Introducción

La tuberculosis bovina (TBb) es una enfermedad bacteriana crónica causada por Mycobacterium bovis, bacteria obligada patógena intracelular y de crecimiento lento, que se caracteriza por producir granulomas en diferentes órganos, especialmente en los pulmones y los ganglios linfáticos de diferentes especies animales y de los humanos^1-4. En el ganado bovino, la formación de granulomas (es decir, tubérculos) puede ocurrir en cualquier tejido corporal, aunque las lesiones son más frecuentes en los ganglios linfáticos [retrofaríngea medial (29.4 %), mediastínica (28.2 %), traqueobronquial (18.0 %), mesentérica (2.9 %), parótida (2.4 %) y caudal cervical (2.4 %)], y menos frecuentes en los pulmones (8.0 %)^5-9. La enfermedad provoca una reducción de alrededor del 10 al 20 % en la producción de leche y carne, lo cual limita la venta de los animales infectados y sus productos. Por lo tanto, el control de la tuberculosis bovina es una prioridad de la industria ganadera nacional para asegurar el potencial productivo del ganado y permitir la exportación de sus derivados^10,11.

Como en muchos países del mundo, México tiene un programa nacional de control y erradicación de la tuberculosis bovina. En bovinos de carne este programa ha reducido la prevalencia a <0.5 % en el 85 % del territorio nacional; sin embargo, en las áreas de ganado lechero el programa no ha logrado un control adecuado y la prevalencia es alta (~16 %)^12,13.

El papel de la variabilidad genética bacteriana en el resultado de la infección con M. bovis sigue siendo incierto. Hasta principios de la década de 1990, cuando se introdujeron las huellas de ADN, se creía que el complejo M. tuberculosis era un grupo de bacterias altamente conservadas genéticamente, con diferencias fenotípicas limitadas que influían en la patogénesis. Sin embargo, los datos epidemiológicos sugieren que las diferencias en la transmisibilidad y la virulencia entre cepas están relacionadas con sus genotipos^14-18.

Mycobacterium bovis es un patógeno intracelular que reside principalmente en los macrófagos. Por lo tanto, se pueden utilizar modelos de macrófagos in vitro para determinar la supervivencia intracelular, que a su vez se asocia con la virulencia de las cepas de M. bovis. Por ejemplo, en un estudio se encontró que las cepas virulentas sobreviven más que las cepas avirulentas en macrófagos bovinos¹⁹. El modelo in vitro también ha sido validado para la evaluación de la patogenicidad o virulencia de micobacterias con genes inactivados o para la identificación de genes asociados con la virulencia²⁰.

Algunos bovinos manifiestan una resistencia natural a la TBb. El criterio aplicado para clasificar un animal como resistente se basa en la capacidad de sus macrófagos para permitir el crecimiento de la cepa avirulenta de M. bovis BCG (Bacilo Calmette-Guérin) in vitro; cuando este crecimiento es superior al 65 % se considera el animal susceptible y cuando es inferior al 65 % se considera resistente²¹. En el mismo estudio se demostró que, en comparación con animales susceptibles, los macrófagos de animales resistentes controlaron mejor el crecimiento intracelular de los patógenos B. abortus y Salmonella dublin. Los macrófagos de animales resistentes y susceptibles difieren en su capacidad de control la multiplicación intracelular de M. bovis¹⁹. Por lo tanto, el uso de la evaluación in vitro de la supervivencia intracelular bacteriana en macrófagos de un donante resistente pueda proveer información sobre la virulencia bacteriana.

La genotipificación de M. bovis para el análisis filogenético se ha realizado mediante diferentes métodos: polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP); amplificación aleatoria de ADN polimórfico - reacción en cadena de la polimerasa (RAPD-PCR); espoligotipado; y unidades repetitivas micobacterianas intercaladas - número variable de repeticiones en tándem (MIRU-VNTR). Entre estos métodos se ha identificado gran diversidad de cepas, con genotipos de baja y alta frecuencia^22-24.

