Animales

Para realizar este estudio se utilizaron caballos hembras (n= 5) y machos (n= 5) de diferentes razas, edades y diferentes actividades afectados por laminitis crónica (Cuadro 1), ninguno de los caballos estaba bajo ningún tratamiento actual. Todos los animales mostraban rotación de la falange distal, pero no eran hundimientos. El recuento de células sanguíneas (RCS) se extrajo de la vena yugular y se utilizó para evaluar el estado inflamatorio inicial. Todos los caballos se mantuvieron y trataron en sus correspondientes establos habituales. Los animales tuvieron libre acceso al agua y se alimentaron con heno de avena dos veces al día. Los formularios de consentimiento informado fueron firmados por los propietarios. Los protocolos de manejo y procedimiento clínico y experimental de los caballos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Veterinaria (FMVZ-UNAM) (No. MC-2016/2-5; Evaluación terapéutica del uso de células troncales mesenquimales alogénicas, en el control del dolor, inflamación y estructura laminar en caballos con lamintis crónica”).

Evaluación de la cojera

Se realizó una evaluación ortopédica mediante la observación de las posturas estáticas y dinámicas de cada caballo. Se utilizó la puntuación de dolor de evaluación multifactorial modificada adaptada para caballos laminíticos que califica los signos de dolor y comportamiento alterado combinando, respectivamente, los criterios de Obel y Glasgow⁴. Cuanto más alta sea la puntuación (máximo 14), mayor será el dolor.

Evaluación de la temperatura de los cascos

La inflamación laminar conduce a incrementos en la temperatura de los cascos²⁰. La termografía infrarroja puede utilizarse para estimar el cambio de temperatura a través de la obtención de imágenes de los cascos. Se utilizó la cámara infrarroja FLIR XX5 (Flir^TM, EE. UU.) para obtener imágenes en tiempo real de los cascos de la extremidad frontal de los caballos una vez al mes durante seis meses. La temperatura de la banda coronaria se registró in situ y se graficó individualmente. Se decidió utilizar la banda coronaria como referencia anatómica para medir la temperatura porque carece de la pared del casco. Esta característica hace que esta región sea adecuada para obtener lecturas de temperatura confiables; la anatomía de la pared del casco en caballos con laminitis crónica puede deformarse mucho. Las sesiones de obtención de imágenes se realizaron a la misma hora ((8 AM), mientras se mantenían a los caballos parados en sus establos y antes de ser paseados a mano. Los cascos siempre se limpiaban antes de la toma de imágenes. Las vistas laterales y dorsales se tomaron a una distancia de 30 centímetros del casco. Las imágenes codificadas por colores se obtuvieron con base a una escala lineal calibrada construida en el programa de adquisición de la cámara.

Venografía

Los caballos se sedaron con clorhidrato de xilacina al 10 % inyectado a través de la vena yugular. El nervio digital palmar lateral y medial se bloqueó utilizando lidocaína al 2 % a nivel de los sesamoideos proximales; el área fue previamente afeitada y limpiada con una solución que contenía gluconato de clorhexidina al 20 %. Se colocó un torniquete con un vendaje Esmarch en el menudillo. Luego se perforó la vena digital lateral utilizando un catéter mariposa 23G y el medio de contraste Iopamidol (Scanlux, San Chemia, México) se inyectó a través de ella lentamente. Para asegurar una distribución adecuada del Iopamidol en todo el lecho vascular del dedo del caballo, el aspecto dorsal de la rodilla se flexionó dorsalmente y los talones se levantaron del suelo. Al final de la administración, los talones soportaron peso, se retiró la jeringa y el catéter se sujetó con unas pinzas Halsted. Se tomaron vistas latero-medial y dorso-palmar a 60 seg del medio de contraste ²¹.

