La terapia con antibióticos representa uno de los avances médicos más importantes del siglo XX, y es un recurso valioso para el combate de enfermedades infecciosas causadas por bacterias. Sin embargo, su uso terapéutico ha sido asociado con la aparición de bacterias resistentes a antibióticos¹. Reconocido como un problema global, genera un aumento en el costo de tratamientos debido a la rápida diseminación de las cepas por la migración humana e industrialización tanto alimentaria como animal. Esta resistencia puede ser causada por la presencia de genes de resistencia a los antibióticos (ARG), los cuales pueden ser adquiridos y transferidos mediante elementos genéticos móviles (MGE) como los bacteriófagos².

Los bacteriófagos lisogénicos con la presencia de ARG se han encontrado, en su mayoría, en ambientes acuáticos^2,3, pero de igual forma los han reportado en muestras fecales obtenidas en hospitales de pacientes clinicamente sanos, sugiriendo que los fagos pueden estar presentes en todos los ambientes sin ser detectados en programas de inocuidad^4,5. El conjunto de estudios realizados en bacteriófagos lisogénicos no solo muestran la presencia de los ARG que ha cobrado la vida de miles de personas y causado pérdidas millonarias en todo el mundo, sino también la contribución de los fagos en la propagación de los ARG en el ambiente¹. Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo colaborar en la comprensión del rol que juegan los bacteriófagos en la propagación de ARG determinando la prevalencia de los genes bla _TEM , qnrA y qnrB en el ADN bacteriano y fágico.

Durante septiembre - diciembre de 2015, se realizó un muestreo probabilístico de juicio o de criterio⁶, donde se recolectaron 48 muestras con base a la normatividad oficial⁷ provenientes de cuatro rastros municipales (SLH1, SLH2, SLH3 y SLH4), 16 de estas fueron tomadas de agua potable (AP), 16 de agua residual (AR) y 16 de alcantarillas (AC) ubicadas en el área del sacrificio; para su recolección se utilizó un hisopo, el cual se frotó sobre las orillas de la superficie de la tapa⁷. Para la confirmación genotípica de aislamiento de E. coli se usó una PCR punto final amplificando el gen uidA siguiendo las condiciones de Aguilar et al⁸. Los primers usados son mencionados en el Cuadro 1. Se usaron 14 antimicrobianos con diferente margen de concentración para realizar la prueba de sensibilidad mediante el método de difusión en disco de acuerdo a los lineamientos del CLSI⁹. La interpretación de los resultados se hizo de acuerdo a los lineamientos de CLSI¹⁰.

Mediante la metodología descrita por Raya y Hébert¹¹ se realizó el aislamiento fágico con Mitomicina C, comprobando la existencia de lisis fágica con el método de spot test y la prueba de “doble capa”. Para la obtención de ADN fágico se usó el método fenol-cloroformo descrito por Pickard¹². Se confirmó la eliminación de ADN bacteriano y la presencia del ADN fágico por una prueba de PCR de punto final en un termociclador Multigene^TM Mini Personal (Labnet International Inc., Edison, NJ, USA) utilizando como control negativo la amplificación del gen uidA³.

Para la extracción de ADN bacteriano se consideró la metodología propuesta por Ahmed et al¹³. La concentración y pureza del ADN fágico y bacteriano fueron determinadas usando un espectrómetro (Quawell q500). Para la detección de los genes qnrA, qnrB y bla _TEM se empleó una PCR de punto final con las condiciones que reporta Kraychete et al¹⁴ y Dallene et al¹⁵ respectivamente. Los análisis estadísticos se realizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de correlación lineal usando StatCalc Version 8.2.2 (Copyright ( 2016 AcaStat Software). Se consideraron diferencias significativas a un nivel de P(0.05.

De las 48 muestras recolectadas se obtuvieron 37 (77 %) aislamientos de Escherichia coli mostrando diferentes índices de resistencia (Cuadro 2). Del total de aislamientos, 13/37 (35.1 %) fueron recolectados de SLH1 mostrando alta significancia en comparacion con SLH2, SLH3 y SLH4 donde se aislaron 8/37 (21.6 %) en cada uno, debido al número de sacrificios practicados (P(0.05). Cabe resaltar que hubo una correlación positiva (r=1) entre los 19 (51.3 %) aislamientos procedentes de agua residual y 18 (48.6 %) de alcantarilla, ya que ambos sitios mantienen condiciones similares y necesarias para un crecimiento bacteriano adecuado.