El método aleatorio de RAPD-PCR proporciona resultados comparables a los del RFLP, pero evita el uso de materiales radiactivos peligrosos, es menos costoso y más fácil y rápido de realizar. Por ejemplo, mientras que RFLP puede requerir semanas para obtener resultados, RAPD-PCR se puede completar en <5 a 8 h. En comparación con PCR dirigida, RAPD-PCR no requiere el conocimiento de la secuencia constante para desarrollar cebadores. Los oligómeros monocatenarios de 10 nucleótidos de secuencia arbitraria se utilizan individualmente para realizar PCR²⁵. Con el advenimiento de la epidemiología molecular se han desarrollado métodos más rápidos y confiables para el diagnóstico de TBb. Estos brindan información sobre la estructura genética que permita establecer las relaciones entre cepas. El método más popular para el genotipado de M. bovis es el espoligotipado y ha resultado útil en un gran número de estudios con una amplia gama de objetivos y especies animales. En comparación con otros métodos, el espoligotipado es fácil de realizar, requiere cantidades muy pequeñas de ADN, es robusto y altamente reproducible, y puede realizarse con muestras clínicas. Más aún, el espoligotipado es muy útil en cepas de M. bovis con algunas copias del elemento de inserción IS6110, como es el caso en cepas de ganado²². El MIRU-VNTR es una herramienta molecular basada en la amplificación por PCR de 41 loci diferentes de la secuencia de ADN de Mycobacterium que funcionan como marcadores moleculares. Este herramienta permita dar seguimiento rápido, objetivo y de alta resolución en brotes o emergencias epidemiológicas²³.

En un estudio previo realizado por nuestro grupo sobre la genotipificación de cepas de M. bovis de ganado de diferentes regiones de México se identificó la presencia de genotipos (espoligotipo y MIRU-VNTR) de alta y baja frecuencia^22,23,26. Estos hallazgos llevaron a plantear las siguientes preguntas: ¿Son las cepas de baja frecuencia menos virulentas que las de alta frecuencia? Y si es así, ¿es esta la razón de la baja frecuencia de algunos espoligotipos en la población? El objetivo de este estudio fue comparar la supervivencia intracelular de cepas de M. bovis que tienen genotipos de alta o baja frecuencia en bovinos mexicanos usando un modelo de macrófagos procedente de ganado con una resistencia natural a esta bacteria.

Material y métodos

Este proyecto se aprobó por el Comité de Bioética del Departamento de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro con el número de registro 47FCN2016.

Resultados

La proporción de fagocitosis fue de alrededor del 63 % para todas las cepas, lo que indica que los macrófagos fagocitaron un número similar de bacterias en cada cepa. Se contaron las unidades formadoras de colonias (UFC) en los ensayos bactericidas que mostraron permisividad de los macrófagos para la replicación de cepas de campo con genotipos de baja frecuencia y mayor UFC/ml en el tiempo de supervivencia (tiempo 1). En la cepa BCG durante el tiempo 1, la cantidad de UFC disminuyó en comparación con el tiempo de fagocitosis (tiempo 0). El mismo escenario se observó con la cepa de genotipo de alta frecuencia en que la cantidad de UFC/ml fue mayor, mientras que en BCG, la cantidad de UFC/ml disminuyó (Figura 1).

Figura 1 Unidades formadoras de colonias (UFC) de cepas de M. bovis con genotipos de alta (+) y baja (-) frecuencia, cuantificadas a las 0 (T0) y 24 (T1) horas después de la infección de macrófagos de bovinos con un fenotipo resistente 

Se realizó una comparación del promedio de UFC por grupo utilizando la prueba t de Student. No se encontraron diferencias (P>0.05) entre los grupos de alta y baja frecuencia ni en fagocitosis (T0) y ni en supervivencia (T1) (Figura 2). Dentro de cada grupo se realizó un análisis estadístico utilizando la prueba t de Student pareada para comparar el promedio de UFC entre la fagocitosis y la supervivencia, en lo cual sí hubo diferencias (P<0.05) (Figura 3).

Figura 2 Comparación de los promedios de UFC de cepas de alta y baja frecuencia en el tiempo 0 y en el tiempo 1 

El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student para datos apareados. Los asteriscos indican diferencia (P<0.05) entre los tiempos.

