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Introducción
En las regiones tropicales, los nematodos gastrointestinales (NGI) representan un grave problema en pequeños rumiantes; y para disminuir el impacto que estos organismos tienen sobre los animales es necesario realizar algún tipo de tratamiento1. Haemonchus contortus es un nematodo hematófago de mayor prevalencia a nivel mundial en ovinos y caprinos que afecta su salud2,3. Este parásito causa diferentes alteraciones en su hospedero entre ellas reducción en la tasa de crecimiento, anemias y puede causar la muerte súbita3. El principal método para el control de NGI en pequeños rumiantes incluyendo H. contortus, es mediante el uso de antihelmínticos de amplio espectro tales como bencimidazoles, lactonas macrocíclicas, imidazotiazoles y más recientemente el derivado de amino-acetonitrilo. El uso inadecuado y excesivo de estos antiparasitarios ha desencadenado un problema de resistencia antihelmíntica múltiple a nivel mundial4.
En los sistemas de producción de pequeños rumiantes bajo condiciones de pastoreo, el uso de especies arbóreas con potencial forrajero representa una opción viable para su alimentación, debido a que contienen una fuente rica de energía y proteína5. Se ha determinado que estas arbóreas contienen metabolitos secundarios, por lo cual podrían presentar actividad antihelmíntica6. Entre las arbóreas más conocidas se encuentran: Brosimum alicastrum que contiene de 14 a 17 % de proteína cruda (PC)7,8; Guazuma ulmifolia contiene 17 % de PC9,10; Erythrina americana, que aporta de 14 a 18.9 % de PC11,12; y Leucaena leucocephala que aporta de 23.4 hasta 33.2 % de PC, dependiendo de la edad de rebrote y la época del año13,14. En estas especies arbóreas se han identificado algunos metabolitos secundarios; por ejemplo en el follaje de B. alicastrum se reportan fenoles como ácido gálico15, G. ulmifolia presenta fenoles como ácido cafeico, clorogénico y flavonoides como catequina, quercetina y luteolina16. Erythrina americana contiene alcaloides (erysotrina) en las semillas, flores y follaje17 y fenoles como taninos hidrolizables12. Por su parte L. leucocephala contiene flavonoides como quercetina, kaempferol, luteolina, entre otros18.
Debido a la presencia de estos metabolitos secundarios en el follaje de estas plantas y a su disponibilidad en las regiones tropicales resulta interesante conocer su efecto sobre los NGI de pequeños rumiantes; sin embargo, existe información limitada de algunas de estas plantas. En ovejas alimentadas 30 días con G. ulmifolia se encontró una tendencia decreciente altamente significativa (P<0.001) en el conteo de huevos por gramo de heces19, mientras que el extracto metanólico de la semilla de E. americana ejerce un efecto nematicida e insecticida sobre Panagrellus redivivus y Anopheles sp. respectivamente20-22. Por otro lado, extractos acuosos de L. leucocephala y G. ulmifolia mostraron efecto inhibitorio de la eclosión de huevos del 50 % a 1.25 mg/ml sobre de NGI de ovinos23. Con la finalidad de conocer el efecto de B. alicastrum, G. ulmifolia, E. americana y L. leucocephala, sobre el nematodo H. contortus se evaluaron los extractos hidroalcohólicos sobre huevos y larvas infectantes del parásito H. contortus bajo condiciones in vitro.
Material y métodos
Muestras de forraje
La colecta del material vegetal se realizó en la región de la Huasteca Potosina, localizada en el estado de San Luis Potosí. Esta región cuenta con un clima subhúmedo con lluvias en verano24. Se colectaron hojas y tallos de árboles maduros con edad de 3, 12, 20 y 30 años para L. leucocephala, G. ulmifolia, B. alicastrum y E. americana respectivamente. Cabe señalar que el material colectado fueron hojas y tallos no senescentes. La colecta se realizó durante los meses de junio a octubre de 2017. Posteriormente el material fue secado en estufa de aire forzado y molido hasta un tamaño de partícula de 0.5 cm.
