Elaboración de los extractos

Se elaboraron un total de tres extractos considerados como tratamientos #1 (200 g de cebolla, 20 g de cilantro, 15 g de orégano), #2 (200 g de cebolla, 20 g de cilantro, 15 g de hojas de laurel) y #3 [200 g de cebolla, 20 g de cilantro, 2 g de pimienta negra, 18 g de chile verde, 14 g de ajo, 6 g de sal, 8 g de cálices de jamaica verde (variedad UAN-4) con las distintas especias culinarias, más 50 ml de una bina base y 75 ml de jugo de limón]. Su preparación consistió en moler a la vez cada uno de los ingredientes con la ayuda de una licuadora convencional hasta obtener una consistencia pastosa. Posteriormente, la pasta se colocó en tubos Falcón de 50 ml para su centrifugación (5,000 rpm, 5 min). El sobrenadante fue utilizado como el extracto para mezclarse con la carne que se utilizó para la elaboración de sistemas modelo.

Elaboración de la bina base

La elaboración de la bina base consistió en macerar 5 g de canela y 5 g de clavo en polvo (por separado) en 10 ml de ron (40 % de alcohol) durante 24 h. El sobrenadante obtenido de las dos maceraciones se mezcló para formar así la bina base.

Elaboración de sistemas modelo tipo hamburguesa

Se desarrollaron sistemas modelo tipo hamburguesa compuestos por el 80 % de carne de cerdo (músculo Longissimus thoracis et lomborum), 10 % de grasa dorsal, 1 % de sal, 9 % de agua (para las hamburguesas control), y 4.5 % de agua y 4.5 % del extracto en las hamburguesas tratadas. La elaboración de las hamburguesas consistió en moler la carne y la grasa en un molino para carne con criba de 1/8" (marca Torrey®, modelo M12-FS), una vez molida la carne, se mezcló la sal, el agua y el extracto (si es que aplica) hasta obtener una mezcla homogénea. La mezcla se envasó al alto vacío para eliminar las burbujas de aire internas que se pudieran formar. A partir de la mezcla, se pesaron porciones de 60 g y con la ayuda de un aro metálico de 8 cm de diámetro, se elaboraron los sistemas modelo tipo hamburguesa. Las hamburguesas fueron previamente cocinadas a la plancha a una temperatura de 230 °C durante 5 min por cada lado en una parrilla marca Oster Bioceramic®.

A partir de cada tratamiento (sin extracto, extracto #1, #2 y #3), se elaboraron los sistemas modelo tipo hamburguesa (tres replicas por tratamiento y por cada día de muestreo) para evaluar la estabilidad oxidativa del color, lípidos y proteínas. Las hamburguesas fueron depositadas en bandejas de poliestireno y cubiertas con papel film transparente permeable al oxígeno (14µm de grosor y 10,445 ml/m²/24 h) y almacenadas en refrigeración a 4 ± 2 °C con luz blanca fluorescente (1,620 lux) las 24 h. Los muestreos se realizaron los días 0, 3, 6, 9 y 12.

Determinación de acción antioxidante

Los compuestos fenólicos totales se determinaron por el método de Stintzing et al¹³. La actividad antioxidante con base en el método 1,1-difenil-2-picrilhidracil (DPPH) se evaluó de acuerdo al procedimiento reportado por Morales y Jiménez-Pérez¹⁴. La actividad antioxidante con base en el método del ABTS+ se evaluó de acuerdo al procedimiento desarrollado por Kuskoski et al¹⁵. La técnica de TBA-RS (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico) se evaluó de acuerdo a la técnica descrita por Ganhão et al¹⁶ que permite la determinación cuantitativa de metabolitos secundarios de la oxidación de los lípidos. La determinación del total de carbonilos que se van generando durante los procesos oxidativos de las proteínas cárnicas se basó en la técnica de DNPH descrita por Ganhão et al¹⁷.