Figura 3 Comparación de los promedios de UFC en el tiempo 0 y el tiempo 1 en cepas de alta y baja frecuencia 

En el ensayo de crecimiento intracelular en cepas del genotipo de baja frecuencia, la cepa 906 fue la que presentó la mayor supervivencia (214 %), mientras que la cepa 776 tuvo la más bajo (153 %). El crecimiento intracelular en la cepa 694 fue de (205 %) y el crecimiento en la 301 fue de (172 %) (Figura 4). En los grupos de alta frecuencia, la cepa 777 tuvo el mayor crecimiento (208 %), mientras que el menor correspondió a la 833 (169 %). El crecimiento en la 351 fue de 207 % y el crecimiento de la 559 fue de (187 %). La cepa control (BCG) mostró un crecimiento del 57 %, lo cual valida el ensayo porque confirma la resistencia del fenotipo bovino resistente.

Los asteriscos indican diferencia (P<0.1) según una prueba no paramétrica de comparaciones múltiples de Dunn

Figura 4 Crecimiento intracelular de cepas de M. bovis de baja y alta frecuencia y M. bovis avirulento (BCG) en macrófagos de bovinos con fenotipo resistente 

En las comparaciones del crecimiento intracelular entre cepas individuales se observó una diferencia (P<0.01) entre la cepa de baja frecuencia 776 y la cepa de alta frecuencia 351. La cepa 776 (SB1495) se colectó de un bovino del estado de Coahuila, mientras que la cepa 351 (SB0669) correspondió a un bovino del Estado de México. Hubo diferencias (P<0.01) entre las cepas de baja frecuencia 776 (SB1495) y 694 (SB1118), y entre la cepa de BCG atenuada y las cepas de campo analizadas (P<0.01) (Figura 4). No hubo diferencia (P>0.05) en la comparación de los promedios de incremento intracelular entre las cepas de alta frecuencia y las de baja frecuencia (Figura 5).

Figura 5 Comparación de los promedios de crecimiento intracelular de cepas de alta y baja frecuencia. Análisis estadístico mediante la prueba no paramétrica de Wilcoxon 

Discusión

Se ha demostrado que el genotipo de las micobacterias es uno de los factores que contribuyen a la gravedad de la enfermedad y que puede desempeñar un papel en la aparición de farmacorresistencia, susceptibilidad, respuesta del huésped y transmisibilidad. Sin embargo, se desconocen los factores genéticos que determinan la asociación de diferentes linajes micobacterianos con diferentes niveles de gravedad de la enfermedad^30,31. La alta frecuencia de ciertos genotipos de cepas puede ser indicativo del movimiento de ganado infectado en ausencia de adecuadas medidas de control sanitario. Por otro lado, la baja frecuencia de algunos genotipos puede deberse a la falta de representatividad en el muestreo; es decir, el número de aislamientos analizados es más bien una consecuencia de su disponibilidad debido a una baja prevalencia en la región. Este sugiere que la escasa o nula presencia de ciertos genotipos en algunas regiones sea más una consecuencia de la pequeña cantidad de aislamientos aportados y no de una ausencia real²².

En los resultados del presente estudio, la proporción de fagocitosis no fue diferente entre las cepas evaluadas; sin embargo, sí se encontraron diferencias estadísticas entre las cepas de campo y la cepa BCG atenuada de M. bovis. La BCG mostró menor supervivencia (65 %) que las de campo, lo cual confirma que los macrófagos usados en los ensayos provenían de un bovino con fenotipo resistente y que las cepas de campo eran más virulentas que la BCG. Estos resultados coindicen con estudios anteriores²¹. Los resultados de un estudio sobre el Brucella abortus sugirieron que las diferencias en la adhesión bacteriana a células entre el ganado resistente y el susceptible podría estar relacionada con los componentes de la pared celular en este bacteria, lo cual tiene mecanismos distintos a M. bovis para evadir la respuesta inmune y la eliminación por macrófagos²⁸. En otro estudio¹⁹, se realizaron ensayos bactericidas utilizando una cepa de campo y encontraron resultados similares a los del presente estudio en cuanto a la diferencia de supervivencia con respecto a la cepa BCG atenuada, con un crecimiento del 165 % en macrófagos de bovinos resistentes. Los macrófagos que se obtuvieron de bovinos con genotipo resistente produjeron una mayor cantidad de óxido nítrico (NO) en comparación con los macrófagos de bovinos susceptibles. En bovinos, el NO juega un papel importante en la eliminación de patógenos intracelulares por macrófagos^27,29.

