El síndrome reproductivo y respiratorio porcino (SRRP) es una enfermedad causada por un virus ARN, con dos genotipos conocidos actualmente: 1 (europeo) y 2 (americano)¹. Se transmite fácilmente por saliva, secreciones nasales, orina, semen, leche y calostro². Produce fallo reproductivo, lechones nacidos débiles y enfermedades respiratorias³. La principal vía de introducción del virus SRRP (VSRRP) en países previamente libres es a través de movimientos de cerdos y con la introducción de semen; por lo tanto, deben establecerse protocolos para reducir el riesgo⁴. Cuando se introduce por primera vez en un rebaño inmunológicamente ingenuo, el virus se propaga a cerdos de todas las edades en aproximadamente 2 a 3 semanas², con tasas de mortalidad de hasta 69 % en cerdos de destete⁵. Las pruebas diagnósticas comerciales más comunes son ELISA⁶ y en los últimos años, las técnicas moleculares, en particular la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa en tiempo real (qRT-PCR)⁷.

En México, el VSRRP se describió por primera vez en 1994 con una prevalencia serológica de 8.1 % en cerdos importados de Estados Unidos y Canadá⁸. Desde 2002, se ha reportado la presencia de múltiples variantes del VSRRP genotipo 2 (VSRRP-2) dentro de granjas porcinas en todo Sonora^9-10, estado vecino de Baja California (Baja), y el segundo mayor productor de carne de cerdo en México. Por su parte, en Baja, la mayor producción de carne de cerdo proviene de pequeños productores de traspatio, con instalaciones hechas básicamente de materiales rústicos, con las mismas áreas utilizadas para las diferentes etapas de producción; generalmente alimentados con desechos y otros subproductos de desperdicio de alimentos; por lo general, sin programas de medicina preventiva o asesoramiento veterinario y, en la mayoría de los casos, ni siquiera con prácticas de higiene adecuadas.

El objetivo principal de este estudio fue evaluar la presencia del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino genotipo 2 en las regiones productoras de carne de cerdo más representativas de Baja California, México, además de la estandarización de la prueba qRT-PCR para esta enfermedad.

El estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal, que está representado por el Grupo Académico de Salud Animal y el Grupo Académico de Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas, ambos son parte del Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias. Los propietarios de los cerdos utilizados en esta investigación fueron informados sobre el estudio y dieron su consentimiento.

Se realizó un estudio transversal en 26 granjas dentro de seis regiones de Baja: Ensenada, Mexicali, Tecate y Tijuana, así como en los valles de Mexicali y San Quintín. Las granjas fueron seleccionadas de una base de datos de la Asociación de Criadores de Cerdos de Baja California e invitadas a participar de acuerdo con su proximidad y el tamaño del rebaño. Solo se visitó a aquellos que estaban interesados. La estimación del tamaño de la muestra se realizó para la detección de una enfermedad¹¹, considerando una población estatal porcina de 10,315¹², una sensibilidad diagnóstica del 99.5 %, una prevalencia esperada del 4 % y un nivel de confianza del 95 %.

Donde, n= tamaño de la muestra; N= tamaño de la población; E= número de enfermos; α= nivel de confianza; Se= sensibilidad de la prueba.

En consecuencia, se necesitó un tamaño de muestra de al menos 74; sin embargo, se pudo recolectar un total de 97 muestras de sangre de la vena yugular de verracos y cerdas aparentemente sanos que no participaron en la vacunación contra el VSRRP. Se utilizaron tubos estériles Vacutainer^® con anticoagulante EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.). Las muestras fueron transportadas al Laboratorio de Biología Molecular del Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias, después se separaron 200-300 μl de la capa leucocitaria en tubos estériles para la extracción de ARN. La extracción de ARN se realizó utilizando el Kit de tejido graso y fibroso de ARN total Aurum^TM (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se reconstituyó a un volumen final de 30 μL de elución preparada. El ARN se almacenó a -70 °C hasta que se realizó la prueba qRT-PCR.

Los iniciadores RT-PCR fueron diseñados para amplificar un fragmento con una longitud de 87 pb del gen de la nucleocápside contenido dentro del marco de lectura abierto 7 (ORF7) de VSRRP-2 (GenBank AF494042.1), ya que esta es la proteína viral más conservada en células de cerdo infectadas por VSRRP¹³. Los iniciadores fueron diseñados utilizando Primer3Plus versión 2.4, GenneRunner versión 6.1 y OligoCalc versión 3.2, generando los iniciadores PRRS-USA-F 5’-CGATCCAGACTGCCTTTAAC-3’ y PRRS-USA-R 3’-CACTGTGGAGTTTAGTTTGC-5’.