Extracto hidroalcohólico
Cada especie arbórea se maceró con una solución hidroalcohólica, colocando 300 g del material vegetal seco y molido en una solución de 70 % agua y 30 % metanol y se dejó macerar durante 24 h. En seguida cada extracto se filtró para retirar el material vegetal. Después de obtener la parte líquida, los solventes se eliminaron por destilación a presión reducida usando un rotavapor R-300 (BUCHI, Suiza) hasta obtener extractos semisólidos. En seguida cada extracto se congeló a -80 °C durante 24 h y finalmente se llevaron a sequedad total por procesos de liofilización y se almacenaron a -40 °C hasta su posterior uso.
Análisis cualitativo de compuestos secundarios de los extractos
El perfil químico de los extractos hidroalcohólicos se determinó siguiendo diferentes procedimientos fitoquímicos usando compuestos de referencia25. La identificación de alcaloides se realizó mediante la técnica de Dragendorff, Mayer y Wagner25. La presencia de cumarinas se determinó con la prueba de Bornträger, mientras que el contenido de flavonoides fue con la prueba de Mg2+ y HCl26,27. Se utilizó la prueba de cloruro férrico, solución salina y gelatina para la identificación de taninos28,29. La identificación de terpenos se determinó usando las pruebas de Liebermann-Burchard y Salkowski y la formación de espuma fue el indicador usado para identificar la presencia de saponinas27.
Material biológico
Huevos y larvas de Haemonchus contortus se obtuvieron de un ovino donador libre de nematodos gastrointestinales de tres meses y medio de edad y 22 kg de peso vivo previamente infectado artificialmente con una cepa monoespecífica del parásito en estudio (cepa INIFAP-HcIVMr-SAI). El ovino se alojó en una jaula individual elevada provista de alfalfa, alimento comercial y agua a libre acceso. El cordero se atendió siguiendo los cuidados de salud y bienestar de acuerdo a la norma NOM-062-ZOO-1999.
Recolección de huevos de H. contortus
Se recolectaron heces directamente del recto del animal infectado. Posteriormente se lavaron con agua limpia a través de tamices de diferente diámetro (240, 150, 120 y 30 µm) y la suspensión del último tamiz se colectó en tubos Falcon de 15 ml conteniendo los parásitos. En seguida los tubos se centrifugaron a 3,500 rpm durante 5 min (tres veces) con la finalidad de obtener huevos libres de residuos de heces. Finalmente se cuantificaron mediante alícuotas para verificar una concentración de 100 ± 15 huevos en una suspensión acuosa de 50 µl30.
Obtención de larvas infectantes (L3) de H. contortus
Las L3 se obtuvieron mediante coprocultivos del animal donador. Las heces colectadas del animal se mantuvieron húmedas a temperatura ambiente durante siete días. Después del tiempo requerido las larvas se recuperaron mediante la técnica de Baermann31. Las L3 obtenidas se almacenaron en cajas de cultivo a 4 °C. Previo a realizar los bioensayos las L3 se suspendieron en hipoclorito (187 µl cloro y 4,813 ml de agua destilada) durante 5 min con la finalidad de que se desenvainaran. En seguida las L3 se lavaron con agua destilada tres veces mediante centrifugación (3,500 rpm por 5 min). Posteriormente se realizaron diferentes diluciones hasta obtener 100 ± 15 L3 contenidas en 50 µl de una suspensión acuosa.
