5=2.2, T6=3.3, T7=4.4, T8=0.7, T9=1.1, T10=2.2 y T11=3.3 mM de BA); y cinetina 6-furfuril aminopurina (Kin) con 5 niveles de concentración (T12=0.5, T13=1.2, T14=2.3, T15=3.5 y T16=4.6 de mM de Kin). Ambas combinadas con su proporción correspondiente de auxina: ácido índol-3-butírico (AIB) (T1=0.04, T2=0.06, T3=0.81, T4=1.03, T5=2.07, T6=3.1, T7=4.13, T12=0.41, T13=1.03, T14=2.07, T15=3.31 y T16=4.13 x 10^-1 μM de AIB) y ácido 1-naftalenacético (ANA) (T8=0.15, T9=0.25, T10=0.5 y T11=0.75 x 10^-1 μM de ANA). Así, el total de tratamientos incluyó a 16 en el MIB y uno sin fitohormonas (T0). La unidad experimental se fijó en tres explantes por frasco, con 10 repeticiones por tratamiento. Este ensayo se llevó a cabo ocho veces consecutivas. Cada ocho semanas, después del establecimiento previo al subcultivo se registró el número de brotes (NB) y su altura (A).

Condiciones de incubación. En el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales del Campo Experimental Saltillo del CIRNE-INIFAP se ejecutaron las dos primeras etapas descritas. Las semillas se colocaron en tubos de ensayo con un volumen de 5 mL de medio de cultivo; mientras que las plántulas se subcultivaron en frascos Gerber^(g) de 70 mL, con un volumen de 25 mL de medio de cultivo para la inducción de brotes (MIB). Para los subcultivos en la etapa de multiplicación se utilizaron envases de polipropileno de 500 mL, con un volumen de 50 mL de medio de cultivo; posteriormente, se incubaron a una temperatura de 26 ± 1°C, con un fotoperiodo de 16 h luz.

 

Etapa 3. Enraizamiento in vitro

El enraizamiento de los brotes propagados in vitro reviste gran importancia, pues el objetivo de esta alternativa reproductiva es producir plantas con buenas características fisiológicas y morfológicas que les permitan sobrevivir a las condiciones de trasplante, sobre suelo. En esta etapa se pretende mejorar el proceso de enraizamiento in vitro mediante la aplicación de un biofertilizante con Azospirillum sp., como ingrediente activo, y contribuir así a su aclimatación durante su transferencia al vivero o invernadero.

Se empleó el medio MS (Murashige y Skoog, 1962) al 50%, adicionado con Azospirillum sp. en tres concentraciones: T1=0.7x10⁶ UFC mL^-1, T2=1.5x10⁶ UFC mL^-1 y T3=3x10⁶UFC mL^-1. En total se evaluaron tres tratamientos y un testigo sin Azospirillum sp. Estas concentraciones se aplicaron a los envases de polipropileno con los brotes de E. micromeris obtenidos en la etapa anterior. Después de ocho semanas de incubación se midió el incremento de la altura del tallo (IAT), y se contabilizó el número (NR) y la longitud radicular (LR) (cm).

Dos semanas después de realizado el subcultivo de los brotes, se pesó el biofertilizante (Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de Azospirillum sp.), mismo que se diluyó en agua destilada estéril, y se añadió a los envases con agar (Cuadro 2).

 

Etapa 4. Aclimatación

Manejo de las vitroplantas. Estas se sacan del envase y se lavan con agua corriente para eliminar los restos de agar en la raíz; si es posible, se recomienda clasificarlas por tamaño y antes de su trasplante se sumergen en una solución fungicida (Benomyl). La aclimatación es la etapa más crítica de la micropropagación, porque es preciso cambiar de la condición heterótrofa del cultivo in vitro a la autótrofa in vivo; es decir, su transplante al suelo donde se puede presentar estrés hídrico, y, en consecuencia, es importante considerar el ambiente y sustrato a los que se destinen.

