Animales y colecta de semen

Para este estudio se utilizaron cuatro carneros maduros de la raza Merino de entre 3 y 5 años de edad. Los animales se alojaron en corrales individuales ubicados en la Diputación de Córdoba (España). Se alimentaron con un concentrado comercial (0.5 kg/día), heno de alfalfa, agua y minerales. Se tomaron muestras de semen una vez a la semana durante la temporada de no reproducción (marzo-junio) mediante una vagina artificial con una oveja como celadora. Los eyaculados se mantuvieron a 37 ºC y se cuantificaron la motilidad de la masa (utilizando una escala de 1 a 5; aumento de 40×; Olympus, Tokio, Japón), la concentración de espermatozoides (Accurread, Tecnologías IMV, Francia) y el volumen del eyaculado. Se utilizaron los eyaculados con una motilidad de masa ≥4, una concentración ≥3000 × 10⁶ espermatozoides/ml y una motilidad individual ≥70 %.

Todos los experimentos se autorizaron por el Comité de Bioética de la Universidad de Córdoba (n. 2018PI / 29) y se llevaron a cabo de acuerdo con el Reglamento Español de Protección Animal (RD 53/2013), tal y como establece el Reglamento UE 2010/63.

Diseño experimental

Después de su evaluación, los eyaculados de los cuatro carneros se diluyeron (1:2) con el diluyente TCFEY: Tris (33.19 g/L), fructosa (9.55 g/L), 10% de yema de huevo clarificada, ácido cítrico (17.29 g/L), penicilina G (4 g/L) y estreptomicina (3 g/L). Se combinaron en agua bidestilada, se tomaron dos alícuotas de semen y se colocaron en tubos cónicos para centrifugación (300 xg durante 20 min) (Figura 1). Después de eliminar el sobrenadante, se añadió TCFEY hasta alcanzar una concentración final de 800 x 10⁶ espermatozoides/ml (C800) y 3000 x 10⁶ espermatozoides/ml (C3000). La calidad de los espermatozoides se evaluó en cada concentración.

Figura 1 Diseño experimental para la evaluación de la calidad de los espermatozoides y las subpoblaciones en las diferentes fracciones producidos por SLC de muestras con concentraciones de 800 y 3000 × 10⁶ esp/ml (C800 and C3000).  

Se preparó SLC a base de sílice recubierta de silano (BoviPure y BoviDilute, Nidacon, Suecia), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aunque estas soluciones se desarrollaron para el esperma de toro, se pueden usar también para los pequeños rumiantes. En resumen, se colocó una capa de 1.5 ml de BoviPure al 80% (v/v) en un tubo cónico de 15 ml. En la parte superior se colocó una capa de una muestra de semen de C800 o C3000 y se centrifugó a 300 xg por 20 min. Se descartó el plasma seminal (aprox. 1.5 ml) y se aislaron tres fracciones distintas por muestra: la superior (F1), la media (F2) y la inferior (F3). Cada fracción tenía un volumen de aproximadamente 0.5 ml. Se extrajeron utilizando pipetas Pasteur en movimientos circulares. En cada fracción de cada muestra se cuantificó la tasa de recuperación de espermatozoides (TRE), su calidad (la motilidad, concentración, viabilidad, morfología y funcionalidad de la membrana del esperma) y las subpoblaciones de ellos. Se replicó el experimento seis veces utilizando un total de 24 eyaculados.

Tasa de recuperación de los espermatozoides

Se diluyeron las muestras a 1:200 y se evaluó su concentración por medio de una camera de conteo Thoma. Se calculó la TRE por cada fracción usando la fórmula:

Evaluación de la motilidad de los espermatozoides

Para evaluar la motilidad de los espermatozoides se diluyeron las muestras con TCFEY hasta alcanzar una concentración final de 25 x 10⁶ espermatozoides/ml. Se mantuvieron las muestras a una temperatura de 37 ºC durante 10 min y posteriormente se colocó una gota (5 µl) de cada muestra en un portaobjetos cubierto con cubreobjetos de 22 × 22 mm. Se tomaron imágenes a una velocidad de 25 fotogramas por segundo de manera aleatoria de cuatro campos, o hasta alcanzar imágenes de un mínimo de 500 espermatozoides. Se consideró un área de la cabeza de los espermatozoides de entre 10 y 70 µm². Los espermatozoides con una velocidad promedia de trayectoria (VAP) >10 µm/seg se clasificaron como móviles, y los que se desviaron <80 % de una línea recta se clasificaron como móviles de manera linear. En cada muestra de esperma analizada se midieron diez parámetros: motilidad total (TM, %); motilidad progresiva (PM, %), velocidad curvilínea (VCL, µm/seg); velocidad en línea recta (VSL, µm/seg); velocidad de la trayectoria promedia (VAP, µm/seg); rectitud (STR, %); linealidad (LIN, %); oscilación lateral de la cabeza del espermatozoide (WOB,%); amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH; µm); y frecuencia de latido/cruzamiento (BCF; Hz). Se utilizó el software ISAS v.1.2 (Proiser, Valencia, España) para la evaluación de la motilidad de los espermatozoides.

