texto en 
Inglés (pdf)
Artículo en XML
Referencias del artículo
Traducción automática
Enviar artículo por email
Citado por SciELO 
Similares en
SciELO 
Permalink
Introducción
La producción porcina está cada vez más obligada a mejorar su eficiencia productiva ya que se estima que emite el 9 % de las emisiones totales de gases de efecto invernadero de la ganadería; de ese total las excretas aportan el 27.4 %, compuesto por el 70.1 % de metano y el 29.9 % de óxido nitroso1. La cantidad de óxido nitroso puede ser reducida al mejorar la eficiencia alimenticia disminuyendo así la excreción de nitrógeno2. En ese aspecto el mayor potencial de mitigación se encuentra en el sistema semitecnificado, y esto es por una mejora en la eficiencia de la piara1, aunque esa disminución de la excreción de nitrógeno es posible en cualquier sistema al mejorar la precisión en la formulación del alimento3.
Una herramienta para alcanzar este objetivo es la determinación de la digestibilidad de las materias primas y dietas utilizadas en la alimentación del cerdo, sobre todo en un sistema de producción como el mexicano que depende de una gran variedad de materias primas, a diferencia del sistema maíz-pasta de soya utilizado en algunos países como Estados Unidos y Brasil. Sin embargo, el desarrollo de estos estudios es largo y costoso sobre todo por los análisis de laboratorio que tienen que realizarse. El Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) ha realizado varios estudios de digestibilidad ileal de los aminoácidos y total de la proteína y energía4, por lo que se usaron las muestras de digesta ileal y heces de dichos estudios para generar el modelo de calibración basado en el método de cuadrados mínimos parciales y así poder estimar la composición química de los contenidos ileales y de heces en un equipo de cercano infrarrojo.
El cercano infrarrojo pertenece al espectro electromagnético, el cual está dividido por regiones de acuerdo con la longitud de las ondas emitidas, la región del cercano infrarrojo (NIRS por sus siglas en inglés) está comprendida entre las longitudes de ondas de 780 a 2,500 nm; y se caracteriza porque su radiación no modifica la estructura de la materia, pero produce vibración de sus átomos, por ello su amplio uso en la industria y la producción animal5,6. Los átomos de H, C, N y O forman los grupos funcionales C-H, N-H y O-H; los cuales absorben parte de la energía emitida, y otra parte la reflejan creando bandas de absorción. La proporción y cantidad de estos grupos funcionales encontradas en la muestra hacen que su espectro sea único7; por lo que el NIRS puede predecir con precisión la composición química de las muestras escaneadas. Sin embargo, antes de usarlo como una herramienta para predecir la composición química de una muestra, es necesario obtener los modelos de predicción para cada tipo de muestra y analito que se desee analizar. Este proceso consiste en la asociación de la información espectral con los valores obtenidos en el laboratorio8. Por lo que el objetivo del presente trabajo fue obtener los modelos de predicción en un aparato NIRS para estimar el contenido de proteína cruda, lisina, treonina y leucina en la digesta ileal y de materia seca, proteína y energía en heces de cerdo.
Material y métodos
El trabajo se realizó en el Centro Nacional de Investigación en Fisiología y Mejoramiento Animal (CENID-Fisiología), en Ajuchitlán Querétaro. Las muestras de digesta ileal y heces se obtuvieron de experimentos realizados previamente9-15, en los cuales se determinó la digestibilidad ileal y fecal de la materia seca (MS), energía (E) y proteína cruda (PC), y la digestibilidad ileal de los aminoácidos (AA). En todos los experimentos se respetaron los lineamientos de la CIOMS16 y de la Norma Oficial Mexicana para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio17.
Animales, jaulas y obtención de muestras
Todos los cerdos se alojaron en jaulas metabólicas individuales equipadas con comederos, bebederos de chupón y charolas para la colección de heces, todos los alimentos fueron en harina y son descritos en las referencias citadas; a los cerdos se les alimentó a 2.5 veces sus necesidades de ED de mantenimiento18. La instalación cuenta con control de temperatura la cual se mantuvo a 19 ± 2°C. Las muestras de digesta ileal se liofilizaron y las de heces se secaron en una estufa de aire forzado a 55 °C durante 48 h. Posteriormente, las muestras de digesta liofilizada se molieron a través de una malla de 0.5 mm y las de heces secas a través de una malla de 1 mm en un molino de laboratorio (Arthur H. Thomas Co. Philadelphia, PA).
