Dipylidium caninum (D. caninum) es el agente causal de la dipilidiasis, una enfermedad parasitaria causada por el cestodo adulto en perros, gatos, zorros, coyotes y otros carnívoros silvestres^1-7 y muy conocida como una enfermedad zoonótica que afecta a los humanos^8,9. El control de los cestodos con potencial riesgo zoonótico para los animales de compañía es de gran importancia para la salud pública a nivel mundial^2,10,11 dado el estrecho contacto que tanto perros como gatos tienen con los humanos¹², con un riesgo de infección aún mayor en niños^8,9. El cestodo adulto D. caninum crece hasta una longitud de 50 cm, mientras que su estructura macroscópica tiene la apariencia de cuentas de rosario o una agrupación de semillas de pepino¹³. A diferencia de los nematodos, los parásitos cestodos no tienen un sistema digestivo y crecen a partir de células proliferantes en el cuello, produciendo varios cientos de segmentos conocidos como proglótides y obteniendo alimentos a través del tegumento o pared corporal¹³. Situado en el intestino delgado del hospedero, D. caninum absorbe el material digerido y obtiene los nutrientes necesarios para su supervivencia, reproduciéndose sin la dificultad que han sufrido otros parásitos, ya que, como parásito hermafrodita, forma proglótides grávidas llenas de huevos infecciosos por medio de la diferenciación continua^9,14,15.

El pirantel (E-1,4,5,6-tetrahidro-1-metil-2-pirimidina) es un imidazotiazol antihelmíntico derivado de las tetrahidropirimidinas y utilizado ampliamente por veterinarios en especies pequeñas (perros y gatos), dado su amplio espectro de acción contra parásitos gastrointestinales maduros e inmaduros que infectan a animales domésticos¹⁶. El oxantel (1 metil-2-(3-hidroxifenil-etenil) 1,4,5,6-tetrahidropirimidina) es un derivado m-oxifenol del pirantel¹⁷ que activa el subtipo N, un subtipo sensible a la nicotina y la metiridina. El pirantel activa el subtipo L, un subtipo sensible al levamisol y al pirantel, lo que explica por qué se han reportado diferencias en sus nematodos objetivo¹⁶.

Las tetrahidropirimidinas comprenden una amplia variedad de sales de pirantel, morantel y oxantel, todas ellas tienen efectos agonistas nicotínicos que alteran el sistema neuromuscular del parásito, afectando la contracción muscular y causando parálisis tónica. Los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAchR) son esenciales para la función nerviosa del parásito, presentando una distribución y fisiología diferente a la encontrada en los mamíferos⁹. Los antihelmínticos agonistas nicotínicos actúan en la acetilcolina nicotínica en la unión neuromuscular del parásito, causando despolarización neuromuscular y parálisis espástica^18,19. Los nAchR del parásito tienen cinco subunidades de glicoproteínas ubicadas alrededor de un canal iónico central²⁰, que comprende un canal iónico pentamérico operado por ligando, que es una estructura con efectos farmacológicos significativos¹⁶. Además, los nAchRs son funcionalmente diversos debido a sus extensas familias de genes que codifican subunidades y tres subpoblaciones farmacológicas de receptores¹⁶. La activación del receptor de acetilcolina en nematodos se ha dividido en tres subtipos farmacológicos según el grado de afinidad nicotínica^21,22, caracterizado y definido de la siguiente manera: el subtipo N, con sensibilidad significativa a la nicotina, metiridina y oxantel; el subtipo L, con afinidad al levamisol y pirantel; y, el subtipo B, con una mayor sensibilidad al befenio.

El mecanismo de acción del pirantel funciona bloqueando la excitación muscular mediante la activación de un agonista del nAchR^18,19, alterando el sistema neuromuscular y, por lo tanto, provocando contracción muscular y parálisis, lo que resulta en la muerte del parásito⁹. El oxantel (m-oxifenol) ha demostrado ser eficaz contra nematodos gastrointestinales de gran impacto tanto en la salud animal como en la salud pública^23,24. Si bien el efecto de pirantel-oxantel (P-O), como tratamiento combinado, en los parásitos nematodos se ha reportado previamente²⁵, no hay informes científicos sobre los efectos de una combinación de P-O, ya sea in vivo o in vitro, en la motilidad, el grosor del tegumento u otras estructuras anatómicas en tenias. Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto cestocida in vitro de P-O en la motilidad y el grosor del tegumento de cestodos adultos Dipylidium caninum y describir los cambios histológicos en las proglótides grávidas de los organismos.