Biopsia laminar

El menudillo y la cuartilla se lavaron y secaron. Los caballos se sedaron y los nervios abaxiales laterales y mediales se bloquearon siguiendo las pautas proporcionadas anteriormente. Se colocó un torniquete en el menudillo usando un vendaje Esmarch para reducir el sangrado. La pared dorsal del casco se perforó con una piedra de pulir de 4.8 mm de diámetro (Dremel, Bosch, EE. UU.), a 2 cm de la banda coronaria. La cavidad realizada (9 mm de diámetro) atravesó los estratos externos y medios de la pared del casco hasta llegar a la línea blanca, un punto de referencia anatómico que indica proximidad al corion laminar. La solución salina se regó constantemente para evitar el sobrecalentamiento durante la perforación. Una vez en la línea blanca, se incidió el corion laminar con un bisturí armado con una cuchilla del No. 11, orientada perpendicularmente hacia la pared del casco. El bisturí se movió en el sentido de las manecillas del reloj siguiendo el perímetro de la cavidad hasta llegar a la tercera falange. Luego, con un tallador Frahm del No. 4, el tejido laminar se extrajo de la tercera falange²². Se obtuvo una muestra laminar de forma cilíndrica, que medía aproximadamente 7 mm en la base y 7 mm de altura. La biopsia se fijó en paraformaldehído tamponado (4 %) durante 24 h, luego se sumergió en una solución tamponada de sacarosa (15 %) durante 24 h, y finalmente se transfirió a una solución tamponada de sacarosa al 30 % a 4 °C hasta su evaluación. El área quirúrgica se secó con gasas y se selló con metacrilato de metilo. El torniquete se retiró después de que el metacrilato de metilo se secó.

Histología

Las biopsias se incrustaron en Tissue-Tek (Neg-50(, Richard-Allan Scientific, EE. UU.), se congelaron en hielo seco y se cortaron longitudinalmente (30 μm de grosor) en un criostato (SLEE), a -25 °C. Las secciones en serie se montaron en portaobjetos con base de gelatina y se almacenaron a -4 °C hasta su uso. Se obtuvo un total de 15 portaobjetos por muestra. Se tomó un portaobjetos cada tres para teñirlo con violeta de cresilo, base de ácido peryódico de Schiff y tinción tricrómica de Masson. Los portaobjetos se cubrieron con con Cytoseal( 60 (Richard-Allan Scientific) y se observaron a través de un microscopio Olympus BX51-WI. La integridad citológica del tejido y el grado de infiltración inflamatoria se estimaron cualitativamente, y los campos representativos de este material se fotomicrografiaron digitalmente, bajo microscopía de campo brillante, utilizando el software Stereo Investigator( (10X).

Microscopía electrónica de transmisión

Las muestras del corion laminar obtenidas de un caballo sano y uno laminítico se fijaron en una solución tampón que contenía 4 % de paraformaldehído / 2.5 % de glutaraldehído (Electron Microscopy Sciences) durante 72 h. Después de tres lavados suaves con tampón fosfato salino (0.1M; pH 7.2), las muestras se fijaron posteriormente con tetróxido de osmio (1 %) durante 1 h, luego se deshidrataron e incrustaron en Epon 812. Se polimerizaron a 60 °C durante 24 h. Las secciones semidelgadas (150 nm) se montaron en portaobjetos y se tiñeron con azul de toluidina, se eligió el área de interés y se montaron secciones ultradelgadas (70 nm) en rejillas de cobre, se contrastaron con acetato de uranilo (2 %) y citrato de plomo (50 %) (Electron Microscopy Sciences) y se observaron a través de un microscopio electrónico de transmisión Jeol 1010 (60kV). La integridad ultraestructural del tejido y el grado de infiltración inflamatoria se estimaron cualitativamente, y los campos representativos de este material se fotomicrografiaron digitalmente.