Inhibición de la eclosión de huevos (IEH)
Se realizaron bioensayos en placas de microtitulación de 96 pozos. Cada extracto se evaluó de forma individual por triplicado considerando cuatro repeticiones por replica (n= 12). Los E-HAs de las cuatro especies arbóreas se evaluaron a concentraciones de 50, 25, 12.5 y 6.25 mg/ml. Asimismo, en cada bioensayo se incluyó agua destilada como control negativo e ivermectina (5 mg/ml) como control positivo. A cada pozo se colocaron 50 µl de una suspensión acuosa conteniendo 100 ± 15 huevos y en seguida se agregaron 50 µl de extracto a la concentración requerida o controles según correspondiera. Las placas se incubaron en cámara húmeda a 25-30 °C durante 48 h. Pasado el tiempo se contabilizó el número de huevos y larvas en cada pozo (microscopio a 10x Motic®). El porcentaje de inhibición de la eclosión de huevos (%IEH) se determinó mediante la siguiente fórmula:
Mortalidad larval
Los bioensayos se realizaron en placas de microtitulación de 96 pozos (n=12). Cada extracto se evaluó de forma individual por triplicado considerando cuatro repeticiones por replica (n=12). Los tratamientos fueron los extractos a diferentes concentraciones (100, 75, 50 y 25 mg/ml). Ivermectina (5 mg/ml) y agua destilada fueron usados como control positivo y negativo respectivamente. A cada pozo se depositó una suspensión acuosa de 50 µl conteniendo 100 ± 15 L3 y en seguida se agregaron 50 µl de los tratamientos según correspondiera. Las placas se incubaron en cámara húmeda a 25-30 °C durante 48 h. Posteriormente se cuantificaron las larvas vivas y muertas contenidas en cada pozo basándose a los criterios descritos por Olmedo-Juárez et al32. El porcentaje de mortalidad larval (ML) se determinó mediante la siguiente ecuación:
Análisis estadístico
Los porcentajes de IEH y ML fueron previamente normalizados usando la raíz cuadrada y analizados mediante un ANOVA bajo un diseño completamente al azar con el modelo lineal general (PROC GLM) del paquete estadístico SAS versión 9.033. La comparación de medias se realizó mediante la prueba de Tukey a un nivel de significancia de 0.05. Los tratamientos con efecto dependiente a la concentración se sometieron a un análisis de regresión para determinar las concentraciones letales 50 y 90 (CL50 y CL90) mediante el sistema PROC PROBIT del paquete estadístico SAS33.
Resultados
Inhibición de la eclosión de huevos y mortalidad larval
En el Cuadro 1 se muestran los resultados de la actividad ovicida y larvicida del EHA de B. alicastrum sobre el nematodo H. contortus. Dicha actividad fue diferente (P<0.05) en cada concentración evaluada, obteniendo el mayor efecto inhibitorio de la eclosión de huevos a 50 mg/ml. Por otro lado, en la prueba de mortalidad larval, solo se logró un porcentaje de mortalidad de 29 % a 100 mg/ml.
Cuadro 1 Porcentaje de inhibición de la eclosión de huevos (%IEH) y mortalidad de larvas infectantes (L3) de Haemonchus contortus causadas por un extracto hidroalcohólico de Brosimum alicastrum
| Tratamientos | Promedio de huevos y larvas | %IEH ± DE | Promedio de larvas vivas y muertas | % Mortalidad ± DE | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Huevos | Larvas | Muertas | Vivas | |||
| Agua destilada | 2.9 | 138.2 | 2.07 ± 1.0f | 2.8 | 74.5 | 4.6 ± 4.3c |
| Ivermectina (5 mg/ml) | 127.2 | 0.8 | 99.9 ± 0.2a | 139.3 | 0 | 100a |
| EHA-Ba (mg/ml) | ||||||
| 100.0 | --- | --- | --- | 34.8 | 87.7 | 29.0 ± 11.1b |
| 75.0 | --- | --- | --- | 32.3 | 94.1 | 26.1 ± 7.6b |
| 50.0 | 92.8 | 21.1 | 81.4 ± 3.5b | 14.3 | 103.6 | 14.4± 14.4b |
| 25.0 | 82.0 | 36.6 | 69.1 ± 5.1c | 11.3 | 121.6 | 8.5 ± 5.2c |
| 12.5 | 75.5 | 43 | 63.8±2.4d | --- | --- | --- |
| 6.25 | 70.0 | 56.1 | 55.5 ± 1.7e | --- | --- | --- |
| Coeficiente de variación | 0.62 | 23.1 | ||||
| R2 | 0.99 | 0.95 | ||||
| Error estándar de la media (EEM) | 0.04 | 0.15 | ||||
| Valor de P | <0.001 | <0.0001 | ||||
EHA-Ba=Extracto hidroalcohólico de Brosimum alicastrum. ---= no evaluado. DE= desviación estándar.
a-f Medias con distinta literal dentro de la misma columna indican diferencia (P<0.05).