Análisis de laboratorio
Los análisis de materia seca y proteína cruda se realizaron de acuerdo con los métodos oficiales 934.01 y 976.05 del AOAC19, la determinación de los marcadores de digestibilidad utilizados en los experimentos se realizó para el óxido de cromo de acuerdo con Fenton20 y el óxido de titanio según Myers21. Para la determinación de los AA se utilizó el método 994.12 del AOAC19, el cual consiste en hidrolizar las muestras a 110 °C durante 24 h en HCl 6 mol/L, los análisis de aminoácidos se realizaron según Henderson22 o Csapó23. Los análisis de energía se realizaron en una bomba calorimétrica adiabática (1281, Parr, Moline, IL).
Procedimiento obtención de muestras en equipo NIRS
Las muestras se colocaron en una copa de cuarzo y se escanearon con un espectrofotómetro FT-IR Nicolet 6700 (Thermo Fisher Scientific, Inc), para la generación de los espectros se utilizó el programa OMNIC™. Los espectros se obtuvieron dentro la región del infrarrojo cercano (IC) (1000-2500 nm) y la absorbancia de los datos se expresó como el logaritmo del recíproco de R “(log 1/R)” donde R= reflectancia. Los espectros generados se alimentaron con los valores obtenidos en el laboratorio. El modelo estadístico multivariado utilizado fue el de cuadrados mínimos parciales, la primera o segunda derivada y los filtros de Savitzky-Golay con el Software TQ Analyst v8™. Las variables introducidas en el TQ Analyst v8 fueron: el contenido de materia seca, proteína, energía y aminoácidos. La calibración se realizó con 2/3 de las muestras y la validación con 1/3 ya fuera para muestra de heces o contenido ileal. La selección del mejor modelo predictivo se basó en la minimización de los siguientes estadísticos: error estándar de la predicción (SEP), y el error estándar de la calibración cruzada (SECV), y por otro lado la maximización del coeficiente de determinación (R2). Para evaluar el poder de predicción del modelo de calibración, se consideró el índice: RPD= la proporción de la desviación de predicción. Así el poder de predicción de la calibración se considera: si RPD es menor a 1.5, no es útil la calibración; si RPD está entre 1.5 a 2.0, la calibración podría distinguir entre valores bajos y altos; si RPD está entre 2.0 y 2.5, la calibración tiene posibilidades de hacer predicciones cuantitativas; si RPD está entre 2.5 a 3.0, la predicción de la calibración es buena y si RPD es mayor a 3.0, la calibración hace excelente predicciones (Williams, 2003) citado por Saeys24. Se consideraron “outlier” aquellas muestras con diferencias mayores a 2.5 desviaciones estándar, las cuáles se eliminaron del estudio.
Escaneo de muestras
Digesta ileal: Se utilizaron 119 muestras de digesta ileal. El análisis matemático utilizado fue el cuadrado mínimo parcial (CMP). El tratamiento matemático fue 1,4,13,6 (los números representan el grado de la derivada, el ancho del intervalo sobre el cual se calcula la derivada, el nivel de suavidad y el nivel del orden del polinomio).
Heces: Se utilizaron 222 muestras. El modelo estadístico utilizado fue el cuadrado mínimo parcial (CMP), y se usó el tratamiento matemático 1,4,11,5 (ver explicación anterior).
Gráficos. Los gráficos se realizaron utilizando los paquetes “ggplot2”25 y “patchwork”26 del programa R27.
Resultados
Espectros
Espectros representativos de muestras de digesta ileal y heces se muestran en la Figura 1.
Calibración para el análisis de la digesta ileal
Se utilizaron 119 muestras, de las cuales se eliminaron 9 debido a que se consideraron “outliers” de acuerdo al criterio mencionado anteriormente. Por lo que los resultados son sobre el análisis de las 110 muestras conservadas.
Proteína. La media y la desviación estándar (DE) para proteína fueron de 15.57 ± 2.15; con un rango de 11.1 a 20.8 (Cuadro 1). El coeficiente de determinación R2 fue de 0.98, los errores estándar de calibración (SEC), de validación cruzada (SECV) y de predicción (SEP), fueron 0.330, 1.020 y 0.640, respectivamente. Su RPD fue de 2.11 y la relación DE/SEP de 3.34 (Cuadro 2, Figura 2A).
