Sitios de muestreo

Las muestras de carne se colectaron en 69 centros de comercialización incluidos los principales centros de distribución como son la Merced, Calle 7, Rastro Viejo, Central de Abastos y Ferrería, ubicados en las diferentes delegaciones de la Ciudad de México.

Diseño de Muestreo

Se colectaron 161 muestras de carne de bovino; 23 muestras fueron de carnicerías de grandes centros de distribución y 138 de mercados delegacionales, muestreando un total de 69 carnicerías que corresponde al 22.5 % del total de carnicerías de la Ciudad de México (307). Los puntos de comercialización de carne bovina muestreados fueron identificados en el portal del Instituto de Acceso a la Información Pública y Protección de Datos Personales (IPPDP) de la Ciudad de México. Considerando los siguientes supuestos: (a) el nivel económico (alto, medio y bajo) de la región y (b) que el muestreo se realizará de forma al azar distribuidas de manera homogénea en todas las regiones de las Alcadías (Norte, Sur, Este y Oeste). La cantidad de muestras se determinaron con el teorema de límite central (TLC) con una desviación estándar de 8.9 % de acuerdo a las pruebas preliminares¹⁷, siendo aleatoria la selección del mercado. Asimismo, el de los establecimientos, se seleccionaron dos mercados por cada delegación (Cuadro 1), siendo representativos del número total de puntos de venta bajo el TLC a una desviación estándar de 7.3 % en las variables de muestreo.

Tamaño de muestras

La muestra de carne cruda fue de 250 g obtenida del corte llamado bistec de aguayón (Biceps femoris) y simulando las condiciones habituales de los consumidores. Para disminuir el riesgo de contaminación durante el período de obtención de muestras, éstas se conservaron en bolsas de plástico identificadas y selladas, las cuales se mantuvieron dentro de un envase isotérmico a una temperatura de 4 ºC. Una vez colectadas las muestras de un día de muestreo se llevaron al Laboratorio del Posgrado en Producción Animal para su separación en submuestras para los diferentes análisis y almacenaje en congelación a -20 ^oC hasta su análisis.

Composición nutrimental de la carne

Los contenidos de humedad, proteína, grasa, y colágeno de la carne se determinaron por espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIR´s) en el Foodscan Meat Analyzer (FOSS®, Dinamarca). Se pesaron 180 g de muestra y se realizó una molienda con un procesador de alimentos Picalica (Moulinex®, Francia) durante 30 seg (dos series de 15 seg) de acuerdo a la metodología propuesta por la AOAC¹⁸.

Determinación del color de la carne

El color de la muestra de carne se determinó en el Miniscan (Hunterlab®, USA), realizando cinco lecturas por muestra en un cuadrante superior, inferior, derecho, izquierdo y centro de acuerdo a la metodología propuesta por la Comisión Internacional de L´Eclairage (1976)¹⁹.

Extracción de ADN de tejido cárnico

Para la identificación de especie de la carne bovino o equino se realizó la extracción del ácido desoxirribonucleico (ADN) de la muestra inicial de 250 g, se tomaron 500 mg de carne que se colocaron en microtubos y se congelaron a -80 °C por 48 h en ultracongelación (ThermoSientific®, modelo 2186). Posteriormente, las muestras se liofilizaron (Labconco®, modelo Freezone 4.5) durante cinco días y se molió el tejido seco con la ayuda del disruptor celular TissueLyser II® (Qiagen, Alemania). Una vez molida la muestra, se realizó procedimiento de extracción de ADN, colocando en cada microtubo 1 ml de solución lisis [Tris base (C₄H₁₁NO₃) 50mM pH8, EDTA (C₁₀H₁₆N₂O₈) 0.1M, SDS (NaC₁₂H₂₅SO₄) 0.5%, 7 µl de proteinasa K] y se incubaron a 50 °C por 2 h continuas. Después, se agregaron 500 µl de Fenol:Cloroformo:Isoamílico (C₆H₅OH: CHCl₃: C₅H₁₂O) (12:24:1) y se centrifugó a 10,000 rpm durante 10 min (Centrifugue eppendorf 5810 R). El sobrenadante se transfirió a otro microtubo, adicionando 1 ml de etanol (C₂H₅OH) al 70% a una temperatura de -20 °C, mezclándose por inversión hasta que el ADN precipitó. Por último, se centrifugó a 10,000 rpm durante 10 min, se formó un pellet y se secó en una centrífuga de vacío (Vacufuge plus). Para re-suspender el pellet de ADN se utilizaron 50 μl de H₂O grado molecular.

Prueba de PCR para determinación de especie de la carne

Previo a la amplificación del ADN por PCR, se comprobó que el ADN extraído fuera lo suficientemente puro y libre de contaminaciones de proteínas. Para medir la concentración del ADN se utilizó un espectrofotómetro Nanodroop® (Thermo Scientific, modelo ND-100) bajo los siguientes indicadores: el ADN presenta un máximo de absorbancia a 260 nm (50 μg/ml tienen una OD a 260=1), mientras que las proteínas lo tienen a 280 nm. La pureza del ADN se calculó, tomando en cuenta la absorción entre A260/A280 (1.9 y 1.7).