El EHA de G. ulmifolia exhibió un efecto ovicida cercano al 100 % a partir de la concentración 6.25 mg/ml, siendo estadísticamente igual a la que se obtuvo con ivermectina hasta la concentración de 12.5 mg/ml (Cuadro 2). Un efecto similar se observó usando el EHA de E. americana a concentraciones de 50, 25 y 12.5 mg/ml (Cuadro 3).
Cuadro 2 Porcentaje de inhibición de la eclosión de huevos y mortalidad de larvas infectantes (L3) de Haemonchus contortus causadas por un extracto hidroalcohólico de Guazuma ulmifolia
| Tratamientos | Promedio de huevos y larvas | %IEH ± DE | Promedio de larvas vivas y muertas | % Mortalidad ± DE | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Huevos | Larvas | Muertas | Vivas | |||
| Agua destilada | 5.5 | 135.3 | 2.07 ± 1.0f | 1.9 | 153.8 | 1.1 ±1.8e |
| Ivermectina (5 mg/ml) | 127.3 | 0 | 99.9 ± 0.2a | 158.1 | 0 | 100a |
| EHA-Gu (mg/ml) | ||||||
| 100.0 | --- | --- | --- | 109.7 | 18.5 | 85.9 ± 7.4b |
| 75.0 | --- | --- | --- | 85.3 | 60.5 | 57.2 ± 15.5c |
| 50.0 | 118.8 | 0.4 | 99.5 ± 0.7ab | 43.5 | 103.8 | 26.8± 15.0d |
| 25.0 | 112.5 | 2.3 | 97.8 ± 2.8ab | 11.3 | 138 | 7.7 ± 4.9e |
| 12.5 | 120.8 | 0.75 | 99.4± 0.9ab | --- | --- | --- |
| 6.25 | 113.4 | 3.9 | 96.78± 5.3b | --- | --- | --- |
| Coeficiente de variación | 3.12 | 21.3 | ||||
| R2 | 0.99 | 0.95 | ||||
| Error estándar de la media (EEM) | 0.03 | 0.18 | ||||
| Valor de P | <0.001 | <0.0001 | ||||
DE= desviación estándar; EHA-Ba=Extracto hidroalcohólico de Guazuma ulmifolia. ---= no evaluado.
a-f Medias con distinta literal dentro de la misma columna indican diferencia (P<0.05).
Cuadro 3 Porcentaje de inhibición de la eclosión de huevos y mortalidad de larvas infectantes (L3) de Haemonchus contortus causadas por un extracto hidroalcohólico de Erythrina americana
| Tratamientos | Promedio de huevos y larvas | %IEH ± DE | Promedio de larvas vivas y muertas | % Mortalidad ± DE | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Huevos | Larvas | Muertas | Vivas | |||
| Agua destilada | 5.9 | 134.0 | 4.1 ± 2.0c | 3.0 | 96.3 | 3.6 ±2.9d |
| Ivermectina (5 mg/ml) | 111.5 | 0.2 | 99.7± 0.6a | 145.4 | 0 | 100a |
| EHA-Ea (mg/ml) | ||||||
| 100.0 | --- | --- | --- | 93.4 | 49.1 | 60.0± 13.5b |
| 75.0 | --- | --- | --- | 102.7 | 50.1 | 58.0 ± 24.8b |
| 50.0 | 111.4 | 2.6 | 97.0 ± 7.5ab | 86.8 | 49.2 | 62.6± 10.2b |
| 25.0 | 86.4 | 0.5 | 99.5 ± 0.7a | 50.3 | 93.3 | 35.8± 7.3c |
| 12.5 | 91.3 | 2.0 | 97.7 ± 2.6a | --- | --- | --- |
| 6.25 | 94.0 | 9.3 | 88.8 ± 19.0ab | --- | --- | --- |
| Coeficiente de variación | 10.7 | 21.4 | ||||
| R2 | 0.94 | 0.89 | ||||
| Error estándar de la media (EEM) | 0.12 | 0.16 | ||||
| Valor de P | <0.0001 | <0.0001 | ||||
EHA-Ba=Extracto hidroalcohólico de Erythrina americana. ---= no evaluado. DE=desviación estándar.
a-d Medias con distinta literal dentro de la misma columna indican diferencia (P<0.05).