Cuadro 1 Estadísticosde los nutrimentos analizados en la digesta ileala
| Digesta ileal | Proteína | Leucina | Lisina | Treonina |
|---|---|---|---|---|
| N | 110 | 110 | 110 | 110 |
| Media | 15.57 | 0.85 | 0.58 | 0.71 |
| DEb | 2.15 | 0.21 | 0.29 | 0.36 |
| mínimo | 11.1 | 0.33 | 0.17 | 0.32 |
| máximo | 20.8 | 1.31 | 1.82 | 2.13 |
aLos valores representan el contenido porcentual del nutrimento en la materia seca, exceptuando la energía que está expresada en Kcal/kg.
bDE = Desviación estándar.
Cuadro 2 Resultados de las calibraciones de los analitos en la digesta ileal
| Calibración | Primera | Segunda | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Parámetro | Proteína | Leucina | Lisina | Treonina | Lisina | |
| R2a | 0.98 | 0.95 | 0.93 | 0.67 | 0.92 | |
| SECb | 0.330 | 0.040 | 0.077 | 0.209 | 0.070 | |
| SECVc | 1.020 | 0.123 | 0.217 | 0.230 | 0.137 | |
| SEPd | 0.640 | 0.102 | 0.143 | 0.187 | 0.115 | |
| RPDe | 2.11 | 1.70 | 1.31 | 1.57 | 2.08 | |
| SD/SEPf | 3.34 | 2.07 | 2.00 | 1.94 | 2.48 | |
aCoeficiente de determinación; bError estándar de la calibración; cError estándar de la calibración cruzada; dError estándar de la predicción; eDesviación estándar entre el error estándar de la calibración cruzada; fProporción de la desviación estándar entre SEP (SD/SEP).
Los valores de las ecuaciones se reportan en el Cuadro 2
Figura 2 Relación entre los valores predichos por el NIRS y los determinados en el Laboratorio para la digesta ileal
Leucina. La media y la desviación estándar fueron de 0.85 ± 0.21. Con un rango de 0.33 a 1.31 (Cuadro 1). El coeficiente de determinación R2 fue de 0.95, los valores de SEC 0.040, SECV 0.123 y SEP 0.102. Los resultados obtenidos para RPD fueron de 1.70 y para la relación DE/SEP fue de 2.07 (Cuadro 2, Figura 2B).
Lisina. La media y la desviación estándar fueron de 0.58 ± 0.29. Con un rango de 0.17 a 1.82. El coeficiente de determinación R2 fue de 0.93. Los valores de SEC 0.077, de SECV 0.217 y SEP 0.143, para RPD 1.31 y la relación DE/SEP fue de 2.00.
Con el fin de mejorar el modelo de predicción de lisina, se realizó una segunda calibración únicamente para lisina. Los estadísticos de DE/SEP y RPD mejoraron y hubo una mínima disminución (un punto porcentual) para la R2. La media, desviación estándar, y los valores mínimos y máximos fueron los mismos descritos en el párrafo anterior., por lo que el coeficiente de determinación (R2) fue de 0.92. Los resultados de SEC 0.070, SECV 0.137, SEP 0.115. El resultado obtenido para RPD fue de 2.08 y para DE/SEP fue de 2.48. (Cuadro 2, Figura 2C).
Treonina. La media y la desviación estándar para treonina fueron de 0.71 ± 0.36. Con un rango de 0.32 a 2.13 (Cuadro 1). El coeficiente de determinación R2 fue de 0.67, los valores de SEC, SECV y SEP, fueron 0.209, 0.230 y 0.187 respectivamente. Su RPD fue de 1.57 y la relación DE/SEP de 1.94 (Cuadro 2, Figura 2D).
Calibración para el análisis de las heces
De las 222 muestras se eliminaron 20 muestras que se consideraron “outliers”. El resumen de los estadísticos generados por el NIRS se muestra en el Cuadro 3.
