Introducción

El factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-1, del inglés insulin-like growth factor I) es el factor de crecimiento conocido más importante para la reparación del cartílago en caballos, ya que estimula la síntesis de proteoglicanos y, por lo tanto, la matriz extracelular (MEC), y promueve la mitosis de los condrocitos. Tiene una importante actividad promotora del crecimiento no solo en el cartílago articular, sino en varios tejidos, principalmente en el músculo, los huesos y el cerebro. Activa la vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK, del inglés mitogen-activated protein kinase), que tiene varios efectos en la promoción de: la supervivencia, crecimiento, proliferación celular, protección contra la hipoxia, regulación de la inflamación en lesiones musculares y en placas de crecimiento óseo^1-4. También tiene un papel clave en el desarrollo del cerebro, junto con el estradiol, regulando una variedad de eventos neuroplásticos y de desarrollo⁵. En estructura, es muy similar a la insulina. Cuando se instila insulina en una articulación, se mejora la expresión de IGF-1 en el líquido sinovial⁶.

Las lesiones del cartílago articular normalmente se reparan por sustitución con fibrocartílago, lo que conduce a la pérdida de la función de la articulación que resulta en osteoartritis (OA)⁷. La cojera es la razón más frecuente por la cual se requieren clínicos equinos por parte de los propietarios de caballos, y la OA representa más del 60 % de todos los casos de cojera en caballos deportivos⁸. El principal problema en la OA es la inflamación, que condiciona un desequilibrio entre catabolismo y anabolismo en el cartílago articular. En este tejido en particular, el único componente celular está constituido por condrocitos, que son responsables de la síntesis de MEC, con el fin de mantener una función adecuada del cartílago.

Existe evidencia con respecto a la eficacia exógena del IGF-1 in vitro, que mejora la síntesis de proteoglicanos mediante condrocitos estimulados. Otras terapias, como el trasplante de condrocitos de condrocitos maduros y neonatales, las estrategias de terapia génica para aumentar la expresión de IGF-1 por condrocitos transfectados, requieren anestesia general, un procedimiento quirúrgico y, por lo tanto, equipo y personal especializado⁹.

En un estudio piloto realizado por los autores en el que se obtuvieron 13 muestras de líquido sinovial de diferentes articulaciones (articulaciones interfalángicas distales, articulaciones metacarpofalángicas, articulaciones del hombro, articulaciones tarsometatarsianas y babillas) de caballos con cojera asociada grado AAEP (American Association of Equine Practitioners): 2/5, sin cambios radiográficos, pero una respuesta positiva en la prueba de flexión de 1 min. Por ELISA, se encontró un aumento significativo de IGF-1 y una correlación positiva entre los niveles de proteína total e IGF-1 en el líquido sinovial (datos no mostrados). En este estudio se obtuvieron muestras de líquido sinovial de 21 caballos con diferentes grados de OA (confirmados por bloqueo intraarticular y cambios radiográficos) en la articulación metacarpofalángica (AMCF), donde el IGF-1 y la proteína total se correlacionaron positivamente en caballos con OA aguda, y negativamente en caballos con OA crónica y marcada remodelación ósea. En caballos con cambios leves o no radiográficos (OA aguda), el IGF-1 se correlacionó negativamente con la interleucina-6 (IL-6) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα, del inglés tumor necrosis factor alpha). Curiosamente, fue posible encontrar por Western blot, al menos dos isoformas funcionales de IGF-1 expresadas en líquido sinovial, una presente solo en caballos de control, y la otra en caballos cojos.

Hasta donde se sabe, no hay información con respecto a las fluctuaciones de IGF-1 en la OA que ocurre de forma natural. No hay estudios in vivo con respecto a los niveles del IGF-1 durante la OA. Tal vez este documento puede ayudar a los clínicos a comprender el papel del IGF-1 para esta condición particular y podría usarse como línea base para estudios adicionales sobre la concentración de IGF-1 y su posible uso como tratamiento alternativo.

Material y métodos

Se obtuvieron muestras de líquido sinovial de caballos Warmblood y Thoroughbred (n=11) de dos disciplinas diferentes: caballos de salto (Warmblood) (n=8) y caballos de carrera (Thoroughbred) (n=3) con una edad media de 10.5 años y un peso medio de 520 kg. Las muestras de control (Ctrl) se obtuvieron de dos caballos castrados, Warmblood de 5 y 7 años. No había más caballos de control disponibles para el estudio, ya que todos estaban sanos, no fue fácil obtener el consentimiento de los propietarios para tomar muestras de sus articulaciones. Se realizó una evaluación completa de cojera y una evaluación radiográfica en todos los caballos de control para ser incluidos en este estudio. Ninguno de ellos mostró signos de cojera en las extremidades delanteras y fueron negativos a las pruebas de flexión pasiva y activa (30 seg). Además, ninguno de ellos presentó cambios radiográficos asociados con patología articular en la articulación metacarpofalángica.

