Introducción

Streptococcus suis (S. suis) es un patógeno importante en varios países de Europa, Asia y América. Esta especie bacteriana causa septicemia, meningitis, endocarditis, encefalitis y bronconeumonía en cerdos y es un agente zoonótico¹. La mayoría de los cerdos portan cepas de múltiples serotipos en sus tractos respiratorios superiores^2,3. Los síntomas de la infección a menudo se encuentran en lechones a partir de las dos semanas de edad, pero son más comunes en cerdos recién destetados⁴. S. suis crece en placas de agar sangre (PAS) y aparece como pequeñas colonias α-hemolíticas con un diámetro de 0.5 a 1 mm. Las colonias son grisáceas o transparentes y son ligeramente mucoides. Cuando se utiliza la tinción de Gram, los cocos aparecen aislados, en pares y en cadenas cortas. S. suis es una bacteria facultativamente anaeróbica, inmóvil y catalasa y oxidasa negativa, que exhibe metabolismo fermentativo y produce ácido a partir de azúcares, incluido el manitol. S. suis también es amilasa positiva, Voges-Proskauer negativa, NaCl positiva, y resistente a la optoquina; esta bacteria tiene una cápsula con epítopos que permiten la identificación de 35 serotipos.

La identificación de S. suis se realiza a través de métodos bacteriológicos, y se recomienda que las pruebas bioquímicas se complementen con serotipificación confirmatoria. La serotipificación es una parte importante del diagnóstico rutinario y se basa en antígenos polisacáridos capsulares que se encuentran en la superficie de las cepas de S. suis, aunque algunas cepas de casos clínicos se han considerado no tipificables³. En los últimos 12 años, más de 4,500 cepas han sido serotipadas de cerdos enfermos en todo el mundo; los serotipos que se aislaron con mayor frecuencia fueron, en orden decreciente, 2 (28 %), 9 (19.4 %) y 3 (15.9 %), seguidos de los serotipos 1/2 y 7⁵. La distribución de los serotipos aislados de cerdos infectados varía según la ubicación geográfica⁶, pero el serotipo 2 se aísla con mayor frecuencia en casos de meningitis tanto de cerdos como de humanos⁷.

El diagnóstico presuntivo de la infección por S. suis en lechones a menudo se basa en signos clínicos y lesiones macroscópicas; la confirmación se logra aislando el agente infeccioso y observando lesiones microscópicas en los tejidos afectados³. Para los casos clínicos en cerdos, el aislamiento y la identificación de cepas son relativamente fáciles; la identificación exitosa se puede lograr utilizando un mínimo de pruebas bioquímicas, y la confirmación se puede lograr mediante la serotipificación basada en antígenos polisacáridos capsulares. Sin embargo, el uso de kits bioquímicos rápidos y multiprueba puede ser engañoso, ya que algunas cepas de S. suis pueden identificarse erróneamente como Streptococcus pneumoniae, S. bovis y estreptococos del grupo viridans (por ejemplo, S. anginosus y S. vestibularis). Del mismo modo, aunque la serotipificación debe ser parte de la identificación rutinaria de cepas de S. suis recuperadas de cerdos y humanos enfermos para confirmar aún más la identidad del patógeno, puede haber reacciones cruzadas entre los serotipos. Las técnicas de serotipificación son relativamente simples; sin embargo, la producción de antisueros es laboriosa, requiere mucho tiempo y es costosa. Además, hay cepas que no pueden ser serotipadas utilizando antisueros¹. Una desventaja de la serotipificación con antisueros es que las cepas no encapsuladas no pueden ser caracterizadas y se denominan no tipificables. Estas cepas se identifican utilizando técnicas moleculares como la PCR siempre y cuando no se hayan modificado los genes del grupo de genes de la cápsula (cps)⁸.

Clonado el gen que codifica la glutamato deshidrogenasa (gdh) de S. suis tipo 2, observaron que, al igual que los genes que codifican otros GDH, el gen de S. suis estaba altamente conservado y tenía una tasa de mutación muy baja en relación con la de otros genes. Con la ayuda de PCR gdh, se pueden identificar aislados de S. suis. La PCR gdh se ha utilizado como una técnica de diagnóstico rápida y fiable para muestras de animales sanos y enfermos, y también es valiosa en casos humanos⁷.

En el presente estudio, la caracterización de cepas de S. suis aisladas de animales enfermos, incluida la determinación del serotipo, se realizó mediante técnicas moleculares, PCR del gen gdh y PCR múltiple ^8,9. El objetivo de este estudio fue determinar los serotipos de S. suis presentes en granjas porcinas ubicadas en diferentes zonas de la República Mexicana.

Material y métodos

Resultados

Recolección e identificación de muestras microbiológicas

De las 63 muestras (pulmón, corazón y cerebro) recolectadas de animales, 23 fueron positivas para S. suis por PCR, con un producto de 688 pb de longitud amplificado mediante PCR gdh (Figura 1).