Todos los procedimientos de eutanasia aplicados en el presente estudio se realizaron siguiendo las pautas recomendadas y aprobadas por el Comité de Ética para la Experimentación Animal de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos y el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki).

Doscientos sesenta y seis (266) perros callejeros infectados naturalmente fueron muestreados en el Centro de Control Canino y Felino en el municipio de Tláhuac, Ciudad de México, después de ser capturados por la brigada municipal de control de animales. Los animales se sacrificaron por personal autorizado a través de una sobredosis anestésica, obteniéndose después el intestino delgado de cada sujeto mediante una incisión transversal en su abdomen. Los intestinos delgados obtenidos, aún conectados a través de las válvulas gastroduodenal e ileocecal, se almacenaron en bolsas de plástico, etiquetadas con números progresivos y transportadas al Laboratorio de Producción Animal de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos, ubicada en la ciudad de Cuernavaca²⁶.

Cada muestra de intestino se diseccionó individualmente mediante una incisión longitudinal y se examinó la presencia de cestodos D. caninum, que se identificaron a través de la apariencia macroscópica de las proglótides y se distribuyeron utilizando un microscopio óptico para verificar su morfología²⁷. La observación directa se llevó a cabo bajo un microscopio para determinar la viabilidad de los parásitos en el objetivo de 40X, con cestodos que presentaron motilidad completa durante un periodo de un minuto considerado viable para la posterior experimentación^28-30.

Se evaluó el efecto cestocida de P-O en parásitos adultos (grupo tratado (P-O), n= 21; grupo testigo (GT), n= 21), con los individuos colocados en placas de Petri de 90x60 mm que contenían 10 ml de RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 e incubados a 37 °C durante 10 h. Se utilizó agua destilada y el PMSF (fluoruro de fenilmetanosulfonilo) como vehículo inhibidor de la proteasa para el grupo de control, con el fin de mantener la anatomía estructural y la fisiología de los cestodos. Para el grupo tratado, se utilizó un medicamento desparasitante comercial (75 mg de Pamoato de Pirantel y 75 mg de Pamoato de Oxantel (Vermiplex), Laboratorios Holland Animal Health, Jiutepec, Morelos, México), en el que se agregaron tabletas maceradas al agua destilada en las placas de Petri.

Después de la incubación, se realizó una observación directa en un microscopio estereoscópico cada hora para determinar los efectos cestocidas. La prueba de motilidad se realizó por triplicado²⁶, en la que la motilidad del cestodo se evaluó en una escala de 0 a 5, de la siguiente manera: 0 indicó tenias completamente inmóviles que no respondieron a la estimulación manual; 1 indicó movimiento solo cuando se pincharon; 2 indicó actividad espontánea, pero únicamente en cada extremo del organismo, a saber, el escólex y el extremo del estróbilo; 3 indicó actividad lenta y espontánea durante toda la evaluación; 4 indicó que el sujeto estaba más activo; y, 5 indicó que el sujeto estaba altamente activo^28-30.