Resultados

Se examinó un total de 45 caballos, de los cuales solo se incluyeron 11 caballos (22 muestras) en este estudio y 2 caballos (4 muestras) como testigos. Todos los caballos variaron entre sí en grados de cojera y cambios radiográficos, y todos respondieron positivamente a la prueba de flexión digital, bloqueo de 4 puntos bajos y bloqueo intraarticular (IA) de la articulación del menudillo. Seis articulaciones se calificaron como grado I, cinco articulaciones se calificaron como grado II y 8 articulaciones fueron grado III (Figura 1).

Grado 1 (A) Vista latero-medial con una irregularidad leve del aspecto proximal-dorsal de la cresta sagital (flecha); Grado II (B) Vista oblicua palmaro-medial dorsolateral con un osteofito visible en el aspecto dorso-medial proximal de P1 (flecha); y Grado III (C) Vista dorso-palmar donde un quiste óseo subcondral en el aspecto proximal de la primera falange en el surco sagital con áreas de esclerosis ósea (flecha).

Figura 1 Radiografías representativas de caballos calificados con varios grados 

Concentración de IGF-1

Todos los caballos con dolor asociado a las articulaciones, cojera y menos cambios radiográficos, mostraron un aumento significativo de la concentración de IGF-1 (P<0.05) (Figura 2). Todas las muestras se repitieron por pares y se leyeron tres veces en un período de 5, 10 y 15 min sin diferencia entre las mediciones (datos no mostrados) y los valores de regresión lineal y curva estándar fueron: P<0.001; r²=0.9931.

Figura 2 A) Determinación de IGF-1 entre caballos de control (sanos) y cojos, que muestra una diferencia significativa (P<0.05)*. B) Las concentraciones de IL-6 entre los controles y los caballos cojos también mostraron una diferencia significativa (P<0.01)**. C) Concentraciones de TNFα entre los controles y los caballos cojos que muestran diferencias significativas en la concentración (P<0.001)***. 

Análisis de Western blot

Los caballos con menos cambios radiográficos demostraron una mayor concentración de IGF-1 en concordancia con los resultados de ELISA para IGF-1 (Grado I y II). Los caballos con cambios radiográficos más severos y un estado crónico de la condición patológica (Grado III) fueron los que tuvieron las concentraciones más bajas de IGF-1 tanto en ELISA como en el análisis WB. Curiosamente, con este análisis se pudo identificar en todas las muestras dos bandas diferentes, una de ~12 kDa que se observó solo en caballos testigos (normales) sin patología articular, y otra de ~7.5 kDa vista en todos los caballos cojos (Figura 3).

1: Marcador de proteínas (marcando 10 kDa); 2: Muestras de un caballo testigo y un caballo con OA; 3: Caballo testigo; 4 y 5: Dos muestras diferentes de caballos con OA.

Figura 3: Fotografía representativa del análisis Western blot para IGF-1, demostrando una diferencia de peso molecular entre muestras de líquido sinovial que indica la existencia de dos isoformas diferentes presentes en articulaciones normales y durante un proceso inflamatorio 

Discusión

Los caballos deportivos están expuestos a cargas excesivas en sus articulaciones y estructuras de tejidos blandos. La articulación que puede experimentar OA traumática depende de la disciplina en la que se desempeñe el caballo. Existe evidencia con respecto a intervenciones como las inyecciones articulares en las fases agudas de la enfermedad que pueden ayudar a modificar su curso y prevenir daños mayores mientras el caballo todavía está desempeñándose¹².

Las cargas de impacto debidas al ejercicio son las responsables de dañar el cartílago articular al agrietar primero la superficie, y dependiendo de la fuerza aplicada y del tiempo que se esté aplicando, se produce la profundidad y, por tanto, la severidad del desarrollo de la enfermedad (OA). Se ha comprobado que la caracterización de las consecuencias mecánicas de las lesiones por impacto en el cartílago articular desarrolla daños, al estresar continua y directamente las estructuras articulares¹³.