En el Cuadro 2 se muestran las secuencias seleccionadas a partir de la literatura de los oligonucleótidos utilizados para la amplificación de fragmentos de ADN específicos por especie animal¹⁴; estos consistieron en un primer forward universal y los oligonucleótidos reverse específicos de especie equina y bovina. La amplificación de los fragmentos específicos se realizó por PCR convencional. La amplificación del ADN por PCR, se llevó a cabo considerando un volumen final de 50 µl [5µl de10x PCR buffer, 1µl de 20µM de dNTPs, 2 µl de oligonucleótido universal [10 pmol/µl], 2 µl de oligonucleótido equino [10 pmol/µl], 2 µl de oligonucleótido bovino [10 pmol/µl], 0.25 µl de Taq polimerasa (Roche®), 250 ng de ADN y 32.75 µl de agua grado PCR libre de nucleasas]. Para la amplificación de las secuencias seleccionadas se utilizó un programa de termociclado Maxygen (Axygene®) el cual consistió en: una etapa de desnaturalización inicial, en la que se mantuvo la mezcla de reacción a 94 °C durante 30 seg para que las dos cadenas de ADN molde se separaran. Posteriormente se sometieron las mezclas de reacción a 35 ciclos de tres etapas cada uno [alineamiento (60 °C durante 30 seg), extensión (72 °C durante 30 seg) y refrigeración (4 °C)].

Gel de electroforesis

Finalizado las reacciones, se procedió a tomar 5 µl fragmentos amplificados (amplicones) de los productos PCR de las muestras para ser analizados por electroforesis convencional. Se mezclaron 5 µl del amplicon con 3 µl de buffer de carga 5x, colocando 8 µl en cada pozo del gel de agarosa [Seakem (Lonza®) al 3% (P/V) en 1,500 ml TAE 1x, con 25 µl de Bromuro de Etidio (Invitrogen®)]. Se corrió a 100 Volts durante 45 min para posteriormente realizar la lectura de amplicones en un fotodocumentador de luz UV. La similitud de las secuencias seleccionadas se analizó aplicando el programa informático BLAST® (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Análisis estadístico

Las variables de calidad nutritiva de la carne de bovino y equino (humedad, proteína, grasa, colágeno y color) se analizaron mediante un diseño completamente al azar²⁰, los tratamientos fueron el factor tipo de carne, la carne equina tuvo 9 repeticiones y la carne de bovino 152 repeticiones. Se utilizó un modelo lineal general con el paquete estadístico SAS²¹. Las medias de los tratamientos se analizaron mediante la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, y los resultados se consideraron significativos cuando P<0.05²⁰. Se utilizó el siguiente modelo matemático: Yij= μ + Ti + Eij

Donde:

Yi_j fueron las características nutritivas;

μ corresponde al valor de la media de las respectivas variables;

Tj representa el efecto de la especie;

Eij representa el error experimental.

También, se realizó una prueba de Ji-cuadrada (X²) con la finalidad de comparar los resultados de los amplicones de ADN de carne respecto a los esperados, por lo que la hipótesis que todas las muestras de carne adquiridas de carnicerías serán de la especie bovina.

Identificación de especie

Los amplicones, producto de las pruebas de PCR convencional tuvieron fragmentos de 439 y 274 pares de bases (pb) que corresponden al peso molecular del ADN de la carne de bovino y equino, respectivamente (Figura 1). Resultando, un total de 152 muestras positivas para carne de bovino y 9 de las muestras fueron positivas para carne de equino (Figura 2).

M_50pb = Estandar de 50pb; +B_1-3 Control positivo de bovino (274pb); +E_1-3 Control positivo de equino (439pb).

Figura 1 Gel de electroforesis de la prueba de PCR de muestras de carne de bovino y equino de expendios de la Ciudad de México  

- Control negativo, +B Control positivo de Bovino, +E Control positivo de equino, y número de muestra.

Figura 2 Gel de electroforesis de la prueba de PCR de muestras de carne bovina y equina de expendios de la Ciudad de México  

Composición nutrimental

Se observó un ligero incremento (P<0.05) en la concentración de humedad y proteína en la carne de bovino respecto a la carne de equino (Cuadro 3). Mientras que el contenido de grasa y colágeno no mostró diferencias (P>0.05) entres las especies y fluctuaron de 22.0 a 23.5 %, de 2.0 a 2.3 %, de 73.1 a 75.1 % y de 1.3 a 1.4 mg g^-1. Por otra parte, el color de la carne de bovino fue mayor (P<0.05) respecto a la carne equina en cuanto a la luminosidad (L) (Cuadro 4); mientras que no se observó diferencias (P>0.05) en los colores de la carne de a* (rojo a verde) y b* (amarillo a azul) y fluctuaron de 29.80 a 37.50 y 15.00 a 16.20, respectivamente.