Evaluación de color de las hamburguesas

Para determinar el deterioro del color de la carne por almacenamiento a lo largo del tiempo, se realizaron evaluaciones de color por medición instrumental¹⁸en la superficie de las hamburguesas tratadas con los extractos, durante los días de almacenamiento. Se utilizó un colorímetro marca Minolta® modelo CR-410. Las mediciones se realizaron en tres zonas distintas elegidas aleatoriamente y a temperatura ambiente (≈ 25 °C). Se utilizó el sistema de medida de color CIE-L*a*b* y se calculó el ángulo Hue (°h) (tono) como lo indican García-Tejeda et al¹⁹: °h=tan-1(b*/a*), cuando a*>0 y b*≥0 o °h=180 + tan-1 (b*/a*) cuando a*<0.

La diferencia total de color (ΔE) se calculó para evaluar los cambios de color total sufrido en las hamburguesas como resultado de los días de almacenamiento en refrigeración. Por lo tanto, ΔEC-T se calculó entre las muestras del grupo control (C) y el grupo tratado (T) utilizando la escala de color CIE-L*a*b* para cada día de medición de la siguiente manera:

Análisis sensorial

Para la evaluación sensorial, cada hamburguesa cocinada bajo las condiciones descritas anteriormente, se cortó en cuatro partes para ofrecerla a un panel no entrenado de 35 personas. Se les indicó a los panelistas que evaluaran los atributos de olor, color, sabor y textura, marcando con una “X” la calificación que consideraron oportuna asignarle a cada muestra, empleando para ello un test hedónico²⁰con escala de siete puntos donde el valor de 1 correspondió a “me disgusta muchísimo”, el 2 a “me disgusta mucho”, el 3 a “me disgusta poco”, el 4 a “ni me gusta ni me disgusta”, el 5 a “me gusta poco”, el 6 a “me gusta mucho” y el 7 a “me gusta muchísimo”.

Análisis estadístico

Los datos del contenido de CFT, actividad antioxidante, determinación de color e inhibición de la oxidación de lípidos y proteínas se procesaron mediante un análisis de varianza bajo un diseño completamente al azar. Cuando el análisis fue significativo (P≤0.05) se realizó una prueba de comparación de medias de Tukey. Los resultados de diferencia total de color y análisis sensorial se realizaron mediante la prueba de Hipótesis de Kruskal-Wallis (P≤0.05). Se calcularon coeficientes de correlación de Pearson para establecer asociaciones lineales entre variables de interés. El paquete estadístico utilizado fue Minitab v.16.0.

Contenido de compuestos fenólicos totales y actividad antioxidante

Los tres extractos elaborados presentaron alto contenido de CFT (Figura 1) y buena actividad antioxidante determinada por el método DPPH (Figura 2) y ABTS+. La prueba de ABTS+, mostró el mismo comportamiento de actividad antioxidante que con la técnica de DPPH. Al analizar el CFT se puede observar que los extractos #2 y #3 fueron los que presentaron el mayor contenido de CFT y la mayor actividad antioxidante se observa con el tratamiento #2, seguido por el tratamiento #3. Esto se puede deber principalmente a los ingredientes que diferencian a cada uno de estos dos extractos, principalmente se puede atribuir la mayor actividad antioxidante a los derivados de catequina y procianidinas (cinamatanino B₁) y heterosidos flavónicos derivados del kenferol que han sido reportados como mayoritarios en las hojas de laurel presentes en el extracto #2²¹y al ácido clorogénico y sus isómeros, ácido cafeico y los derivados del ácido protocatéquico reportados como los mayoritarios y con alta actividad antioxidante en los cálices de jamaica verde en el extracto #3²². Dichos ingredientes pudieron ejercer un mayor efecto sinérgico con el resto de las especias, potencializando su actividad antioxidante. Hasta el momento no se ha reportado el uso de cálices de jamaica verde para inhibir la oxidación de lípidos y proteínas pero su actividad antioxidante ya ha sido reportada²³.

Figura 1 Contenido de compuestos fenólicos totales de tres extractos 

^abc Medias con superíndice distinto denotan diferencia significativa (P<0.05).