Muestreo de medula ósea y recolección, aislamiento y expansión de células madre mesenquimales

Se recolectaron muestras (15 ml) de médula ósea (MO) (utilizando jeringas de 20 ml que contenían 1,000 UI de heparina/ml de MO) mediante punción esternal de caballos sanos machos y hembras (3-8 años) de diferentes razas. Las muestras se almacenaron a 4 - 8 °C y se transfirieron en condiciones asépticas a la instalación de cultivo celular dentro de una hora desde de la recolección. La médula ósea se transfirió a tubos estériles llenos de Ficoll Hypaque en una proporción de 1:2. Las muestras se centrifugaron a 400 xg durante 30 min y la fracción mononuclear se aisló en un tubo estéril a 4 °C. La fracción se centrifugó a 300 xg durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron y sembraron, a una densidad de 5x10⁴ células/cm², en matraces de 25 cm³ que contenían DMEM:F12 (1:1) suplementados con suero fetal bovino al 20 %, 500 U/ml de penicilina, 50 (g/ml de estreptomicina y 2.5 (g/ml de amphotericina B. Las células se incubaron a 37 °C y 5 % de CO² y los medios de cultivo se cambiaron cada tres días hasta alcanzar una confluencia del 80 %²³.

Subcultivo y escalamiento de células madre mesenquimales

Una vez alcanzada la confluencia del 80 %, las células se subcultivaron semanalmente de la siguiente manera: la monocapa se lavó con DPBS y las células se separaron mediante HBSS con 7.5 mg de tripsina porcina y 0.6 mg de EDTA. Las células se sembraron a una densidad de 5x10⁴ células/cm² en matraces de 75 cm³ (primer subcultivo) y luego en 175 cm³ (subcultivos posteriores) con DMEM F12 (1:1) suplementados con suero fetal bovino al 20 %.

Citometría de flujo

Las células madre mesenquimales alogénicas de la médula ósea se caracterizaron mediante citometría de flujo. Se utilizaron tres conjuntos de anticuerpos para inmunofenotiparlos. Las CMM-AMO utilizadas para la infusión fueron positivas para los marcadores de superficie CD73, CD90, CD105, CD28 y CD44 (CD28/CD44 específicos para MSC equino), negativas para CD45, CD34, CD14 y CD79. La citometría de flujo se realizó con base en protocolos previamente reportados^24-28.

Administración de CMM-AMO

Los caballos se sedaron y prepararon para la administración de CMM-AMO como se describió anteriormente (ver sección venografía). Las CMM-AMO se diluyeron en solución salina fisiológica y se administraron (10-30x 10⁶) en la vena digital palmar lateral (o medial) en condiciones estériles a través de un catéter mariposa de calibre 21, conectado a una jeringa de 20 ml, en el caballo de pie. El torniquete se retiró 20 min después de la administración de las células. El dedo se mantuvo vendado durante un día. Las CMM-AMO se inyectaron tres veces en intervalos de un mes.

Condición clínica de los caballos tratados con CMM-AMO

Los caballos con laminitis crónica tuvieron puntuaciones de Obel-Glasgow que oscilan entre 2 y 14 antes del inicio del tratamiento con CMM-AMO (Figura 1A). En contraste, el caballo sano no mostró cojera o dolor, ni incrementos de temperatura de los cascos en ningún momento durante el período evaluado. A medida que avanzaba el estudio, todos los caballos tratados con CMM-AMO mejoraron su condición clínica después del segundo o tercer mes de haber recibido infusiones venosas de CMM-AMO. Al final del período de seis meses, todos los caballos tratados con CMM-AMO disminuyeron sus puntuaciones de Obel-Glasgow y mejoraron significativamente su movilidad y condición clínica. En general, los caballos con la peor condición inicial fueron los que más mejoraron (Figura 1A). Todos los caballos tuvieron una mejora en la movilidad, calidad y forma del casco, también mejoraron su comportamiento y las facciones de sus caras (escala Grimace), teniendo una buena calidad de vida. Esta mejoría fue atribuible a la infusión de CMM-AMO, ya que el caballo de simulación tratado solo con el vehículo no mejoró durante el transcurso del tiempo experimental (Figura 1A).