Cuadro 3 Estadísticos de los nutrimentos analizados en las hecesa
| Heces | Proteína | Energía | Materia seca |
|---|---|---|---|
| N | 202 | 202 | 202 |
| Media | 20.05 | 4444 | 93.43 |
| DE | 6.65 | 269 | 2.48 |
| Mínimo | 4.50 | 3684 | 85.83 |
| Máximo | 29.20 | 4966 | 97.50 |
aLos valores representan el contenido porcentual del nutrimento en la materia seca, exceptuando la energía que está expresada en Kcal/kg.
bDE= desviación estándar.
Proteína. Su media y desviación estándar fueron de 20.05 ± 6.65 respectivamente, con un rango de 4.5 a 29.2 (Cuadro 3). Su coeficiente de determinación R2 fue de 0.98. El valor de SEC 0.950, de SECV 1.600 y de SEP 1.190. Los estadísticos para RPD y DE/SEP fueron superiores a 4, obteniendo valores de 4.16 y 5.59 respectivamente (Cuadro 4, Figura 3A).
Cuadro 4 Resultados de las calibraciones de los analitos en las heces
| Parámetro | Proteína | Energía | Materia seca |
|---|---|---|---|
| R2a | 0.98 | 0.94 | 0.87 |
| SECb | 0.950 | 60.8 | 0.830 |
| SECVc | 1.600 | 106.3 | 1.390 |
| SEPd | 1.190 | 95.3 | 1.150 |
| RPDe | 4.16 | 2.53 | 1.78 |
| SD/SEPf | 5.59 | 2.82 | 2.16 |
aCoeficiente de determinación; bError estándar de la calibración; cError estándar de la calibración cruzada; dError estándar de la predicción; eDesviación estándar entre el error estándar de la calibración cruzada; fProporción de la desviación estándar entre SEP (DE/SEP).
Los valores de las ecuaciones se reportan en el Cuadro 4.
Figura 3 Relación entre los valores predichos por el NIRS y los determinados en el Laboratorio para las heces
Energía. La media y la desviación estándar fueron de 4,444 ± 269; con un rango de 3,684 a 4,966 (Cuadro 3). El coeficiente de determinación R2 fue de 0.94 Los resultados para los errores fueron para SEC 60.8, SECV 106.3 y SEP 95.3. Los resultados obtenidos para RPD fueron de 2.53 y para DE/SEP 2.82 (Cuadro 4, Figura 3B).
Materia seca. La media y desviación estándar fueron de 93.43 ± 2.48, con un rango de 85.83 a 97.50 (Cuadro 3). El coeficiente de determinación R2 fue de 0.87, los valores de SEC, SECV y SEP, fueron 0.830, 1.390 y 1.150, respectivamente. Su RPD fue de 1.78 y la relación DE/SEP de 2.16 (Cuadro 4, Figura 3C).
Discusión
El fundamento de la técnica de la espectroscopia se basa en la interacción de la luz con la composición molecular de la materia; en el infrarrojo cercano (longitudes de onda entre 800 y 2,500 nanómetros), la energía causa que los enlaces se exciten y vibren de dos formas: acortamiento (alta energía) o doblamiento (baja energía). La cual se puede entender de la siguiente manera: las moléculas son un conjunto de átomos unidos por enlaces y cada enlace vibra a una frecuencia determinada que depende del grupo químico involucrado en él, por lo que la energía de un rayo de luz incidente será absorbida cuando su frecuencia sea idéntica a la frecuencia natural del enlace intermolecular7. Por lo que el arreglo de enlaces químicos de una muestra hace que los espectros sean únicos28. Los enlaces orgánicos (C-H, N-H, O-H) reaccionan en diferentes longitudes de onda: en la región comprendida entre los 1,450 nm y 1,900 nm reaccionan los enlaces O-H; entre los 2,080-2,220 nm y los 1,560-1,670 nm reaccionan los enlaces N-H y entre los 1,100, 1,600, 1,700-1,800, 2,000 y 2,200-2,400 nm los enlaces C-H7,29,30.