Se obtuvieron segmentos de parásitos adultos (proglótides grávidas) y se fijaron en paraformaldehído al 10 % y se mantuvieron bajo refrigeración a 4 °C hasta que se realizó el procedimiento histológico. Con el fin de observar la estructura histológica y cuantificar la altura del epitelio secretor y el grosor de la lámina propia, se obtuvieron secciones de tejido y se colocaron sobre portaobjetos de vidrio previamente tratados con poli-l-lisina. La parafina se eliminó de las secciones con xilol, se hidrató con alcoholes de diferentes concentraciones y se hizo permeable con tritón X-100 al 0.1 % en citrato de sodio durante 20 min, mientras que la actividad de la peroxidasa endógena se inhibió incubando el tejido durante 25 min en una solución de H₂O₂ al 0.3 % a temperatura ambiente. Las preparaciones se lavaron con una solución tampón de fosfato (PBS1X) y se marcaron con un lápiz hidrofóbico alrededor del tejido^31-33. Se procesaron segmentos de cestodo D. caninum, obteniendo secciones semiseriales de 5 μm. Se utilizó tinción de hematoxilina y eosina para evaluar la estructura histológica y el grosor del tegumento²⁷. Para cada sección histológica, se observaron seis campos de microscopio utilizando un objetivo de 40X, mientras que se realizaron seis mediciones de grosor del tegumento utilizando el analizador de imágenes Motic 2.0 y luego se fotografiaron^26,27.

Los datos experimentales correspondientes a las observaciones de motilidad in vitro se analizaron mediante una prueba Z, mientras que las mediciones del grosor del tegumento se compararon mediante una prueba t de Student³⁴. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando P<0.05, los resultados de motilidad in vitro se expresan como porcentaje y los resultados histológicos se expresan como media y error estándar.

Los resultados de la eficacia de P-O en términos de la motilidad de los parásitos D. caninum están disponibles en el Cuadro 1. Al inicio del experimento (hora 0) del experimento, ambos grupos presentaron movimiento total (P=0.07). El P-O mostró una reducción progresiva de la motilidad (del 72.0 al 4.8 %) desde la primera hasta la quinta hora después de la incubación, logrando así una reducción media por hora del 19 %, mientras que, de las horas seis a diez, se observó un 0 % de motilidad. En el grupo de control (GT), se observó un 100 % de motilidad durante las primeras 2 h postincubación, mientras que la motilidad se redujo del 96.2 al 4.2 % desde la tercera hora hasta el final del experimento, dando una reducción media del 10 % por hora.

Se observó una diferencia (P=0.0001) entre el grupo tratado y el GT entre la primera hora y el final del experimento. En la primera hora postincubación, la motilidad del grupo tratado fue del 72.0 %, mientras que esta fue del 100 % para el GT (P=0.0001). Se observó motilidad de 55.7, 41.5, 31.5, 20.0 y 4.2 % en las horas 6, 7, 8, 9 y 10 postincubación, mientras que se observó un 0.0 % de motilidad en el grupo tratado a partir de la sexta hora en adelante postincubación (P=0.0001).

Los efectos de P-O en el grosor del tegumento (P=0.001) de los cestodos adultos D. caninum se muestran en las Figuras 1 y 2, en el que el P-O disminuyó el grosor del tegumento en un 42.5 % (10.24 ± 0.21 μm) (Figura 2b; punta de flecha gris), mientras que éste fue de 17.81 ± 0.33 μm para el GT (Figura 2a; punta de flecha gris).

**Diferencias significativas entre grupos (P=0.001).

Figura 1 Efecto de Pirantel-Oxantel en el grosor del tegumento (media ± ESM) en cestodos adultos Dipylidium caninum 

A) Grosor del tegumento intacto (punta de flecha gris), corpúsculos calcáreos inmaduros a lo largo de la superficie y cerca del tegumento (puntas de flecha negras), embrióforo y capa vitelina intactos (punta de flecha púrpura) y el embrión (puntas de flecha rojas). B) Reducción del grosor del tegumento (punta de flecha gris), reducción del número de corpúsculos calcáreos inmaduros (punta de flecha negra), apariencia de corpúsculos calcáreos maduros (punta de flecha azul), morfología y distribución de sacos de huevos (punta de flecha morada), embrióforo, capa vitelina, embrión y estructuras distendidas (puntas de flecha moradas y rojas).