Se utilizó un medio estéril preparado con corteza de coco y agrolita (1:2) que fue depositado en charolas de 288 cavidades; se les aplicaron riegos cada tercer día durante las dos primeras semanas. La aclimatación se realizó a los 40 días posteriores a la evaluación de la supervivencia, a una humedad relativa alta (80-90 %) en la primera y segunda semanas de establecimiento; más adelante, se espaciaron los riegos y se proporcionaron más horas luz, para promover un crecimiento autotrófico.

La información de las distintas etapas de la micropropagación se examinó con el procedimiento GLM del Sistema de Análisis Estadístico (SAS, 2002), a través de la prueba de comparación de medias, con una probabilidad de 95% para la selección de los tratamientos significativos.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Etapa 1. Establecimiento de semillas en cultivo aséptico

Porcentaje de germinación (PG). Las semillas de E. micromeris in vitro requieren de un MBG compuesto por las sales del medio MS (Murashige y Skoog, 1962) al 50% (T1) a fin de promover las tres fases de la germinación: absorción de agua, transformaciones metabólicas-hidratación de enzimas y la emergencia de radícula, en primera instancia, y después de la plúmula. Se registró un PG máximo de 60%, que superó a su homólogo con adición de AG₃ (T2= medio MS (Murashige y Skoog, 1962) a 50% + 8.65 µM de AG₃), lo cual muestra que esta especie no necesita de giberelinas para promover la emergencia de las vitroplantas (figuras 2 y 3).

Cuando se compara el efecto del medio MBG T1= medio MS (Murashige y Skoog, 1962) a 50% con el MBG sin sales nutritivas con y sin AG₃ (T3 y T4), se muestra que en los últimos el PG es menor (37%); en cambio, respecto al MBG T1, se duplica la emergencia de las vitroplantas. Por lo tanto, los componentes del medio de cultivo son significativos para que la cubierta de la semilla se rompa y emerja una nueva vitroplántula, como lo refieren Malda et al. (1999), Kauth et al. (2006) y Dutra et al. (2008).

Cuando disminuye la concentración de sales en el medio de cultivo al 50%, la fuerza iónica en el mismo se reduce; con ello se logra favorecer el metabolismo celular de la semilla. Así, se activa el crecimiento del embrión y el proceso enzimático en los tegumentos de diversas cactáceas: Mammillaria elongata DC., Selenicereus megalanthus (K. Schum. ex Vaupel) Moran y Hylocereus undatus (Haw.) Britton et Rose. De ahí que el medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) a 50% utilizado en la germinación de E. micromeris, resultara efectivo (Figura 2).

Velocidad de emergencia (VE). De los diferentes medios usados en la germinación se determinó que el MBG (T1= medio MS (Murashige y Skoog, 1962) a 50%) registra una mayor VE desde los primeros siete días de incubación. Esta tendencia se mantiene hasta los 42 días de la evaluación, lo cual indica que los nutrimentos del medio favorecen el proceso de germinación y la emergencia de las vitroplantas.

El ácido giberélico como promotor de la germinación no tuvo un efecto significativo en la VE del MBG T2= MS 50X+8.65 μM de AG₃, ni en el medio T4= MBG adicionado con 6% de agar+ 3% de sacarosa + 8.65 µM de AG₃. Desde los primeros 14 días de incubación, el AG₃ exógeno no influyó significativamente en la VE, a diferencia de las semillas establecidas en el T1= medio MS (Murashige y Skoog, 1962) a 50%, en el que los niveles endógenos de AG₃ activaron los procesos enzimáticos (Figura 3).

La VE de E. micromeris es más corta que la reconocida para otras cactáceas, como las del género Ariocarpus, pero más larga que la registrada en hortalizas (cilantro, tomate) y algunas especies forestales (Pinus cembroides Zucc.). El mismo resultado se ha obtenido en Melocastus caesius H. L. Wendl., Stenocereus stellatus (Pfeiff.) Britton et Rose y otras especies de Mammillaria, en los cuales las giberelinas no promueven la germinación (Araya et al., 2000; Rojas, 2008).