La mayor actividad larvicida (85 % ML) del extracto de G. ulmifolia se logró usando la concentración más alta (100 mg/ml). Mientras que el EHA de E. americana solo causó un 60 % de mortalidad a la misma concentración. Por otro lado, los resultados obtenidos con el EHA a partir de L. leucocephala mostraron el mayor porcentaje de IEH (83.2 %) cuando se usó la concentración de 50 mg/ml. Y para ML solo se logró 63 % al usar 100 mg/ml del EHA (Cuadro 4).
Cuadro 4 Porcentaje de inhibición de la eclosión de huevos y mortalidad de larvas infectantes (L3) de Haemonchus contortus causadas por un extracto hidroalcohólico de Leucaena leucocephala
| Tratamientos | Promedio de huevos y larvas | %IEH ± DE | Promedio de larvas vivas y muertas | % Mortalidad ± DE | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Huevos | Larvas | Muertas | Vivas | |||
| Agua destilada | 7.7 | 131.3 | 5.6 ± 3.5c | 4.7 | 122.0 | 5.2 ±2.9d |
| Ivermectina (5 mg/ml) | 112.5 | 0.1 | 99.9 ± 0.2a | 145.4 | 0 | 100a |
| EHA-Ll (mg/ml) | ||||||
| 100.0 | --- | --- | --- | 75.7 | 40.0 | 63.0± 22.9b |
| 75.0 | --- | --- | --- | 27.6 | 99.5 | 21.7 ± 8.4c |
| 50.0 | 97.0 | 20.4 | 83.2 ± 12.4a | 13.0 | 95.2 | 12.0± 2.1cd |
| 25.0 | 53.9 | 66.8 | 48.9 ± 31.7b | 7.5 | 114.2 | 6.2± 2.9d |
| 12.5 | 50.5 | 65.9 | 48.4 ± 35.3b | --- | --- | --- |
| 6.25 | 44.4 | 65.9 | 45.9 ± 38.6b | --- | --- | --- |
| Coeficiente de variación | 46.1 | 29.2 | ||||
| R2 | 0.59 | 0.93 | ||||
| Error estándar de la media (EEM) | 0.35 | 0.21 | ||||
| Valor de P | <0.0001 | <0.0001 | ||||
EHA-Ba=Extracto hidroalcohólico de Leucaena leucocephala. ---= no evaluado. DE= desviación estándar.
a-d Medias con distinta literal dentro de la misma columna indican diferencia (P<0.05).
Concentraciones letales (CL)
Las Cs 50 y 90 requeridas para causar IEH y mortalidad larval son mostradas en el Cuadro 5. El análisis de regresión indicó que los extractos con mejor efecto inhibitorio de la eclosión de huevos fueron EHA-Ea (CL50= 0.16 mg/ml y CL90= 4.41 mg/ml) y EHA-Gu (CL50=2.7 mg/ml y CL90=4.4 mg/ml). En lo que respecta a la mortalidad larval el mejor tratamiento fue observado en EHA-Gu con CL50 y CL90 de 64.0 y 125.2 mg/ml, respectivamente.
Cuadro 5 Concentraciones letales (CL50 y CL90) de extractos hidroalcohólicos de cuatro forrajeras arbóreas requeridas para inhibir la eclosión de huevos y matar larvas infectantes (L3) de Haemonchus contortus a las 48 horas
| % Inhibición de la eclosión de huevos | % Mortalidad de larvas infectantes (L3) | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Planta | CL50 | IC limites 95% (inferior-superior) | CL90 | IC limites 95% (inferior-superior) | CL50 | IC limites 95% (inferior-superior) | CL90 | IC limites 95% (inferior-superior) | |
| EHA-Ba | 4.8 | (3.88-5.70) | 197 | (145.6-293.1) | 187.8 | (156.67-2.70.6) | 608.7 | (376.7- ..) | |
| EHA-Gu | 2.7 | (2.6-2.8) | 4.4 | (2.62-2.80) | 64.0 | (62.45-65.66) | 125.2 | (119.6-132.0) | |
| EHA-Ea | 0.16 | (0.04-0.38) | 4.1 | (2.8-5.4) | NA | --- | NA | --- | |
| EHA-Ll | 17.9 | (16.8-19.1) | 201.9 | (167.6-251.0) | 93.12 | (91.61-94.71) | 124.5 | (119.6-131.36) | |
IC= intervalo de confianza. NA= no activo. EHA-Ba=Brosimum alicastrum, EHA-Gu=Guazuma ulmifolia, EHA-Ba Erythrina americana.