Proteína y aminoácidos
Este es el primer trabajo en que se utilizó la tecnología de NIRS para predecir el contenido de proteína y aminoácidos en digesta ileal en cerdos. Los resultados obtenidos muestran que para predecir la composición de la digesta ileal la calibración para proteína cruda es aceptable de acuerdo a los estadísticos R2 0.97, y el valor de RPD 2.11. Estos valores concuerdan con lo indicado por Saeys24, quienes reportan que la calibración para estimar el N de excretas de cerdo tenía una R2= 0.89 y un RPD mayor a 3.0, lo que sugiere que el NIRS puede predecir el contenido de proteína cruda. De acuerdo al estadístico RPD (1.70, 1.31 y 1.57), la predicción de la concentración de lisina y leucina no es confiable, pero la calibración obtenida puede utilizarse para estimar su concentración en la digesta ileal. Sin embargo, en el caso de treonina los resultados no fueron favorables, ya que los valores de calibración y predicción obtenidos y el índice RPD (R2=0.67 y SEP=1.87 y RPD=1.57) sugieren que es una calibración de comportamiento pobre y no recomendable. La baja confiabilidad en la predicción de treonina pudiera deberse a su riqueza en las pérdidas ileales endógenas de proteína ya que la mucina es rica en treonina y la secreción de mucina es modulada por varios factores dietéticos como la fibra y factores antinutricionales31,32, por lo que la concentración de treonina es más variable que la de los aminoácidos lisina y leucina; esta argumentación es apoyada por la capacidad de predicción del contenido de aminoácidos por el NIRS en trigo (213 muestras), cebada (185 muestras) y maíz (258 muestras)33, ya que la variabilidad en el contenido de aminoácidos en ese tipo de muestras es menor que en la digesta ileal. En la calibración en la que se incluyó solo lisina (segunda calibración), se mejoró la predicción, lo cual se atribuyó a que las correlaciones obtenidas solo fueron para ese aminoácido; situación similar a lo reportado por Owens et al34 quienes al predecir más de 20 características del trigo obtuvieron buenas predicciones solamente para algunas, entre ellos proteína. Los resultados del presente trabajo para predecir el contenido de proteína en las heces fueron superiores o iguales a trabajos previos35-38.
El rango de los valores de la proteína cruda en heces de cerdos (45 a 292 g/kg) es mayor a los reportados en trabajos previos35,36,38; este mayor rango es debido a las dietas utilizadas en los trabajos mencionados; por ejemplo, en los trabajos de Bastianelli36 las muestras provinieron de una sola dieta experimental y en este estudio provinieron de varios experimentos y consecuentemente de diferentes dietas. No obstante, la mayor variación en los datos del presente trabajo hace que la calibración obtenida sea más robusta; esto se aprecia en el R2, el cual es superior a los reportados en esos trabajos (0.98 vs 0.84, 0.88 y 0.89)35,36,38) e indica que la calibración fue excelente. De acuerdo a Saeys24 la calibración puede utilizarse para predecir el contenido de proteína cruda de las heces. Lo que se refleja en los resultados del presente estudio ya que el error para predicción en este trabajo fue de 11.9 g/kg valor menor a los reportados en otros estudios. Además, sí se considera que la calibración tiene un valor de 4.15 del estadístico RPD, que es superior al valor de 3 recomendado por Saeys24, lo que indica que la predicción es precisa y confiable.
Energía bruta
La predicción de la energía se logra gracias a las bandas de absorción de los enlaces orgánicos de C-H presentes en las muestras escaneadas y que corresponde a los enlaces presentes en los carbohidratos, lípidos y proteína del alimento. Los carbohidratos presentes en el alimento constituyen la principal fracción de la dieta de los cerdos, y se clasifican en azúcares (mono y disacáridos), oligosacáridos y polisacáridos (almidón y polisacáridos no amiláceos (PNA)). La mayor parte de los disacáridos y del almidón se digieren y absorben en el intestino delgado como lo muestra el trabajo de Reis et al10; mientras que los PNA no son hidrolizados por las enzimas digestivas del cerdo por lo que su degradación la realiza la microflora de ciego y colon a través de la fermentación39.