 

 

Etapa 2. Multiplicación o inducción de brotes

En los distintos ensayos establecidos se determinó que no existen diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre el tipo de fitohormonas (F) empleadas para la inducción de brotes. La cinetina (Kin) y la bencilaminopurina (BA) produjeron el mismo número de brotes (NB): 9 brotes/explante en promedio; sin embargo, se observaron variaciones en su altura (A), ya que BA generó brotes de 7 mm y cuando se utilizó Kin la altura disminuyó 15% (6 mm), como media (Cuadro 3). Al comparar este efecto con el tratamiento sin fitohormonas se comprobó que de forma endógena E. micromeris es capaz de originar brotes; no obstante, su regeneración es baja (1.2 brotes/explante), al igual que su altura: 1.29 mm/explante (Cuadro 3).

Inducción de brotes (IB). El análisis de los resultados correspondientes a los tratamientos con la prueba de medias (P ≤ 0.05) como efectos independientes definió que la interacción Kin-AIB en relación 10:1 favorece la multiplicación in vitro, de manera que el MIB adicionado con el tratamiento T13= 1.2 mM de KIN + 1.03 μM de AIB y T16= 4.6 mM de KIN + 4.133 μM de AIB generan la mayor tasa de multiplicación, ya que se llegan a producir hasta 15 brotes/explante, valor sobresaliente para la regeneración de la especie.

El MIB con la interacción BA-AIB o BA-ANA tuvo un impacto menor en la inducción de brotes que el MIB con la interacción Kin-AIB, con el cual se obtuvieron en promedio 12 brotes/explante, sin importar la auxina utilizada. Este resultado se logró al combinar el MIB con el tratamiento T4= 1.1 mM de BA + 1.03 μM de AIB o con el T9= 1.1 mM de BA + 0.5 μM de ANA. Esto significa que la concentración citocinina-auxina en relación 10:1 fue positiva para la inducción de brotes, aunque su efecto dependió del tipo de fitohormona empleada (Cuadro 4).

Mediante la aplicación de la citocinina en concentración de 1.1 y 2.2 mM de BA al MIB se obtuvo la misma respuesta, con independencia de la combinación de auxina. Los tratamientos T4 y T9, así como T5 y T10 fueron estadísticamente iguales, ya que formaron 12 y 10 brotes/explante en promedio, respectivamente (Cuadro 4).

Un efecto opuesto se registró con el MIB sin fitohormonas, que mostró una baja regeneración de brotes (1.2 brotes/explante), lo cual indica que los explantes de E. micromeris cuentan con la totipotencia para inducir esta respuesta morfogenética; sin embargo, la tasa de multiplicación no es eficiente respecto al número de brotes (Cuadro 4).

Los resultados demuestran que la interacción citocinina-auxina es efectiva en la organogénesis directa, a semejanza de lo consignado para otras cactáceas mexicanas; como lo refieren Mata et al. (2001) y Pérez (1998), quienes usaron de 8.8 a 13.31 mM de BA + 0-2.6 μM de ANA en medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) para multiplicar una especie del género Epithelantha.

Altura de brotes (A). Cuando se aplica al MIB la misma concentración (10:1) de bencilaminopurina (BA) en interacción con AIB o ANA, como en los tratamientos T2=0.7 mM de BA + 0.06 μM de AIB y T8=0.7 mM de BA + 0.15 μM de ANA, se obtiene igual número de brotes (10 brotes/explante), con una altura de 6 mm, tamaño superior a la de los brotes conseguidos en los tratamientos T13 y T16, en los que se formaron la mayor cantidad de brotes (15 brotes/explante), aunque más pequeños (3 mm). Con el tratamiento T3= 0.9 mM de BA + 0.81 μM de AIB se registraron los más grandes (7.3 mm), a pesar de que su número fue bajo (6 brotes/explante) (Cuadro 4 y Figura 4).