Evolución clínica (A) y la temperatura de los cascos (B) de los caballos tratados con CMM-AMO, el caballo sano y el caballo de simulación, según lo monitoreado por la escala de Obel-Glasgow y la termografía infrarroja.

Figura 1 Evolución clínica de los caballos después de haber sido tratados con células madre mesenquimales alogénicas de la médula ósea (CMM-AMO) 

En contraste, la temperatura de los cascos en caballos laminíticos osciló entre 27 °C y 35.5 °C (promedio de 33.26 °C + 2.58) antes de que comenzara el tratamiento con CMM-AMO. Como referencia, la temperatura en los cascos del caballo sano osciló entre 27 °C y 30 °C (promedio 28.56 °C + 0.79). El tratamiento con CMM-AMO no tuvo un impacto importante en la temperatura de los cascos (Figura 1B). En unos caballos tratados, la temperatura del casco tendió a disminuir ligeramente (1 a 3 °C) después de las infusiones de CMM-AMO (promedio de 32.27 °C + 1.78). En otros, los cambios de temperatura fueron muy variables durante el transcurso del experimento. Sin embargo, en todos los casos, los caballos tratados con CMM-AMO y el caballo de simulación (promedio de 33.01 °C + 1.29) nunca alcanzaron valores saludables estables de temperatura de los cascos.

Patrón vascular del lecho venoso posterior al tratamiento con CMM-AMO

Los cascos del caballo están irrigados por un lecho vascular altamente anastomosado formado por el plexo coronario y las papilas, el plexo venoso sublaminar, las papilas terminales, los vasos circunflejos y los plexos venosos de la planta y el talón (Figura 2A). En caballos laminíticos, los rodales de dislocación crónica de la falange distal interrumpieron significativamente este patrón vascular ordenado. Como se ve en la Figura 2B, los cascos prácticamente se vuelven avasculares; todo el lecho vascular mostró defectos graves de llenado de medios de contraste, excepto los vasos madre en el plexo coronario y del talón, donde los vasos se veían irregulares y algo congestionados. En general, la gravedad del daño vascular se correlacionó con la gravedad de los síntomas (no se muestra). En contraste con los hallazgos venográficos descritos para el paisaje vascular en cascos laminíticos, las imágenes de los cascos obtenidas al final del sexto mes de haber comenzado el tratamiento con CMM-AMO revelaron, en todos los caballos, independientemente de la condición clínica inicial y el grado de daño vascular, indicios de recuperación vascular. Comúnmente, los vasos madre del plexo coronario y del talón se ensancharon y se observaron con frecuencia imágenes de brotes vasculares, al igual que vasos que atravesaban trayectorias algo "aberrantes" (Figura 2C). En otras palabras, un proceso de angiogénesis está claramente en camino. Sin embargo, ninguno de los caballos tratados mostró una recuperación completa del patrón vascular, a pesar de que su mejoría clínica era evidente. Por último, el caballo de simulación no mostró mejoría clínica, ni patrones venográficos de recuperación vascular (no mostrados).

A-C. Venografías representativas de cascos de caballos sanos (A), laminíticos (B) e infundidos con CMM-AMO (C). Observe la respuesta vascular en los cascos de los caballos infundidos con CMM-AMO. CP, Plexo Coronario; SP: Plexo Sublaminar; DPA: Ápice de la Falange Distal; TP: Plexo terminal; CV: Vasos circunflejos; A: Arco Terminal de los vasos digitales palmares; B: Plexo del talón; SVP: Plexo venoso plantar. D-L. Fotomicrografías representativas de secciones sagitales del corion laminar de un caballo sano (D, G, J), laminítico (E, H, K) e infundido con CMM-AMO (F, I, L) teñidos con violeta de cresilo (núcleos celulares; D-F), PAS (Membrana basal; G-I) o técnicas histoquimicas de Masson (Colágeno; J-L). Observe la restauración del corion laminar en caballos infundidos con CMM-AMO. PEL: Laminillas Epidérmicas Primarias; PDL: Laminillas dérmicas Primarias; SEL: Laminillas Epidérmicas Secundarias; SDL: Laminillas dérmicas Secundarias; BM: Membrana basal. M-O. Micrografías electrónicas representativas que muestran características ultraestructurales de células basales en caballos sanos (M), laminíticos (N) e infundidos con CMM-AMO (O). Observe la recuperación de la disposición de cromatina y tonofilamentos, así como la de desmosomas en caballos infundidos con CMM-AMO. Nu: Núcleo; Tf: Tonofilamentos; Ds y puntas de flecha: Desmosomas; (: edema; Las flechas en los recuadros señalan la membrana basal. Consulte el texto para obtener una descripción detallada de la Figura 2.