La fuente de proteína dietaria varia en su contenido de aminoácidos según la fase productiva en que se encuentre el cerdo. Por ejemplo, los lechones consumen principalmente fuentes de origen animal como las proteínas del suero de leche, pescado, plasma animal etc. que son altamente digestibles. Conforme el aparato digestivo del cerdo va madurando las proteínas vegetales (principalmente provenientes de pasta de soya y otras oleaginosas) se van incrementando hasta usar únicamente proteínas vegetales; por lo que su digestibilidad es más variable que la de los carbohidratos o las grasas40. En las muestras de digesta ileal estos enlaces corresponden mayoritariamente a los enlaces no digeridos del alimento consumido, así como a las pérdidas endógenas con las que contribuye el organismo del animal41. Los sustratos que no fueron absorbidos en el intestino delgado llegan al intestino grueso y son fermentados por la microbiota o excretados en las heces42. En el caso de los aminoácidos, estos pueden ser utilizados para la síntesis de proteína microbiana o ser fermentados y utilizados como fuente de energía43. Por lo que los enlaces C-H presentes en las heces corresponden mayoritariamente a los enlaces presentes en la microbiota y a los productos de la fermentación realizada por ella.
Los resultados obtenidos en la calibración para predecir la energía fueron excelentes, el R2 fue de 0.94, lo cual indica una calibración excelente que puede ser utilizada en la predicción del contenido de energía de las heces24. Los resultados del presente estudio concuerdan con otros trabajos37,38. Además, la robustez de la predicción de la energía (RPD de 2.52) significa que es posible hacer predicciones cuantitativas.
Los resultados en la capacidad de predicción del contenido de proteína y energía de las heces son similares a los de Cruz-Conesa44 cuyo objetivo fue desarrollar modelos de predicción para estimar la composición química de heces de tres diferentes especies de aves: pollos de engorda, gallinas de postura y pavos. Estos autores44 reportaron que sus calibraciones explicaban arriba del 93 % de la variación y los RPD fueron superiores a 3.7 por lo que concluyen que el NIRS es capaz de estimar el contenido de proteína y energía de las heces.
Materia seca
La composición química de las muestras es afectada por el sitio de colecta (ileal o fecal), ya que, aunque gran parte del agua es reabsorbida en el intestino delgado el intestino grueso es dónde se termina de deshidratar la digesta45; por lo que las heces tuvieron un mayor contenido de materia seca.
El contenido de humedad de las muestras tiene un impacto directo a la hora de generar el espectro, ya que el agua incrementa la absorción de la luz produciendo una mayor absorción en todo el espectro, por otro lado, las partículas sólidas hacen que la luz sea reflejada disminuyendo la absorción y generan mayores picos. Por ejemplo, la región entre los 1,450 nm y 1,900 nm corresponde a los enlaces químicos de O-H presentes en el agua, por lo que se presentan picos más pronunciados en esta región.
El coeficiente de determinación de la calibración para materia seca R2 fue de 0.87, lo que indica que la calibración es precisa y confiable para determinar el contenido de materia seca en las muestras ileales según Saeys24 con un error de calibración de 8.3 g/kg MS. Por otro lado, el error de predicción fue de 11.5 g/kg y se obtuvo un RPD de 1.78; este valor indica que es posible realizar una aproximación cuantitativa de la materia seca en las muestras de heces24. Los valores relativamente bajos de predicción obtenidos para la materia seca comparados con los valores de proteína y energía se deben a que las muestras escaneadas fueron de experimentos que previamente se habían analizado para determinar la digestibilidad, por lo que las muestras estuvieron almacenadas. Aunque las muestras estuvieron almacenadas correctamente, es posible que se rehidrataron con la humedad ambiente, argumento apoyado por el trabajo de Garnsworthy et al46 quienes al evaluar 156 muestras de grano de trigo y comparar los valores de materia seca obtenidos por el NIRS en las muestras previamente deshidratadas contra los valores de obtenidos en las muestras deshidratadas al momento del escaneo, observaron valores inferiores en las muestras previamente deshidratadas. Otro factor es que la variación del análisis del laboratorio para materia seca fue estrecha (2.48 %); esta variación tan pequeña hace qué al hidratarse las muestras, éstas se salgan fácilmente del rango calibrado afectando los resultados.
Conclusiones e implicaciones
Se concluye que el NIRS puede utilizarse como una herramienta analítica rápida y confiable para predecir el contenido de proteína cruda de la digesta ileal y de proteína cruda y energía de las heces. Para mejorar la estimación del contenido de aminoácidos en DI deben explorarse las posibles causas que afectan la robustez de las calibraciones El uso de NIRS representa una reducción en los costos de los experimentos y menor tiempo para generar los resultados del contenido químico de las muestras.