Al respecto, Velázquez y Soltero (2001) consignan que las fuentes de citocinina (Kinetina y 2IP) tuvieron efectos muy significativos sobre la producción de brotes de Epithelantha micromeris var. micromeris (Engelm.) A. Weber ex Britt. & Rose. Así mismo, Corneanu et al., 1990 y Dabekaussen et al., (1991) citan que la citocinina BAP es un componente esencial para la activación de areolas, lo que permite la micropropagación de Sulcorebutia alba Rausch y de Mammillaria spp.

En la etapa de multiplicación de E. micromeris, el control hormonal interviene en la diferenciación del explante; Mauseth (1976; 1979) documenta que la regeneración de brotes in vitro de esta cactácea es posible a partir de yemas axilares, de modo similar a lo referido para Cephalocereus seniles (Haw.) Pfeiff. y Mammillaria albicoma Boed. (Choreño et al., 2002; Wyka y Hamerska, 2010).

En la multiplicación in vitro de E. micromeris incide el MIB adicionado con fitohormonas. Así, cuando se le añaden 0.7 mM de BA + 0.06 μM de AIB (T2) o con 1.2 mM de KIN + 1.03 μM de AIB (T13), la tasa de multiplicación resulta ser exponencial de 1:11:11:11 hasta 1:15:15:15. Esta producción es significativa para la regeneración de la especie y permite incrementar rápidamente el número de plantas, en comparación con el método tradicional de propagación. Dicha tasa de multiplicación supera a las reconocidas para otros taxa, como Mammillaria voburnensis Scheer y Mammillaria elongata DC. (Papafotiou et al., 2001; Pelah et al., 2002; Ordoñez, 2003); además, es mayor a la registrada en los géneros Coryphantha, Echinocereus (Clayton et al., 1990) y en Astrophytum myriostigma Lem. (Villavicencio, 2009), en las cuales se consigna un valor de 1:10:10:10.

 

Etapa 3. Enraizamiento in vitro

Incremento en altura del tallo (IAT). Con el tratamiento T2= MS al 50% + 1.5 x106 UFC/mL^-1 y T3= MS al 50% + 3.0 x106 UFC mL^-1 se logró un efecto positivo en el IAT: al final del proceso de enraizamiento se generaron plantas con una altura de 2 y 3 cm, indicativo de que la concentración de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) aumentó la altura del tallo, a diferencia del testigo, sin la inoculación de la cepa, cuyo IAT resultó menor a 1.4 cm (Cuadro 5).

Número de raíces (NR). Los tratamientos T2= MS al 50% + 1.5 x106 UFC mL^-1 y T3= MS al 50% + 3.0 x106 UFC mL^-1 fueron estadísticamente iguales y al final del proceso se obtuvo el mayor NR (8.5 raíces/planta), caso distinto al del testigo, en el que se formaron solo 4 raíces/planta. Por lo tanto, las mayores concentraciones del biofertilizante de Azospirillum sp. promueven un efecto simbiótico entre la planta y la bacteria (Cuadro 5).

Epithelantha micromeris requiere de una concentración 1.5x106 UFC mL^-1 para que se presente el efecto rizogénico; lo mismo ocurre en el enraizamiento ex vitro de Turbinicarpus knuthianus (Boed.) V. John & Říha, con un total de 6 raíces/planta formadas (Villavicencio et al., 2011), y en Capsicum chinese Jacquin, aunque es relativamente menor a la usada en Camellia sinensis (L.) Kuntze (Canto et al., 2004; Wyka y Hamerska, 2010).

Longitud de raíces (LR). La mayor LR (2.3 mm) se generó al final del proceso a partir del tratamiento T2= MS al 50% + 1.5 x106 UFC mL^-1 ; en contraste, los tratamientos T1 y T3 fueron estadísticamente iguales con un valor de 1.9 cm, en promedio (Cuadro 5, Figura 5).