Figura 2 Actividad antioxidante por el método DPPH^● de tres extractos 

Los extractos elaborados presentaron una correlación significativa (P≤0.05) entre CFT y actividad antioxidante por el método DPPH y ABTS+ de r= 0.798 y 0.751 respectivamente. Por lo que, se puede decir de acuerdo a este análisis que la actividad antioxidante de los extractos está en función de los compuestos fenólicos totales.

Determinación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico

Los resultados de TBA-RS (Figura 3) presentaron diferencia significativa (P≤0.05) entre las muestras. Los tres extractos fueron capaces de disminuir la concentración de malonaldehído (MDA) con respecto a las hamburguesas sin extracto a lo largo de los 12 días de almacenamiento, siendo los extractos #1 y #2 los que lograron de manera significativa un mejor efecto en relación al extracto #3.

^abc Medias con superíndice distinto denotan diferencia significativa (P<0.05).

Figura 3 Efecto de los extractos sobre la concentración de MDA de las hamburguesas de carne de cerdo cocinada y almacenada a 4 °C durante 12 días 

Los valores de TBA-RS por encima de 0.5 mg MDA/kg de muestra son críticos, ya que indican un nivel de productos de oxidación de lípidos que producen un olor y sabor rancio que puede ser fácilmente detectado por los consumidores²⁴. Este nivel de rancidez se alcanzó después de la cocción en las hamburguesas sin extracto, aumentando sus valores durante el posterior almacenamiento refrigerado, indicando con ello que el proceso de cocción puede ser capaz de acelerar las velocidades de oxidación de lípidos.

La intensa actividad antioxidante mostrada por los extractos en los ensayos in vitro (Figura 2) supuso un efecto protector de los extractos de forma eficiente sobre los lípidos en productos cárnicos reales. Otros autores^12,25 han obtenido resultados similares, logrando reducir la concentración de TBA-RS al utilizar cebolla y ajo en carne de cerdo, así como tocoferoles y ácido ascórbico en paté de hígado de pollo. Sin embargo, son pocos los estudios que han intentado demostrar la eficacia de las mezclas de antioxidantes naturales contra la oxidación de lípidos²⁶. En uno de ellos¹¹, utilizaron una mezcla de aceites esenciales de ajo, canela, clavo y romero, y obtuvieron resultados favorables al inhibir la oxidación de lípidos en jamones ibéricos. Algunas sustancias como el MDA, han sido reportadas como compuestos con potencial tóxico y mutagénico para el ser humano²⁷. Por lo que, los extractos #1, #2 y #3 pueden ser una estrategia eficiente para evitar el aumento de los efectos adversos causados por la oxidación de los lípidos en hamburguesas de carne de cerdo cocinadas.

Determinación del total de carbonilos de proteína

Los resultados de carbonilos en hamburguesas cocinadas (Figura 4) presentaron diferencia significativa (P≤0.05) entre las muestras únicamente en el día 6 de almacenamiento, mostrando una reducción de carbonilos los extractos #1 y #2 con respecto a las hamburguesas sin extracto. Sin embargo, este efecto no fue eficaz en los demás días de muestreo. Por lo que podría considerarse que ninguno de los tres extractos aplicados logró una eficiente acción inhibitoria sobre la oxidación de proteínas en hamburguesas cocinadas. Se sabe que el aumento de la susceptibilidad de las carnes cocidas a la carbonilación de proteínas, se pude atribuir a la disrupción de los tejidos miofibrilares como resultado de las altas temperaturas, que a su vez conduce a la liberación de hierro no hemo (no proteico) y a una mayor incorporación de oxígeno al sistema. El hierro no hemo ha sido reconocido como un promotor principal de la formación de restos de carbonilo a partir de proteínas miofibrilares²⁸. En comparación con los resultados del presente estudio, otros investigadores²⁹ encontraron de igual forma niveles altos de carbonilos proteicos en carne de cerdo sometida a cocción y un posterior almacenamiento en frío, lo que pone de manifiesto el impacto de las altas temperaturas sobre la estabilidad oxidativa de las proteínas musculares.