Carril 1, marcador de 100-1,000 pb; carril 2, control negativo, C(−); carril 3, control positivo, C(+) = S. suis serotipo 2; carriles 4 a 8, muestras de animales enfermos.

Figura 1 Geles de agarosa (2 %) que muestran resultados de la PCR gdh 

PCR del gen gdh

Los resultados de la PCR de agrupación se muestran en la Figura 2; las muestras se asignaron a los siguientes grupos en función de los tamaños de los productos de PCR: I, II, IV, V y VI, correspondientes a los tamaños de productos de PCR de 933, 823, 455, 265 y 146 pb, respectivamente. La Figura 3 muestra los resultados de la PCR de tipificación, en la que se determinó el serotipo de cada muestra. Los serotipos 1/2 y 2 se caracterizaron por el mismo tamaño de sus productos de PCR (173 pb); los serotipos 3, 5, 7, 8, 9, 17 y 23 produjeron fragmentos de PCR de 214, 720, 566, 446, 368, 445 y 221 pb, respectivamente. Para diferenciar los serotipos 1/2 y 2, se utilizó la coaglutinación con antisueros específicos.

Gel A: carril Mbp, marcador de 100-1,000 pb; carril C(−), testigo negativo; carril C(+), serotipo 2 de S. suis; carriles 1 a 5, muestras de S. suis. Gel B: carril Mbp, marcador de 100-1,000 pb; carril C(−), testigo negativo; carril C(+), serotipo 2 de S. suis; carriles 1 a 8, muestras.

Figura 2 Geles de agarosa (2 %) que muestran los resultados de la PCR de agrupación 

Carril pb, marcador de 100-1,000 pb; carril 1, serotipo 3 de S. suis; carriles 2 a 5, muestras positivas para los serotipos 2 y 1/2; carril 6, serotipo 5 de S. suis; carriles 7 y 8, serotipo 7 de S. suis.

Figura 3 Gel de agarosa (2 %) que muestra los resultados de la PCR de tipificación 

Discusión

La PCR del gen gdh es una técnica atractiva para su uso tanto en laboratorios clínicos como en estudios epidemiológicos⁹. No obstante, debido a la complejidad de la serotipificación de las cepas de S. suis⁸, se ha desarrollado una PCR múltiple de dos pasos. Se secuenciaron y analizaron un grupo de genes de cepas pertenecientes a los 35 serotipos y reportaron que 31 de los serotipos (3 a 13 y 15 a 34) tenían genes específicos, mientras que los serotipos 1 y 14, así como los 2 y 1/2 eran casi idénticos. En el primer paso de la PCR múltiple, las cepas se clasifican en siete grupos de genes cps, llamados grupos de homología (GH). Estos genes cps se agrupan dentro del mismo locus en el cromosoma. A cada GH se le asigna un número (I-VII) e incluye serotipos específicos de S. suis. La PCR de tipificación detecta genes cps específicos para cada grupo e identifica el serotipo. La serotipificación molecular utilizando PCR múltiple es atractiva porque ya no se requieren animales para la producción de los 35 antisueros, ya que los antisueros solo son necesarios para identificar los serotipos 1, 1/2, 2 y 14¹¹. Anteriormente, S. suis se había clasificado en 35 serotipos (1/2 y 1-34), y luego, el número de serotipos se redujo a 33 porque las cepas de los serotipos 32 y 34 se reclasificaron como Streptococcus orisratti. Más recientemente, se ha propuesto eliminar las cepas de los serotipos 20, 22, 26 y 33 del taxón S. suis¹²; sin embargo, en el presente estudio, ninguna de las cepas mexicanas aisladas perteneció a estos serotipos.

En este estudio, se determinaron serotipos de cepas de S. suis aisladas de animales enfermos de granjas porcinas mexicanas, y el tiempo de diagnóstico se redujo, lo que fue una ventaja sobre los métodos de diagnóstico rutinarios. Se encontró que el serotipo 9 fue predominante en siete muestras, aisladas ya sea de Jalisco (cuatro muestras), Veracruz, Michoacán o Puebla (una muestra cada uno), seguido del serotipo 7, con cuatro muestras de Jalisco y Veracruz (dos muestras cada uno), y el serotipo 8, con cuatro muestras de Puebla. Dos muestras de Veracruz fueron positivas para el serotipo 2, y dos muestras de Jalisco y Veracruz fueron positivas para el serotipo 3. Una muestra cada uno fue positiva para los serotipos 1/2, 5, 17 y 23. Jalisco fue el estado que presentó la mayor variación en los serotipos, con seis aislamientos diferentes de pulmón y corazón pertenecientes a los serotipos 3, 5, 7, 9, 17 y 23. En Veracruz se detectaron cinco serotipos en las muestras de pulmón y cerebro. Puebla estuvo representada por dos serotipos de muestras de corazón. Sólo se detectó un serotipo en una muestra de corazón de Michoacán.