Las condiciones de qRT-PCR se optimizaron probando los iniciadores por triplicado a 200, 400 y 800 nM con 1, 2 y 3 μl de ARN molde en un volumen total de 10 μL utilizando una mezcla maestra con colorante EvaGreen^® (Biotium, Hayward, CA, EE.UU.). La mejor eficiencia se logró mediante el uso de los iniciadores a 800 nM en 2 μl de ARN molde y se probó a través de diluciones de diez veces para generar un análisis de curva de fusión (Figura 1) y compararlo con electroforesis en gel de agarosa. Una vez obtenida la mejor concentración, se probaron, por triplicado, 40 muestras de control positivo y 40 muestras negativas para lograr una confianza de especificidad del 95 %¹⁴. La sensibilidad se determinó a través de diluciones de diez veces mediante la generación de una curva estándar de 97.6 % de eficiencia, R² de 0.996 y pendiente de 3.25 (Figura 2).

Figura 1 Picos de amplificación de diferentes diluciones de control positivo en la temperatura de fusión previamente establecida (77.4-78.0 ºC) 

Figura 2 Curva estándar de los iniciadores diseñados 

Se extrajo ARN del control positivo de la vacuna Ingelvac PRRS^® MLV (Boheringer Ingelheim). Se utilizaron tres controles negativos diferentes: mezcla maestra sin ARN molde, agua de grado molecular y aire. Todas las muestras se analizaron por duplicado. Las reacciones de qRT-PCR se ejecutaron en un termociclador de tiempo real CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Las reacciones de prueba consistieron en 1 μl de ARN, 400 nM de cada iniciador y mezcla maestra de iScript One Step RT-PCR con colorante EvaGreen y agua de grado molecular en un volumen total de reacción de 10 μl. Las condiciones del termociclador se calcularon utilizando el software CFX96, lo que resultó en un paso inicial de transcripción inversa a 50 °C durante 10 min, desnaturalización a 95 °C durante 3 min, 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 seg, alineamiento a 53.7 °C durante 25 seg y extensión a 72 °C durante 20 seg. Se realizó un análisis de la curva de fusión después de cada ejecución para confirmar la temperatura de fusión (Tm) del fragmento amplificado, calculada entre 77.4 y 78.0 °C. Las muestras positivas fueron confirmadas por secuenciación en un laboratorio externo y estas secuencias, verificadas mediante la herramienta BLAST (Figura 3).

Panel A: Resultados de secuenciación de una de las muestras positivas, resaltando una secuencia de 26 nucleótidos. Panel B: Captura de pantalla de la base de datos BLAST, que muestra los 26 nucleótidos del panel A, resaltados y que coinciden con una cepa del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino tipo 2 en el gen de la proteína nucleocápside. La base de datos arroja 100 resultados (no mostrados), todos ellos cepas de VSRRP-2.

Figura 3 Secuencia de muestras positivas y verificadas mediante la herramienta BLAST 

Se encontraron 9.3 % (9/97) de muestras positivas a VSRRP-2, presentes en el 66 % (4/6) de las regiones donde se realizó el estudio. La frecuencia de casos positivos fue de 33 % (2/6) en Tijuana, 16.6 % (3/18) en el Valle de San Quintín, 11.1 % (3/27) en Mexicali y 3.7 % (1/27) en Ensenada (Figura 4). En Tecate (0/13) y Valle de Mexicali (0/6) no hubo muestras positivas. No se encontraron ni se informaron signos de SRRP en ninguna granja.

Figura 4 Distribución geográfica del VSRRP en Baja California y la frecuencia en cada región analizada 

El objetivo principal de este estudio fue evaluar la presencia del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino tipo 2 en las regiones productoras de carne de cerdo más representativas de Baja California, por lo tanto, considerando el diseño epidemiológico del estudio, se puede afirmar que VSRRP-2 está presente en Baja, con una prevalencia de al menos 4 %.

Este estudio representa el primer informe del VSRRP-2 en Baja¹⁵, a pesar del reporte previo de su presencia en la zona noroeste del país¹⁶ que incluye, además del estado de Baja, el estado de Sonora y otros cuatro estados. Es importante destacar la cercanía geográfica con Sonora así como las características de su industria porcina, ya que Sonora introduce carne de cerdo así como cerdos vivos y semen a Baja¹⁷, por lo que existe la posibilidad de contagio de SRRP considerando que la vacunación contra VSRRP nunca se ha implementado en Baja, ya que se supone que está libre de la enfermedad y además, la mayor proporción de pequeños productores de traspatio, que no suelen utilizar medidas primarias de medicina preventiva.

En este estudio también se diseñaron iniciadores capaces de detectar VSRRP-2 en la región ORF7, y estos resultados fueron confirmados por secuenciación, demostrando la efectividad de la prueba y la presencia de VSRRP-2 en Baja, independientemente de la falta de signos clínicos¹⁸. Esto podría deberse a la presencia de cepas de VSRRP de baja virulencia dentro del territorio mexicano¹⁹; o a una baja concentración viral dentro de las muestras²⁰ dada la amplificación de las curvas positivas después del ciclo 30.

Este estudio demuestra la amplia presencia de VSRRP-2 en Baja, incluso en ausencia de signos clínicos que indiquen la presencia de la enfermedad; por lo tanto, es necesario realizar estudios epidemiológicos prospectivos con el objetivo de determinar la prevalencia y los posibles factores de riesgo asociados con el fin de identificar la magnitud del problema, así como establecer medidas preventivas y de control.