Identificación de metabolitos secundarios
El análisis fitoquímico permitió observar la presencia de metabolitos secundarios en los cuatro extractos de las plantas tales como taninos, cumarinas, saponinas, alcaloides y flavonoides (Cuadro 6).
Cuadro 6 Resultados del análisis fito-químico cualitativo de los extractos hidroalcohólicos
| Metabolito | Reacción colorimétrica | Extracto hidroalcohólico (E-HA) | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Brosimum alicastrum | Guazuma ulmifolia | Erythrina americana | Leucaena leucocephala | ||
| Alcaloides | Dragendorff | - | - | - | + |
| Mayer | - | - | - | + | |
| Wagner | - | - | - | ++ | |
| Cumarinas | Borntraeguen | - | + | + | + |
| Flavonoides | Mg2+ y HCL | - | - | + | + |
| Taninos | Cloruro férrico | +++ | +++ | +++ | +++ |
| Solución de gelatina | - | - | - | - | |
| Gelatina y solución salina | - | - | - | - | |
| Solución salina | +++ | +++ | +++ | +++ | |
| Triterpenos/ Esteroides | Liebermann-Burchard | - | + | - | + |
| Salkowski | + | + | + | + | |
| Saponinas | Formación de espuma | + | - | + | ++ |
(-) No se detectó (+) reacción positiva de luz (++) reacción positiva (+++) reacción positiva fuerte.
Discusión
Los productos naturales obtenidos de plantas ricas en metabolitos secundarios han sido evaluados para diferentes fines medicinales tales como antioxidantes, antimicrobianos y antiparasitarios34-36. Los cuatro extractos hidroalcohólicos evaluados en el presente estudio exhiben actividad nematicida contra Haemonchus contortus, un parásito hematófago de mayor prevalencia en ovinos y caprinos que afecta su salud. Existen pocos estudios del uso de Brosimum alicastrum como antihelmíntico, a pesar de que es un recurso abundante en las regiones tropicales; se ha observado que el extracto de acetona: agua (70:30) sobre larvas de H. contortus inhibe el 95 % de la capacidad de desenvainar con una concentración de 1.2 mg/ml37. Mientras que en el presente estudio usando extracto a base de metanol:agua se requirió 187.8 mg/ml para causar 50 % de mortalidad. Por otra parte, se ha demostrado que un extracto acetónico de G. ulmifolia exhibe actividad ovicida sobre Cooperia punctata, otro nematodo parásito de bovinos, inhibiendo hasta 70 % de la eclosión a una concentración de 9.6 mg/ml38. Asimismo, un extracto etanólico (100 mg/ml) de esta especie vegetal, ha mostrado efecto nematicida sobre Pheritima posthuma39. En un estudio reciente, se ha demostrado que un extracto hidroalcohólico de G. ulmifolia exhibe importante efecto ovicida (90 % IEH) a concentración de 0.50 mg/ml40. La actividad ovicida reportada en el presente estudio con el extracto hidroalcohólico de G. ulmifolia indica que se requiere mayor concentración (CL50=4.4 mg/ml) a lo reportado por el trabajo anterior. Esto podría explicarse a que se utilizó una especie vegetal colectada en distinta región y probablemente el contenido de compuestos bioactivos podría ser diferente entre ambas especies vegetales. Aunque en el presente trabajo se ha reportado que G. ulmifolia contiene algunos compuestos secundarios tales como taninos, flavonoides, cumarinas y terpenos, es de suma importancia conocer el contenido de cada uno de dichos compuestos para relacionarlos con la actividad antihelmíntica. Por otro lado, también se han realizado estudios in vivo en cabritos infectados artificialmente con larvas infectantes de H. contortus, los cuales fueron alimentados con 10 % de follaje de G. ulmifolia y no se obtuvieron diferencias entre el conteo de huevos por gramo de heces (HPG) comparados con el grupo testigo41. Los mismos resultados se observaron en ovejas Pelibuey alimentadas con 30 % de G. ulmifolia, no obstante, se observó tendencia altamente significativa (P<0.001) hacia la disminución del HPG en estas ovejas19.