Figura 2 Secciones histológicas de tenias Dipylidium caninum. Espesor del tegumento obtenido en cestodos no tratados (A) y tratados con Pirantel-Oxantel (B) 

Los efectos de P-O en la estructura general de D. caninum, en comparación con la estructura presentada por el GT, se muestran en las Figuras 2a y b. Un hallazgo significativo con respecto a la histología de las proglótides grávidas observadas fue la concentración de corpúsculos calcáreos (CC) inmaduros (puntas de flecha negras) a lo largo de la superficie y cerca del tegumento (Figura 2a, b). En el GT, la concentración de CC inmadura fue mayor que la observada en las proglótides tratadas con P-O (Figura 2a; punta de flecha negra), mientras que los CC maduros solo se observaron en el grupo P-O (Figura 2b; punta de flecha azul), en el que también se observó una alteración de los huevos de D. caninum. En el grupo tratado con P-O, se encontró que la morfología y distribución de los sacos de los huevos había sido alterada, mientras que, en el GT, los sacos de los huevos presentaron una morfología y distribución normal (Figura 2b; punta de flecha morada). Finalmente, el embrióforo, la capa vitelina y el embrión permanecieron casi completamente intactos en el GT, mientras que, en el grupo P-O, tales estructuras se distendieron (Figura 2a; punta de flecha roja).

El presente estudio muestra los efectos de P-O en la motilidad y el grosor del tegumento de los cestodos adultos D. caninum, así como otras estructuras histológicas como corpúsculos calcáreos, sacos de huevos, embrióforo, la capa vitelina y el embrión. Los resultados de motilidad obtenidos en el presente estudio muestran que el P-O tiene un efecto directo en la motilidad, causando 100 % de inhibición de la motilidad 6 h postincubación. Algunos fármacos tienen un efecto rápido en la transmisión neuromuscular de algunos parásitos, con, por ejemplo, pirantel y oxantel que actúan como agonistas en los nAchRs sinápticos y extrasinápticos en las células musculares del nematodo, produciendo contracción y parálisis espástica³⁵. Estudios anteriores evaluaron los efectos del pamoato de pirantel contra Caenorhabditis elegans³⁶, mientras que el pamoato pirantel y el pamoato oxantel, utilizados en combinación, han demostrado ser eficaces contra Trichuris muris³⁷Ascaris lumbricoides³⁸, aunque se ha encontrado que este tratamiento es ineficaz contra Ancylostoma ceylanicum y Necator americanus³⁷. Los efectos del pamoato de pirantel y el pamoato de oxantel, 24 h después de la exposición, incluyen contracción muscular, inhibición de la motilidad y una reducción en el tamaño del parásito^36,37, tanto en larvas infecciosas como en organismos adultos. Mientras los efectos encontrados en estos estudios concuerdan con los hallazgos del presente estudio, el tratamiento P-O aplicado causó una mortalidad del 100 % en tenias D. caninum a partir de la sexta hora en adelante postexposición.

Los efectos del pamoato de pirantel (en forma de pasta) se evaluaron en la tenia común del caballo A. perfoliata^39-41, con una reducción del 92 a 98 % en la motilidad obtenida en tenias adultas después de 7 a 16 días de tratamiento en caballos infectados naturalmente examinados en la necropsia⁴⁰. Dichos resultados concuerdan con el 100 % de mortalidad observada in vitro en el presente estudio 6 h después de la incubación. Como la sal de pamoato de pirantel es prácticamente insoluble en agua, se absorbe a un ritmo reducido en el tracto gastrointestinal, lo que le permite llegar a los sitios microambientales en los parásitos objetivo más fácilmente que otras sales de pirantel como el tartrato, que es más soluble en agua y se absorbe más rápidamente a través del tracto gastrointesinal, para luego ser metabolizada y excretada tanto en la orina como, en pequeñas cantidades, en heces⁴⁰. Por lo tanto, el presente estudio muestra, in vivo, la ventaja del tratamiento P-O aplicado en el presente estudio en perros infectados naturalmente con tenias D. caninum, ya que, al menos, se observó un efecto letal in vitro.