^abc Medias con superíndice distinto denotan diferencia significativa (P<0.05).

Figura 4 Efecto de los extractos sobre la concentración de carbonilos de las hamburguesas de carne de cerdo cocinada y almacenada a 4 °C durante 12 días 

De acuerdo con los resultados del presente estudio, otros autores también han informado que ciertas estrategias antioxidantes con eficacia probada frente a la oxidación de lípidos no fueron eficaces contra la oxidación de proteínas³⁰.

Por otra parte, se sabe que la formación de la oxidación lipídica en los sistemas cárnicos tiene lugar más rápidamente que la degradación oxidativa de las proteínas miofibrilares³¹. La correlación positiva (r=0.560; P=0.000) encontrada en el presente estudio entre la oxidación proteica y lipídica en hamburguesas cocinadas, apoya la teoría de que la oxidación de lípidos y proteínas están acoplados en los sistemas cárnicos alimentarios. De hecho, algunas investigaciones han reportado dicha interacción entre lípidos y proteínas^32,33, lo cual apoya la teoría de que las especies reactivas de oxígeno (ROS) formadas durante las primeras etapas de la oxidación de lípidos, pueden unirse a residuos de aminoácidos susceptibles para desencadenar su degradación oxidativa³⁴. En contraste con los resultados de la oxidación lipídica, las diferencias entre los tratamientos con respecto a la oxidación proteica no fueron tan claros posiblemente debido a la composición estructural compleja de las proteínas que le llega a brindar cierta protección y su degradación no sigue un patrón lógico, lo que coincide con otros autores^35,36.

Evaluación de color

Los resultados del parámetro de luminosidad (Figura 5) señala una ligera pérdida de brillantez para todas las muestras, pues los valores entre ellas presentaron una diferencia menor a 3 puntos que osciló desde 72.44 hasta 69.67 durante los 12 días de almacenamiento, presentándose diferencia significativa (P≤0.05) entre las muestras durante los tres primeros días de almacenamiento, donde las hamburguesas con extracto presentaron una mayor luminosidad con respecto a las hamburguesas sin él. Sin embargo, al final del período de almacenamiento (día 12) todas las hamburguesas con extracto perdieron luminosidad de manera significativa (P≤0.05) con respecto a las hamburguesas sin extracto.

^abc Medias con superíndice distinto denotan diferencia significativa (P<0.05).

Figura 5 Efecto de los extractos sobre la luminosidad o brillantez de las hamburguesas de carne de cerdo cocinada y almacenada a 4 °C durante 12 días 

Para los valores obtenidos del ángulo Hue (Figura 6), puede observarse que la adición de los extractos estudiados tuvo un efecto significativo (P<0.05) con respecto a las hamburguesas sin extracto, ya que los extractos tenían un color naranja tenue con ligeros toques cafés como resultado de la extracción de pigmentos de las especias y la bina base utilizada. Los pigmentos se transfirieron probablemente a las hamburguesas durante su elaboración, provocando la modificación de su color e intensificándolo tras el proceso de cocción, ocasionando así una coloración café con ligeros toques dorados, o en otras palabras una tonalidad tostada. Durante el día inicial de almacenamiento, las hamburguesas sin extracto presentaron significativamente (P≤0.05) una menor tonalidad café o tostada. Durante el tercer día de almacenamiento las hamburguesas sin extracto igualaron el color con respecto a las hamburguesas tratadas. Sin embargo, a partir del día 6 de almacenamiento las hamburguesas sin extracto aumentaron significativamente (P≤0.05) el valor de ángulo Hue destacando una tendencia a la alza y presentando una tonalidad amarilla con toques verdosos con respecto a las hamburguesas con extractos. Se destaca que las hamburguesas con extracto #1 protegen mejor la coloración tostada a lo largo de los 12 días de almacenamiento.