Cuando se produce inflamación, los condrocitos migran al sitio de la lesión en un intento de regenerar el defecto formando grupos de células o clústeres con la capacidad de sintetizar MEC de novo. Dado que el componente celular (condrocitos) del cartílago articular es solo el 1-2 % de todo el tejido, no pueden reparar el área dañada, porque su capacidad para sintetizar la MEC es superada por la actividad de la metaloproteasas de la matriz (MMP, del inglés matrix metalloprotease) que degrada la MEC ya dañada agravando la condición al aumentar la necrosis y activando la inflamación local mediante la liberación de componentes intracelulares que actúan como patrones moleculares asociados al daño (DAMP, del inglés damage-associated molecular patterns) y citoquinas proinflamatorias como prostaglandinas (PG), óxido nitroso (NO), interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) y sustancia P. Particularmente, el TNFα inhibe la expresión de IGF-1 al aumentar el catabolismo de MEC y bloquear la vía AKT a través de la activación de la vía JNK. Si el defecto del cartílago llega al hueso subcondral, el cartílago se repara formando un cartílago articular de baja calidad llamado fibrocartílago^2,4,7.

Los factores que contribuyen a la cascada de inflamación, aparte de las citoquinas, incluyen vesículas extracelulares, que desempeñan un papel importante en la promoción de la inflamación articular y también están involucradas en la apoptosis y la degradación de la MEC. Estas vesículas son exosomas, microvesículas y vesículas apoptóticas, que son liberadas a la cavidad articular (en el líquido sinovial), y tienen una relación íntima con la comunicación célula-célula durante el proceso inflamatorio^7,8,14.

El objetivo de este estudio fue comparar la concentración de IGF-1 en el líquido sinovial de caballos sanos (testigo) y caballos con diferentes grados de cojera y patología articular (OA) en la AMCF. Se planteó la hipótesis de que entre más severas y crónicas fueran las condiciones de la articulación, se encontrarían niveles más altos de IGF-1 en el líquido sinovial, debido a que la alta demanda de la articulación para reparar el defecto era mayor que en los caballos con cambios leves. La razón detrás de la hipótesis era: que, todavía no había datos disponibles con respecto a las concentraciones de IGF-1 y su correlación con una condición clínica particular en caballos, por lo que se realizó un estudio piloto, donde se recolectaron un total de 13 muestras de líquido sinovial de diferentes articulaciones de diferentes caballos. Todos estos caballos eran caballos saltadores de alto rendimiento con una prueba de flexión positiva de las articulaciones muestreadas (no se realizó ninguna evaluación radiográfica en ninguno de estos caballos). Lo que se encontró fue un aumento significativo de la proteína total, con una correlación positiva (correlación de Pearson, P=0.0229) en los niveles de IGF-1 en el líquido sinovial en comparación con las muestras de testigo (líquido sinovial obtenido de caballos sanos). Esto dio suficiente información para plantear la hipótesis de que los caballos con signos clínicos más severos y una patología articular más crónica tendrían niveles más altos de IGF-1 en comparación con los caballos testigo.

Curiosamente, con los resultados obtenidos, esta hipótesis fue refutada. Se encontró que los caballos con cambios radiográficos más severos y, por lo tanto, las condiciones inflamatorias dentro de la articulación más crónicas fueron los que demostraron una disminución en las concentraciones de IGF-1, muy similar a la que tenían los caballos testigo.

Se observaron resultados similares en estudios en los que las lesiones inducidas experimentalmente en el cartílago articular en caballos producen un pico agudo de expresión de ARNm de igf-1, y a las cuatro semanas tienden a disminuir. Cuando el IGF-1 disminuye, predomina el TGF-β y es responsable de la formación de hueso nuevo y la activación de linfocitos quiescentes a Th17⁷.

El factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) equino ha sido ampliamente estudiado, existen varios estudios donde su importancia en la proliferación, crecimiento y supervivencia celular, reparación y producción de matriz extracelular está bien documentada, aunque no hay suficientes estudios sobre las diferentes isoformas y su funcionalidad¹⁵. Se sabe que el ARNm sufre modificaciones postranscripcionales (empalme alternativo) lo que genera diferentes isoformas junto con modificaciones postraduccionales. Los propéptidos IGF-1 están codificados por múltiples transcripciones empalmadas alternativamente, incluyendo los péptidos de extensión C-terminal llamados péptidos E y los péptidos señal N-terminal. Cuando una proteína inmadura tiene péptido señal, el péptido maduro y el péptido E se llama pre-proIGF-1, y cuando el péptido señal se elimina dejando solo el péptido maduro y el péptido E, se llama pro-IGF-1. Estos péptidos E controlan la biodisponibilidad del IGF-1 maduro, al unirse a la MEC debido a su carga altamente positiva, impidiendo su circulación sistémica y, por lo tanto, su uso local. También modulan la reentrada de IGF-1 maduro a la célula en una línea celular del músculo murino¹.

En humanos, se han identificado tres isoformas diferentes de IGF-1 [IGF-1Ea, IGF-1Eb e IGF-1Ec, también conocido como factor de crecimiento mecano o MGF (del inglés mecano-growth factor)], y se ha propuesto que tienen diversas funciones en la reparación muscular¹⁶.