Figura 2 Patrones vascular del casco e histológico del corion laminar después de aplicado el tratamiento con CMM-AMO 

Patrones vascular del casco e histológico del corion laminar de los caballos tratados con CMM-AMO

Los caballos infundidos con CMM-AMO, pero no el de simulación, mejoraron su condición clínica y los patrones vasculares de sus cascos al final del sexto mes de tratamiento. Para evaluar si esta recuperación podría estar asociada a la restauración del tejido de los cascos, se realizó una biopsia y se evaluó histológicamente el corion laminar de un caballo sano, simulado/laminítico y laminítico; el segundo y el tercer grupo fueron muestreados antes y al final del tratamiento, seis meses después de la primera biopsia tomada. Los resultados representativos se muestran en la Figura 2. En el casco del caballo sano (Figura 2D), se observaron laminillas epidérmicas y dérmicas primarias interdigitando regularmente. Las laminillas epidérmicas y dérmicas secundarias, por otro lado, corrían en direcciones opuestas, pero paralelas una al lado de la otra. Las laminillas secundarias mostraban extremos redondeados gracias a la cubierta de la célula basal que avanzaba continuamente hasta la punta. Los núcleos de las células basales epidérmicas se yuxtapusieron opuestamente a la membrana basal (no se muestra). Finalmente, la membrana basal formó una capa delgada y continua debajo del revestimiento de los epitelios (Figura 2G) y el colágeno se organizó regularmente en haces paralelos a través de la dermis (Figura 2J). En marcado contraste, la histología de los cascos en caballos con laminitis crónica mostró una pérdida virtual de la arquitectura laminar (Figura 2E), hiperplasia de células basales con numerosos perfiles celulares picnóticos, (Figura 2H), tejido conectivo abundante, así como infiltración perivascular de células mononucleares (no mostrada). No se observó membrana basal (Figura 2H) ni colágeno (Figura 2K). Finalmente, los cascos de los caballos infundidos con CMM-AMO, pero no el de simulación, recuperaron la disposición laminar, la integridad de la monocapa epitelial sobre una membrana basal regular y continua y la organización y presencia de colágeno (Figura 2F, I y L). No se detectó evidencia de infiltración perivascular mononuclear significativa.

Por último, se realizaron observaciones microscópicas electrónicas para evaluar más a fondo la integridad epitelial en los cascos de los caballos infundidos con CMM-AMO. En el caballo sano (Figura 2M), las células basales se unen entre sí por numerosos desmosomas. Sus núcleos eucromáticos mostraron formas irregulares caracterizadas por hendiduras. También presentaron una disposición citoplasmática conspicua de tonofilamentos. La lámina basal densa en electrones a la que estaban unidos era delgada, regular y continua. Los cascos laminíticos (Figura 2N), por su parte, mostraron escasos desmosomas, espacios intercelulares electrolúcidos abundantes. Las células basales tendieron a mostrar núcleos con grupos de cromatina. Los agregados de tonofilamento citoplasmáticos también fueron frecuentes, y no se observó evidencia de membrana basal. Los cascos en caballos infundidos con CMM-AMO (Figura 2O) mostraron una marcada reducción de los espacios intercelulares electrolúcidos. Los desmosomas se convierten en un hallazgo regular y los núcleos celulares vuelven a su forma regular y disposición de cromatina.