Las respuestas obtenidas en el enraizamiento in vitro de E. micromeris muestran que su simbiosis con Azospirillum favorecen cambios morfológicos y fisiológicos, así como la producción de hormonas de crecimiento, las cuales promueven el desarrollo de raíces con mayor longitud en menor tiempo, como lo refieren Puente y Bashan (1993) y Burdman et al. (2000).

El efecto rizogénico de la cepa bacteriana inoculada en una concentración de 1.5 x106 UFC L^-1 es similar a la usada en Pinus pringlei Shaw, en la que se consiguió un incremento del peso fresco de la planta hasta de 60% y la longitud de las raíces de 100%.

En cuanto a E. micromeris, la bacteria invadió su sistema radical durante las seis semanas de incubación, período considerado para su enraizamiento in vitro.

De acuerdo con Kapulnik et al. (1985), la aplicación de 107 UFC mL^-1 incide en el número y longitud total de raíz, en tanto que la inoculación de 108 UFC mL^-1 inhibe su desarrollo. El efecto rizogénico de la cepa inoculada al suelo en concentración de 1.5 x106 UFC L^-1 de Azospirillum brasilense es similar al citado para Pachycereus pringlei (S. Watson) Britton et Rose). Para el caso de T. knuthianus, la bacteria invadió su sistema radical en los primeros 30 días de aclimatación, tiempo estimado como fase de adaptación (Pacovsky et al., 1985; Puente y Bashan, 1993).

 

Etapa 4. Aclimatación

Supervivencia. Las plantas enraizadas in vitro de cada tratamiento, aclimatadas en un sustrato estéril, preparado con corteza de coco y agrolita en relación 1:2, tuvieron diferencias significativas en la supervivencia. Aquellas inoculadas con la cepa T2 tuvieron un porcentaje de supervivencia superior a 91%; a diferencia de las plantas enraizadas in vitro con el tratamiento T1 y T3, con 82%. El porcentaje más bajo se alcanzó en las plantas in vitro sin la aplicación de la cepa (72 %) (Figura 6).

Lo anterior muestra que la etapa de endurecimiento o aclimatación en E. micromeris depende de las fases anteriores de la micropropagación, pues en el cultivo in vitro se promueve una respuesta morfogénica; mientras que en la aclimatación se reconstruyen y desarrollan los procesos adaptativos de la planta, como la lignificación de las cubiertas cuticulares y la activación de estomas y órganos fotosintéticos para lograr un desarrollo autónomo (Pacovsky et al., 1985; Puente y Bashan, 1993).

Así, el protocolo de micropropagación y aclimatación de E. micromeris indica que pueden producirse vitroplantas susceptibles de adaptarse a las condiciones hetero-mixotróficas a las cuales están expuestas durante este proceso; asimismo, se destaca que su obtención y aclimatación en invernadero duró ocho meses.

 

CONCLUSIONES

En especies con un número reducido de semillas, como E. micromeris, la pérdida de plántulas limita su regeneración en condiciones controladas; en consecuencia, la selección del medio de cultivo es importante en la etapa de establecimiento, dado que su efecto en dicho momento se refleja en las siguientes fases de la micropropagación.

La micropropagación es un método factible para regenerar especies de cactáceas, ya que produce vitroplantas de tamaño uniforme y con buena calidad fitosanitaria. Mediante el cultivo de tejidos vegetales y la utilización de microorganismos promotores del crecimiento vegetal es posible optimizar los procesos biológicos.

El uso de Azospirillum brasilense es una alternativa exitosa para el enraizamiento in vitro de E. micromeris, puesto que su aplicación aumenta la producción de plantas en más de 800%, en comparación con las técnicas tradicionales.

 

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su reconocimiento y agradecimiento al SNICS-SINAREFI por el financiamiento del proyecto ORNCAC que dio origen al presente trabajo.

 

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