Evaluación de la funcionalidad de la membrana de los espermatozoides

Se utilizó la prueba de hinchazón hipoosmótica (HOST)¹⁶ para medir el estado funcional de la membrana de los espermatozoides. Se diluyeron 10 µl de cada fracción de semen en 100 µl de solución de citrato de sodio hipoosmótico (1.351 g de fructosa, 0.735 g de citrato de sodio y 100 ml de agua bidestilada; 100 mOsmol/kg), y se entibió la solución a la temperatura ambiente durante 30 min. Después de la incubación, las muestras se fijaron en glutaraldehído al 2% y se observaron con microscopía de contraste de fase (aumento 400x). La membrana de los espermatozoides se consideró intacta y funcional cuando la cola de los espermatozoides exhibía enrollamiento. Se analizaron un total de 200 espermatozoides y los resultados se expresaron como un porcentaje de la endosmosis positiva.

Evaluación de la morfología de los espermatozoides

Se usó la tinción de hemacolor (Merck, Darmstadt, Alemania) para identificar las diferentes anormalidades morfológicas del esperma¹⁷. Se colocaron 10 µl de semen sobre un portaobjetos y se tiñó siguiendo las indicaciones del fabricante. Se cuantificó el porcentaje de las anormalidades basado en el conteo de aproximadamente 200 células espermatozoides (aumento de 1000x) (Olympus, Tokio, Japón).

Evaluación de la viabilidad de los espermatozoides

La viabilidad de los espermatozoides se evaluó mediante tinción con eosina-nigrosina¹⁸. En resumen, se disolvieron 0.67 g de Eosin Y (Panreac, Barcelona, España) y 0.9 g de cloruro de sodio (Panreac, Barcelona, España) en agua bidestilada (100 ml) bajo un calentamiento suave, y luego se agregaron 10 g de nigrosina (Panreac, Barcelona, España). Se mezcló una gota de 10 µl de muestra de semen con una gota de 10 µl del colorante sobre un portaobjetos de vidrio y se realizó el frotis. Para la evaluación, se analizaron 200 espermatozoides (aumento de 1000x) (Olympus, Tokio, Japón). Los espermatozoides se clasificaron como vivos (es decir, con la membrana intacta) cuando las células no estaban teñidas, o muertas (es decir, con la membrana alterada) cuando se tiñeron de rosa con eosina. Los resultados se expresaron como porcentaje de espermatozoides vivos.

Análisis estadístico

Los datos se muestran en forma de la media ± DE. Se probó la normalidad de los datos mediante la prueba de Shapiro-Wilks, y cuando los datos no eran normales se transformaron. A las variables expresadas como porcentajes (LIN, STR y WOB) se transformaron en arcoseno, mientras que los que están expresados como valores absolutos (VCL, VSL, VAP, ALH y BCF) se transformaron por medio de un logaritmo. Para identificar la TRE y la calidad de los espermatozoides, se aplicó un ANOVA de una vía para comparar los parámetros de los espermatozoides en las diferentes fracciones producidas por SLC, en las dos concentraciones (C800 y C3000), con los valores de esperma fresco. Se utilizó la prueba post hoc de Bonferroni cuando se detectaron diferencias significativas entre las fracciones (P≤0.05).