Se ha encontrado que la combinación de pirantel con otros fármacos tiene un potencial antihelmíntico limitado, como se observó en A. ceylanicum y N. americanus³⁷in vitro, los cuales presentaron efectos antagónicos y no letales. Sin embargo, el presente estudio encontró un efecto sinérgico y un aumento de la potencia a través de la combinación de pamoato pirantel y pamoato oxantel, obteniendo una mortalidad del 100 % en el cestodo adulto D. caninum. Un efecto similar se observó en un estudio anterior que utilizó una combinación de pirantel embonato, oxantel embonato y praziquantel, obteniendo una mortalidad in vitro del 100 % ocho horas postincubación³³. Si bien los resultados anteriores concuerdan con los obtenidos por el presente estudio, muestran una mortalidad in vitro del 100 % 6 h postincubación. El efecto de P-O observado en el presente estudio se debe a la capacidad del fármaco para permanecer en micrositios en los parásitos, aumentando así su absorción por el cestodo a lo largo de la longitud del tegumento, y acortando el tiempo en el que surte efecto, aumentando así la mortalidad.

El tegumento es una de las principales estructuras de un cestodo, el cual requiere esta característica anatómica tanto para absorber material semidigerido del intestino delgado del hospedero, como para mejorar la función fisiológica y la reproducción del cestodo, dado que, a diferencia de los nematodos, los cestodos no tienen tracto digestivo. Por lo tanto, la capacidad de absorción del tegumento en cestodos es mayor que la encontrada en nematodos. En relación con lo anterior, durante su establecimiento, los parásitos helmintos producen mayores niveles de citoquinas proinflamatorias en el hospedero⁴², produciendo, en consecuencia, caquexia.

El P-O redujo sustancialmente el grosor del tegumento en la tenia D. caninum. Existen informes en la literatura de que este tratamiento afecta al tegumento en diferentes grados, causando cambios y daños morfológicos irreversibles en el tegumento y parénquima, alteraciones en la organización muscular, ausencia de microvellosidades tegumentarias, pérdida de células de la membrana en el tejido subtegumental, el desarrollo de un tegumento granular denso, y grandes vacuolas que generan un aspecto irregular y poroso, en los siguientes organismos: las tenias de roedores Hymenolepis nana^43,44, Hymenolepis microstoma⁴⁴, Taenia taeniformis^44,45, Echinococcus multilocularis^44,45 e Hymenolepis diminuta^29,44,45; Taenia solium en hámsteres infectados experimentalmente⁴⁶; Taenia crassiceps^47-49; Mesocestoides corti⁵⁰; Raillietina echinobothrida^51-54 en aves domésticas; Anoplocephala perfoliata³⁰ en caballos; D. caninum³³ en perros, gatos y humanos; el trematodo Fasciola hepatica en ratas⁵⁵; Artyfechinostomum sufrartyfex⁵⁶ en humanos; Fasciolopsis buski^53,56; el nematodo gastrointestinal porcino Ascaris suum⁵³; el nematodo anquilostoma gastrointestinal canino Ancylostoma ceylanicum⁵⁷; los nematodos gastrointestinales de roedores Rodentolepis microstoma⁵⁷, Trichuris muris⁵⁸ y Heligmosomoides polygyrus⁵⁹; y los nematodos parásitos de plantas de los géneros Meloidogyne y Globodera⁶⁰. Los resultados del presente estudio concuerdan con los resultados mencionados, como la reducción (adelgazamiento) del tegumento en 42.5 % en los parásitos de D. caninum tratados con P-O después de 6 h de incubación in vitro. El efecto de este tratamiento en el grosor del tegumento puede ser más pronunciado en parásitos incubados durante más de 6 h, como lo demuestran nuestros resultados histológicos; sin embargo, no se obtuvieron resultados histológicos de los sujetos tratados más de 6 h postincubación.