El M. bovis virulento tiene varias formas de evadir los mecanismos bactericidas del sistema inmunológico innato. Uno de los mecanismos más conocidos e importantes es el “estallido respiratorio” para la eliminación de bacterias fagocitadas, aunque M. bovis tiene la capacidad de evadirlo³². Además, M. bovis puede evade la eliminación al interrumpir la maduración de los fagosomas, impidiendo su fusión con los lisosomas, y también parece inhibir la presentación de antígenos al reducir la expresión de moléculas MHC II^33,34.

En los resultados del presente estudio se encontraron diferencias estadísticas entre tres de las ocho cepas de campo, entre los grupos de frecuencias altas y bajas, y dentro del mismo grupo de frecuencia baja. Esto sugiere que las cepas evaluadas difieran en cuanto a sus virulencias, y que la frecuencia del genotipo en el ganado no está relacionada con la virulencia de la cepa, cuando se evalúa con la metodología aplicado en este estudio. Una limitación en el presente estudio fue que el número de cepas evaluadas no alcanzó la representatividad. En un estudio previo se intentó asociar los espoligotipos con la virulencia en bovinos por medio de relacionar el espoligotipo con el número de lesiones y el grado de lesión en la canal³⁰. Los resultados mostraron que los espoligotipos SB0273 y SB0520 tenían alta virulencia y baja frecuencia. Otro intento a relacionar la virulencia con diferentes genotipos usó un modelo de tuberculosis pulmonar progresiva en ratones, y encontró que los genotipos de animales salvajes eran más virulentos que los aislados de humanos o ganado³⁶; sin embargo, se propone que el M. bovis es muy virulento en el modelo de ratón^35,36.

En los rebaños de Irlanda del Norte, se han identificado diferencias en el genotipo de patógenos por el tamaño del brote y la proporción de casos con lesiones visibles en la canal. Estos resultados sugieren que los genotipos de M. bovis, aunque están estrechamente relacionados, pueden variar en términos de transmisibilidad. Los genotipos demuestran diferencias en el grado en causan lesiones visibles, en sus patrones de respuesta inmune y en sus niveles de virulencia. Sin embargo, los factores genéticos que determinan la asociación de diferentes genotipos de micobacterias con diferentes grados de gravedad de la enfermedad siguen siendo en gran parte desconocidos. En M. tuberculosis se ha encontrado que entre sus seis genotipos principales existe una variación en inmunogenicidad, virulencia y patología, y que hay evidencia de una coevolución huésped-patógeno en las regiones donde se establecen estos genotipos³⁷.

La gran diversidad genética de las cepas del complejo M. tuberculosis (CMTB) sustenta un importante escenario natural, donde estas cepas (particularmente M. bovis) se han diversificado. Este es un interesante contexto epidemiológico y evolutivo en el que pueden surgir nuevos genotipos que luego se diversifican para adaptarse mejor al huésped bajo una variedad de factores ambientales y antropogénicos³⁸.

En los países de alta incidencia, la aparición de una cepa exitosa en cuanto a su epidemiología se ha atribuido a la virulencia debido a las características codificadas en el genoma bacteriano; sin embargo, estas características están relacionadas con genes distintos del genotipado³⁹. Esto se debe a que estos métodos de genotipificación cubren solo una pequeña parte de los aproximadamente 4,000 genes contenidos en los 4.4 Mb del genoma micobacteriano y no están directamente relacionados con la virulencia⁴⁰.

Conclusiones e implicaciones

Los resultados de este estudio contribuyen a la comprensión de la interacción huésped-patógeno. Las bacterias intracelulares intentan sobrevivir al ambiente hostil presentado por la respuesta inmune donde uno de los efectores principales es el macrófago. Estos resultados ayudan a validar el ensayo microbicida como una herramienta para evaluar, en cierta medida, la virulencia de patógenos bacterianos de vida intracelular, además de sugerir que los genotipos de las bacterias no están directamente relacionados con la virulencia.