Es conocido que las especies del genero Erythrina poseen una amplia variedad de alcaloides que han sido identificados y se les atribuye un efecto de bloqueo neuromuscular20 además, el uso de extracto metanólico sobre Daphnia magna resultó ser altamente tóxico21, por lo que el efecto nematicida encontrado en el presente estudio podría atribuirse a esos compuestos. Un extracto metanólico de E. variegate ha sido evaluado contra los crustáceos del género Artemia, así como en lombrices de tierra (Eisenia foetida) y helmintos parásitos de aves como Ascardi galli y Raillietina spiralis y se reportó mortalidad sobre esos modelos biológicos usando concentraciones de 10 mg/ml42,43. Por otro lado, en un estudio realizado en ovinos Pelibuey alimentados con follaje E. americana no manifestaron cambios en el conteo de huevos durante la fase experimental12.
Las CLs 50 y 90 para B. alicastrum en larvas de nematodos gastrointestinales reportados en otro estudio fueron 291.6 y 666.6 mg/ml, respectivamente44, las cuales fueron similares a las reportadas en el presente estudio (187.8 y 608.7 mg/ml). En lo que respecta, a G. ulmifolia los resultados del presente estudio indican que para inhibir el 50 % de la eclosión de huevos de H. contortus, se requieren 2.2 mg/ml del extracto hidroalcohólico, mientras que en otro estudio con un extracto acetona:agua (70:30) de G. ulmifolia contra C. punctata fue de 8.84 mg/ml38. En ese mismo estudio los autores reportan una CL50 del extracto 70:30 acetona:agua de L. leucocephala, de 11.77 mg/ml38. En el presente trabajo de investigación las CLs calculadas para el EHA de las hojas de esta arbórea fueron más altas (CL50=52.8 y CL90=308 mg/ml) respectivamente (Cuadro 5)45. La CL de E. americana sobre H. contortus no ha sido reportada previamente, sin embargo, para la especie E. variegata, sobre crustáceos del género Artemia, la CL50 fue de 3.99 mg/ml43, valor superior al del presente estudio (0.19 mg/ml).
Algunos metabolitos secundarios tales como taninos, saponinas y cumarinas se han identificado en corteza y hojas de B. alicastrum46,47. En el presente estudio, el perfil químico en el extracto de B. alicastrum indicó la presencia taninos y saponinas. Por otro lado, en G. ulmifolia se han reportado saponinas, glucósidos cianogénicos, fenoles y esteroides de manera cualitativa48, mismos que fueron encontrados en el presente estudio. En otras especies del género Erythrina, se ha reportado que contienen metabolitos secundarios parecidos a los que se encontraron en el extracto hidroalcohólico de E. americana. Se ha notificado que E. variegate contiene alcaloides, saponinas y flavonoides43. En otro estudio en E. americana proveniente de Tabasco, México se ha identificado altos niveles de taninos12. Los metabolitos secundarios reportados en L. leucocephala dependen del tipo de extracto; por ejemplo, en extractos acuosos y etanólicos se han identificado saponinas, fenoles, taninos, terpenos entre otros, similar al perfil encontrado en este estudio45,49-51.
Conclusiones e implicaciones
Se concluye que el extracto hidroalcohólico de los cuatro árboles estudiados pueden ser una opción para el control de Haemonchus contortus en pequeños rumiantes, en especial G. ulmifolia y E. americana. Se recomienda continuar con su estudio para identificar los compuestos activos en cada caso.