El presente estudio mostró la presencia de CC en segmentos grávidos tanto en el GT como en el grupo P-O; sin embargo, en el grupo P-O, el número de CC fue menor. La biomineralización es un fenómeno generalizado en los invertebrados, con el carbonato de calcio, uno de los biominerales más abundantes implicados en dicho proceso⁶¹. En los cestodos, los minerales producen CC, función que ha sido objeto de especulación científica, con algunas hipótesis propuestas, una de las cuales postula que los CC representan aproximadamente el 10 % del peso corporal de los parásitos y que se encuentran comúnmente en el parénquima de muchos metacestodos y cestodos adultos^61,62. Otra hipótesis es que los CC juegan un papel importante en la desintoxicación⁶³, ya que, debido a que se producen principalmente en ausencia de oxígeno, se cree que amortiguan anaeróbicamente los ácidos y sirven como reservorio para iones inorgánicos⁶⁴. Cabe señalar que los CC son, en parte, un producto excretor que sirve para eliminar los desechos metabólicos del cuerpo al pasar a través del tegumento⁶². Los corpúsculos calcáreos están compuestos por una base orgánica acoplada a sustancias inorgánicas, como potasio, sodio, magnesio, silicato, calcio, fosfato⁶¹ y sulfato en diferentes larvas de cisticercos y cestodos adultos⁶⁴. Su base orgánica incluye ADN, ARN⁶⁵, proteínas^66,67 y glucógeno^46,68. Por lo tanto, en el presente estudio, la disminución del número de CC inmaduros distribuidos cerca del tegumento en el grupo P-O se debió tanto a un alto nivel de absorción a través del tegumento de los cestodos D. caninum como a la duración de la incubación in vitro. Además, el 100 % de mortalidad obtenido por el presente estudio también se debe tanto a una pérdida de la proteína y el glucógeno requeridos por el proceso metabólico en las células, como a una probable desintegración del ADN del organismo.

Como se han realizado pocos estudios sobre la densidad y ubicación de los CC en diferentes partes del estróbilo de cestodos D. caninum, Khalifa et al²⁷ realizaron un estudio histoquímico y ultraestructural comparativo para determinar las diferencias en la ubicación, distribución, composición y funciones de los CC de D. caninum y T. taeniaeformis. Los resultados del presente estudio en relación con los CC concuerdan con los obtenidos por Khalifa et al²⁷, ya que la distribución de los CC se concentró en los lados laterales de los segmentos grávidos del cestodo D. caninum y se vieron afectados por el tratamiento P-O.

La tinción de hematoxilina y eosina de los segmentos grávidos mostró que, en el GT, los huevos de D. caninum se agruparon en sacos como en lo observado por Khalifa et al²⁷, mientras que el grupo P-O presentó signos de alteraciones morfológicas, como distensión de los huevos, embrióforo, embrión y capa vitelina. Si bien pocos estudios han observado la estructura de los segmentos grávidos de D. caninum, Peña et al³³ observaron los efectos de la toxina B. thuringiensis en D. caninum, resultados que concuerdan con los del presente estudio al mostrar efectos en la motilidad, el grosor del tegumento y los huevos; efectos que reducen el porcentaje de motilidad, adelgazan el tegumento y dañan los huevos del organismo. Sin embargo, Peña et al³³ utilizaron un fármaco comercial que contenía embonato de pirantel, embonato de oxantel y praziquantel como control positivo.

Se han utilizado otras estrategias para disminuir la infectividad de los huevos de D. caninum, con un estudio realizado en Brasil por Araujo et al⁶⁹ que evalúa el efecto de los hongos nematófagos Poconia chlamydospora, Duddingtonia flagrans y Monacrosporium thaumasium en las cápsulas de los huevos. Sus resultados mostraron que los aislados de Poconia chlamydospora (tipos 2 y 3) tuvieron una actividad ovicida entre 5 y 15 d después de la incubación in vitro. Sin embargo, hasta la fecha, se ha encontrado que la actividad de un fármaco sintetizado tiene efectos más rápidos y pronunciados, como se observa con el tratamiento P-O utilizado en el presente estudio.

Con base en los resultados del presente estudio, el P-O tiene efectos cestocidas in vitro contra la tenia D. caninum, mostrando un efecto letal y disminuyendo la motilidad en un 100 % dentro de las primeras 6 h después de la incubación in vitro. Además, el P-O tiene un efecto directo en el grosor del tegumento, reduciéndolo en un 42 %. El presente estudio es el primero realizado sobre los efectos in vitro de P-O en la mortalidad, la reducción del grosor del tegumento y las alteraciones en las estructuras histológicas, como los huevos, el embrióforo, el embrión y la capa vitelina de la tenia D. caninum. El uso de una combinación de P-O es un tratamiento farmacológico opcional para el control de D. caninum en perros y gatos infectados naturalmente.