^abcd Medias con superíndice distinto denotan diferencia significativa (P<0.05).

Figura 6 Efecto de los extractos sobre el color de las hamburguesas de carne de cerdo cocinada y almacenada a 4 °C durante 12 días 

La protección dada por parte de los extractos, puede deberse a su defensa antioxidante; los cuales, pueden ser los responsables de proteger a los hemopigmentos contra los procesos oxidativos en las hamburguesas cocinadas, lo cual se confirma con la correlación significativa de r=0.690 (P=0.001) entre color y oxidación de lípidos. Es decir, los compuestos bioactivos presentes en los extractos posiblemente pudieron inhibir la formación de los productos de oxidación de lípidos primarios (principalmente hidroperóxidos), los cuales oxidan el hierro ferroso (Fe2+) de la oximioglobina a su forma férrica (Fe3+) presente en metamioglobina (responsable de la decoloración)³⁷, inhibiendo así la decoloración de las hamburguesas.

En el Cuadro 1 se muestra la diferencia numérica total de color (ΔE) entre las hamburguesas sin extracto y las hamburguesas tratadas (con extracto #1, #2 y #3) durante los días 0, 3, 6, 9 y 12 de almacenamiento refrigerado. Según algunos autores³⁸, las modificaciones de color medidas instrumentalmente entre dos muestras de carne dadas se pueden considerar como cambios visuales notables cuando los valores de ΔE son superiores a 2. En el caso de las hamburguesas cocinadas se encontró una ΔE mayor a 2 para las hamburguesas con extracto #1 en el día 12 de almacenamiento. Sin embargo, estadísticamente se presentó diferencia significativa (P≤0.05) en el ΔE entre las hamburguesas tratadas a partir del día 3 de almacenamiento, donde las hamburguesas con extracto #1 presentaron el mayor diferencial de color durante los días 6, 9 y 12 de almacenamiento. Esto coincide con los resultados obtenidos del ángulo Hue de las hamburguesas cocinadas, donde a partir del día 6 de almacenamiento todas las hamburguesas con extracto presentaron diferencia significativa con respecto a las hamburguesas sin él, siendo precisamente las hamburguesas con extracto #1 las que presentaron la mayor diferencia. Es decir, el extracto #1 mostró mayor eficacia de manera significativa (P≤ 0.05) para conservar el color tostado de las hamburguesas cocinadas a lo largo de los 12 días de almacenamiento.

Análisis sensorial

Los resultados de la evaluación sensorial (Figura 7) señalan que, en relación a los atributos de olor y color, no se presentó diferencia significativa (P˃0.05) entre los tratamientos, es decir la aplicación de los extractos no modificó perceptivamente ni el olor ni el color propio de una carne cocinada. En la evaluación correspondiente al atributo de sabor se presentaron diferencias significativas (P≤0.05) entre las distintas fuentes de variación utilizadas en el diseño experimental, siendo las hamburguesas con extracto #3 las que presentaron mayor preferencia entre los panelistas, superando a las hamburguesas sin extracto, mientras que la de menor aceptación fueron las hamburguesas con extracto #1. Referente al atributo de textura, se presentaron diferencias estadísticas significativas entre tratamientos, siendo las hamburguesas adicionadas con el extracto #3, las que mostraron mayor aceptabilidad para dicho atributo e igualando la textura de las hamburguesas que no lo llevaban. Mientras que las hamburguesas que fueron adicionadas con el extracto #1 fueron las que tuvieron menor aceptación entre los catadores. En general, la adición de los tres extractos a las hamburguesas, no tuvieron un efecto negativo en la preferencia de los catadores, ya que los resultados de los cuatro atributos (olor, color, sabor y textura) evaluados estuvieron en la escala de 4 a 6, que va desde “ni me gusta ni me disgusta” hasta “me gusta mucho”, destacando la preferencia por las hamburguesas con extracto #3 entre los comensales.

Figura 7 Evaluación sensorial de los atributos de olor, color, textura y sabor de las hamburguesas de carne de cerdo cocinada