Nixon et al¹⁷ describieron el gen igf1 que consiste en 5 exones con 4 secuencias de intrones, que sufren modificaciones postranscripcionales y postraslacionales, donde las proteínas traducidas resultantes del empalme alternativo del exón 4 forman una transcripción de propéptidos más pequeña (105 aminoácidos) llamada Pre-proIGF-1A que consiste en péptido señal (codificado por los exones 1 y 2), péptido maduro (codificado por los exones 2 y 3), y un péptido E C-terminal (codificado por los exones 3 y 5); y cuando el exón 4 no se empalma alternativamente, se traduce una transcripción más grande formando Pre-proIGF1B (111 aminoácidos)¹⁷. Hasta donde se sabe, éste fue el último trabajo de investigación publicado sobre modificaciones postranscripcionales y postraslacionales y empalme alternativo de ARNm de IGF-1 en caballos. Se realizó un análisis bioinformático del gen igf1 sometido a diferentes tipos de empalme alternativo, que según Le et al¹⁸ son: salto de exón, retención de intrones, exones mutuamente excluyentes y sitios alternativos donante 5’ o aceptor 3’. Este análisis reveló que el ARNm de IGF-1 consistía no de 5, sino de 4 exones y 3 intrones, que los transcriptos forman 4 isoformas: variante 1 (exones 1-3), variante 2 (exones 2 y 3), variante 3 (exones 1-3, una retención de intrones de 93 pb y el exón 4) y variante 4 (exones 2-4)¹⁸.

El análisis de Western blot demostró la presencia de al menos dos isoformas funcionales diferentes de IGF-1, donde la observada en todos los caballos normales es más pesada (~ 12 kDa) que la observada en todos los caballos con diferentes grados de OA (7.5 kDa). Probablemente la más ligera es la forma madura de IGF-1, aunque las técnicas de secuenciación de aminoácidos deben llevarse a cabo para confirmar esta afirmación. Con este resultado, se puede suponer que la expresión de estas dos diferentes isoformas funcionales depende de la inflamación.

Esto podría conducir a una nueva línea de investigación que puede enfocarse en determinar mediante técnicas avanzadas de secuenciación las isoformas exactas de IGF-1, y en apuntar a la sobreexpresión de la isoforma que no está presente cuando hay un proceso inflamatorio de la articulación, y su papel en la reparación de defectos del cartílago.

El cartílago articular no se regenera por sí mismo, ya que es el único tejido conectivo en mamíferos que no tiene ni vasos sanguíneos y linfáticos, ni nervios¹⁹. Por lo tanto, es prácticamente imposible regenerarse después de una lesión, por lo que se repara mediante sustitución con tejido fibroso, lo que genera un cartílago fibroso de baja calidad llamado fibrocartílago. Ha habido varios tratamientos para mejorar la regeneración del cartílago, en humanos, el trasplante de aloinjerto osteocondral ha demostrado ser eficaz en la mejora de la función y la reparación general con la supervivencia del injerto de hasta el 80 % de los pacientes que se habían sometido a tratamiento quirúrgico previo: microfractura, desbridamiento del cartílago, forage, condroplastia de abrasión, injertos osteocondrales y periósticos, reinserción de colgajo del cartílago, entre otros^7,17,20.

Los anestésicos locales y los esteroides han sido ampliamente utilizados por los practicantes en el campo, por razones diagnósticas y terapéuticas respectivamente. Sin embargo, se ha demostrado que el uso excesivo de estos componentes daña el cartílago articular. La inyección intraarticular que utiliza anestésicos locales y esteroides ha generado una creciente preocupación sobre la inducción de toxicidad potencial para los condrocitos y sinoviocitos. Sherman et al²¹ realizaron una comparación interesante de lidocaína, bupivacaína, acetato de betametasona, acetato de metilprednisolona y acetónido de triamcinolona en un modelo canino. Encontraron que in vitro, lidocaína al 1 y 0.5 %, bupivacaína al 0.2 y 0.25 %, acetato de betametasona y acetato de metilprednisolona fueron severamente condrotóxicos y sinoviotóxicos en comparación con bupivacaína y triamcinolona al 0.625 %²¹.

Conclusiones e implicaciones

Por esta razón, en cuanto al tratamiento, el objetivo principal es tener alternativas que puedan ser utilizadas en campo por los médicos, que puedan proporcionar una alternativa distinta a los esteroides que también pueda mejorar la reparación del cartílago sin la necesidad de poner al caballo bajo anestesia general, y aun así tener un efecto que conduzca a que los caballos tengan una carrera deportiva duradera. Este artículo proporciona información importante que puede servir como base para futuras investigaciones sobre las isoformas de IGF-1 y su papel en la reparación del cartílago.