Con el fin de identificar las subpoblaciones de espermatozoides específicas en función a los parámetros cinemáticos, se evaluó un total de 20,485 observaciones de semen fresco y procesado por medio de procedimientos de agregación. Para comenzar, se realizó un análisis de componentes principales (PC) de los datos para reducir las ocho variables estudiadas (VCL, VSL, VAP, LIN, STR, WOB, ALH y BCF) al menor número de las combinaciones lineales de las variables iniciales (llamados PC) que guardarían la mayor cantidad de la información contenida en las variables originales. Es de esperar que algunos pocos de las PC explican una alta proporción de la varianza total. Se utilizó el método de rotación varimax y se seleccionó el número de las PC aplicando el criterio de Kaiser para identificar aquellos con un valor propio superior a 1. Se utilizó un procedimiento de agregación de dos pasos para analizar los índices derivados de los espermatozoides producidos por los PC. Se identificaron las diferentes subpoblaciones y se detectaron valores atípicos. Se analizó el tipo de subpoblación de espermatozoides en cada muestra de semen y se utilizó la prueba de Ji-cuadrada para comparar las frecuencias relativas de subpoblaciones dentro de cada muestra (o fracción) de semen. Los análisis estadísticos se hicieron con el paquete SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, EE. UU.).

Tasa de recuperación por SLC

El porcentaje de recuperación de espermatozoides por SLC en la fracción que, en teoría, contendría los mejores espermatozoides (F3) no difirió (P>0.05) entre las concentraciones de C800 (36.1%) y C3000 (27.5%) (Figura 2). En la F1, el porcentaje de recuperación fue mayor en las muestras C3000 que en las C800; lo contrario ocurrió en la F2. En las muestras de C800, no hubo diferencias entre las tres fracciones, mientras en las de C3000 el porcentaje de recuperación en la F1 fue mayor que en la F3.

* Diferencias (P≤0.05) entre las dos concentraciones dentro de la misma fracción.

^{A, B} Diferencias (P≤0.05) entre las fracciones dentro de la misma concentración.

Figura 2 Tasa de recuperación de espermatozoides (%) en las tres fracciones producidas por SLC en muestras de semen con concentraciones de 800 y 3000 × 10⁶ esp/ml; (C800 and C3000) 

Evaluación de los espermatozoides

Los valores de motilidad que corresponden a los espermatozoides aislados en las diferentes fracciones no difirieron entre las fracciones ni entre las concentraciones (C800 and C3000) (Cuadro 1).

Los resultados de la viabilidad, la morfología y la funcionalidad de la membrana de los espermatozoides mostraron que la F3 tuvo los valores más altos (Cuadro 2), aunque no fueron diferentes (P>0.05) de los valores de las otras fracciones ni entre las dos concentraciones.

Las subpoblaciones de los espermatozoides

Entre los 20,485 espermatozoides individuales motiles evaluados en este estudio, se identificaron tres subpoblaciones (Cuadro 3).

En el análisis de PC se identificaron tres componentes que explicaron un 76.70 % de la varianza total (Cuadro 4). Los parámetros de VCL, VSL y VAP se asociaron con el PC1, los de STR y LIN con el PC2 y el WOB con el PC3.

Los espermatozoides incluidos en la subpoblación 1 (SP1) mostraron una velocidad más baja (basada en VCL, VSL y VAP) que los de las otras fracciones y ninguna motilidad progresiva (valores bajos de LIN, STR, WOB, ALH y BCF); un total del 19.1 % de los espermatozoides pertenecían a la SP1. Los que estaban en la SP2 mostraron una velocidad alta (VCL, VSL, VAP y ALH), una progresividad alta (altos valores de LIN, STR y WOB) y buenos valores para el ALH y BCF. Se podría definir esta subpoblación como constituida por espermatozoides rápidos y progresivos; el 43.7 % de los espermatozoides pertenecían a la SP2. Los que estaban en la SP3 mostraron valores altos de VCL, ALH y BCF, pero bajos valores de LIN y STR. Estos espermatozoides se podrían definir como rápidos y no lineales, y representaron el 37.2 % del total.

En las muestras de C800, la SP3 fue más alto (P≤0.05) en las F2 y F3 que, en la F1, mientras que las SP1 y SP2 fueron más altos (P≤0.05) en la F1 que en las demás fracciones (Figura 3). El patrón era diferente en las muestras de C3000. La SP2 (rápido y progresiva) fue más alta (P≤0.05) en la F1 que en las F3 (fracción selectiva) y F2. La alta concentración causó que la mayoría de los espermatozoides en la F3 (la que, en teoría, contiene los mejores espermas) provenían de la SP3 (rápido y no progresivo).

^{a b} Distintas letras entre las fracciones de la misma concentración indican diferencia (P≤0.05).

Figura 3 Distribución relativa de las frecuencias de lassubpoblaciones de los espermatozoides en las fracciones de semen producidos por SLC en las muestras con concentraciones espermáticas de 800 y 3000 × 10⁶ /ml (C800 and C3000)