El número de aislamientos con ARG fue significativamente alto en agua residual comparada con el alcantarillado (P(0.05), no se obtuvieron aislamientos de agua potable (Cuadro 3). Debido, probablemente, a la amplia gama de variantes que tienen los ARG y los diferentes mecanismos de resistencia, se obtuvieron aislamientos bacterianos con resistencia fenotípica intermedia y sensibles que amplificaban bla _TEM , qnrA y qnrB.

Se obtuvo un pool de bacteriófagos de cada uno de los aislamientos bacterianos para la detección de los genes bla _TEM , qnrA, qnrB; todos los aislamientos bacterianos presentaron fagos atemperados. El Cuadro 4 muestra que el gen bla _TEM fue el más prevalente en aislamientos bacterianos y fágicos; estos resultados coinciden con los de Colomer-Lluch et al³ quienes reportan a este gen con más prevalencia (80 a 100 %) y altas densidades de copias de genes (±3.3 log₁₀) en muestras recolectadas de plantas tratadoras de agua residual y rastros. El gen bla _TEM es el más reportado a nivel global^16,17, sobre todo en bacterias Gram negativas; esto se supone por su diseminación a través de aves acuáticas migratorias y a la gran cantidad de enzimas (-lactamasas sintetizadas por las bacterias. Por otra parte, la prevalencia de qnrA y qnrB fue de 8.1 y 29.7 % en aislamientos bacterianos respectivamente, mientras que en aislamientos fagicos, respectivamente, fue de 2.7 y 10.8 %. La prevalencia, en aislamientos fágicos, reportada en este estudio contrasta con lo mencionado por Colomer-Lluch et al^3,18 en muestras recolectadas de aguas residuales; así mismo, se reporta⁴ una alta prevalencia alta del gen qnrA en muestras obtenidas de un Centro de Salud. Aunque la prevalencia no es alta, actualmente la resistencia a las quinolonas ha ido en aumento; esto se debe al uso indiscriminado en la clínica veterinaria y humana¹⁸.

Se obtuvo una correlación positiva (r=0.99) entre la cantidad de ARG registrados en el ADN bacteriano y ADN fágico (Cuadro 4). Este hecho es indicativo que en bacterias multirresistentes existe la presencia de fagos que, según diversos autores, pueden diseminar porciones genómicas bacterianas con la presencia de ARG en el ambiente y transducirlos a bacterias comensales y patógenas, confiriéndoles nuevas habilidades de adaptación (corto plazo) y evolución (largo plazo), y contribuir a la generación de nuevas cepas patógenas causantes de enfermedades mortales.

Además, el mayor número de aislamientos bacterianos con la presencia de los tres genes que confieren resistencia a los antibióticos se registró en SLH1, mientras que en SLH2 se registró la presencia de los tres genes en aislamientos fágicos (Cuadro 4). La contaminación e insalubridad mostrada en los rastros municipales reúnen factores como temperatura, pH, concentración, estado fisiológico bacteriano y fágico necesarios para el desarrollo de una transducción exitosa.

El estilo de vida de los seres humanos ha provocado que la resistencia vaya en aumento, y aunque el uso indiscriminado e innecesario de los antimicrobianos actualmente se comienza a controlar; en diversos estudios reportan bacterias altamente virulentas con una gran resistencia a los antibióticos en diversos sitios de acciones antropogénicas¹. En este estudio, los aislamientos bacterianos y fágicos con la presencia de los genes bla _TEM , qnrA y qnrB muestran una distribución muy variable registrando la presencia de al menos uno de estos genes en los rastros. Los fagos, al pertenecer al grupo de MGE, juegan un rol muy importante en la transferencia de ARG, entre bacterias patógenas - comensales y patógenas - patógenas⁵. La comprensión de los mecanismos de resistencia a antimicrobianos, será útil para el desarrollo de estrategias efectivas para la reducción de este fenómeno.