La evaluación del serotipo es una herramienta valiosa para comprender la epidemiología de un brote en particular, y la serotipificación también aumenta el éxito de los programas de vacunación dentro de las granjas. Hasta donde se sabe, este es el primer reporte sobre la distribución de serotipos de S. suis en áreas dedicadas a la cría de cerdos en México. Se encontró que los serotipos predominantes de S. suis fueron comparables a los reportados por Gottschalk et al¹⁰ entre 2008 y 2011, quienes confirmaron una prevalencia relativamente baja del serotipo 2 en América del Norte en comparación con la de los países europeos y asiáticos. Entre otros serotipos, los serotipos 1/2, 5, 9 y 14 también se han asociado con brotes en cerdos en América del Norte y Europa¹⁰. Aunque no se evaluó la prevalencia, el serotipo 9 fue el más frecuente, seguido de los serotipos 7 y 8. Estos resultados apoyan una hipótesis previa que sugiere que una menor prevalencia del serotipo 2 de S. suis es común en los países de América del Norte³. Dado que las cepas del serotipo 2 de América del Norte y de Europa son genotípica y fenotípicamente diferentes (con diferente potencial de virulencia)¹³, sería interesante estudiar más a fondo las cepas de México para determinar a qué grupo de cepas pertenecen. Del mismo modo, se ha reportado que las cepas del serotipo 9 de Europa son más homogéneas y probablemente más virulentas que las cepas norteamericanas¹⁴. También se necesita una mayor evaluación de las cepas mexicanas para predecir el nivel de patogenicidad de dichas cepas. Además, se necesitan más estudios, con un mayor número de aislamientos de México, para confirmar esta hipótesis. Aunque no existe una asociación clara entre los serotipos y una condición patológica determinada, se ha reportado que, en los países asiáticos, las cepas aisladas de cerdos enfermos pertenecían principalmente al serotipo 2, seguido de los serotipos 3, 4, 5, 7, 8 y 1/2¹⁵. En algunos países europeos, el serotipo 9 se recupera con mayor frecuencia de animales enfermos, seguido de los serotipos 1 y 14. Sin embargo, en Canadá, los serotipos 1/2, 2 y 3 son los tres serotipos más prevalentes, seguidos de los serotipos 4, 7 y 8¹⁶. En humanos, el serotipo 2 es el serotipo aislado más prevalente, pero también se han reportado los serotipos 1, 4, 5, 14, 16 y 24⁵.

En América del Sur, sólo se han publicado dos estudios, ambos de Brasil, que reportaron el serotipo 2 como el más prevalente, con una media del 57.6 % de todos los casos, seguido, en orden decreciente de prevalencia, por los serotipos 1/2, 14, 7 y 9. Importantes países europeos productores de cerdos, como Dinamarca, Bélgica, Francia, Alemania, Italia y el Reino Unido, no han informado recientemente de la distribución de serotipos recuperados de casos clínicos en cerdos. Los últimos informes de estos países publicaron datos sobre cepas aisladas entre 1990 y 2000, y su falta de información es importante. Los únicos dos países con datos más recientes son España y los Países Bajos. De hecho, en España, el serotipo 2 ya no es el serotipo más prevalente; ahora es el segundo detrás del serotipo 9, seguido de los serotipos 7, 8 y 3. En los Países Bajos, el serotipo 9 fue el más prevalente entre 2002 y 2007, seguido de los serotipos 2, 7, 1 y 4. En estudios realizados antes de 2002, el serotipo 1 parecía ser prevalente en países como Bélgica y el Reino Unido¹.

Conclusiones e implicaciones

Los serotipos detectados en las zonas de cría de cerdos de México incluyeron 1/2, 2, 3, 5, 7, 8, 9, 17 y 23. Jalisco fue el estado que presentó la mayor variación en los serotipos, con seis serotipos diferentes. En Veracruz se detectaron cinco serotipos en las muestras. Puebla estuvo representada por dos serotipos de las muestras. Sólo se detectó un serotipo en una muestra de Michoacán. La evaluación del serotipo es una herramienta valiosa para comprender la epidemiología de un brote en particular, y la serotipificación también aumenta el éxito de los programas de vacunación dentro de las granjas. Estos hallazgos son importantes para la caracterización de los serotipos presentes en México y para la prevención de brotes. Hasta donde se sabe, éste es el primer informe sobre la distribución de serotipos de S. suis en áreas dedicadas a la cría de cerdos en México. La investigación debe continuar para lograr una mejor comprensión de este microorganismo y tener datos más completos. El MALDI TOF MS es un método alternativo para identificar S. suis y la prueba gdh se consideró específica para S. suis. La PCR recN es la prueba reconocida como específica para S. suis y así continuar con las investigaciones.