Identificación de carne equina en diferentes puntos de venta de la Ciudad de México

La técnica de PCR y la secuencia de los pares de oligonucleótidos reportados por Matsunaga⁴ fueron útiles para la identificación en cortes de carne fresca para bovino y equino en el presente estudio²², y detectar que el 5.59 % de la carne muestreada en expendios de la Ciudad de México perteneció a la especie equina. La sustitución de la carne bovina por carne equina representa un fraude para el consumidor, ya que el precio de una carne y otra a nivel nacional difiere en casi un 100 %, lo cual no es aceptable desde el punto de vista ético, ni comercial²³. Aunque, la carne equina resulta una alternativa viable para el consumo humano, similar a otros tipos de carne obtenidas de especies tradicionales como la bovina, porcina y aviar¹⁰, su aceptación en México es limitada debido a razones de índole cultural⁹, ya que en otros países como Italia, Bélgica, Rusia y Alemania es perfectamente aceptada. Por otro lado, la venta de carne equina en el mercado nacional representa un riesgo potencial a la salud, ya que esta actividad no está regulada por las instancias gubernamentales, y puede haber presencia de fármacos utilizados en producción que pueden dejar residuos peligrosos en carne, como lo demuestra el estudio de Rubio²³ en donde encontraron que un 9.93 % de muestras de carne analizadas en diferentes estados de México dieron positivas para carne de caballo y el 93.10 % de las muestras seleccionadas excedieron los límites máximos de residuos (LMR) para el clembuterol -establecido por la FAO²⁴- y 100% -según el límite de tolerancia cero de las leyes mexicanas, lo que confirma que si hay un riesgo latente en salud para los consumidores nacionales.

Composición nutrimental de la carne de bovino y equino

La composición nutricional de la carne equina es similar a la carne bovina^25,26. La humedad constituye cerca del 70 %, la proteína 22 %, la grasa intramuscular oscila entre 0.5 y 6 %, y los minerales representan cerca del 1.5 %²⁷. En este sentido, los hallazgos sobre el contenido de humedad fueron mayores (P<0.05) para la carne de bovino comparados a la carne de equina, y podría estar relacionado al tipo de musculo, la edad al sacrificio y el sexo de los animales⁹. El tipo de músculo influye significativamente en el contenido de humedad de la carne bovina y equina, siendo mayor en el músculo semimembranoso²⁷. Estos resultados fueron similares a los reportados por Lorenzo y Pateiro²⁸ quienes, al evaluar la influencia del tipo de músculos sobre el valor nutricional de la carne de ternero, observaron valores de contenido de humedad de 53 a 77 %, respectivamente. Mientas que Tateo et al²⁹ presentaron muestras de carne de machos y hembras de raza “Heavy Draft Italian” con valores de humedad similares a los reportados en el presente estudio (70 y 73 %, respectivamente).

Por otra parte, la concentración de proteína en la carne de bovino y equino se encuentran en los valores reportados como ideales (15 a 23 %) para el consumo humano^11,29. La carne de bovino mostró un incremento en la concentración de proteína que podría relacionarse principalmente a los factores como el sexo, edad, tipo de músculo y sistema de producción^8,9. Mientras que la concentración de proteína de la carne de equino fue similar a los reportados por otros autores^9,27,29, que observaron niveles que varían entre 20 y 22 % y que concluyen que los factores que influyen en la concentración de proteína son similares a los que afectan el ganado bovino.

Es importante señalar que la relación grasa / proteína es una característica clave de las cualidades saludables de la carne para consumo humano³⁰. El bajo contenido de grasa intramuscular de la carne equina, es debido a que presentan tendencia a almacenar tejido adiposo de forma subcutánea³¹. Por ello, algunos autores la denominan “carne saludable”³². Esta característica es incluida en las estrategias de comercialización. Principalmente para las personas que intentan mantener su peso bajo control³³; ya que la Organización Mundial de la Salud³⁴, recomienda que sólo el 30 % de la ingesta diaria de energía del ser humano proveniente de la dieta debe de ser originada por la concentración de grasa, por lo que la carne de equino parece ser una buena fuente de proteínas con bajo contenido de grasa¹⁰.

La importancia del color como una característica de valoración física y de calidad de la carne, permite mostrar las variaciones del estado químico (grado de oxidación) del pigmento de un determinado momento de la carne y el estado físico de la carne, la estructura de las fibras musculares y la cantidad de luz reflejada (L*a*b)¹⁹. En este sentido, la menor luminosidad (L) de la carne equina puede ser debido a la cantidad de oxigenación de la mioglobina que está relacionada con el valor de a*³⁵. En este sentido, la carne de equino tiene mayor concentración de mioglobina en su vida adulta³⁶. Además, aumenta el valor de a* y se reduce el valor de L*, y tiende a un color más oscuro³⁷, lo que explica los valores de similitud del color de la carne para las especies en el presente estudio.