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Introducción
La neosporosis fue asociada por primera vez en caballos al reportarse la evidencia de Neospora caninum en un feto tardío y en la placenta1; el segundo caso, fue en un potro de un mes de edad, que presentó ceguera congénita y desórdenes neurológicos2. Estudios moleculares, antigénicos y estructurales demuestran que la especie aislada en caballos con problemas neurológicos es diferente a la reportada, y la denominan Neospora hughesi3. Las especies caninum y hughesi son protozoarios intracelulares obligados del género Neospora, pertenece al Phylum Apicomplexa, clase Sporozoea, orden Eucoccidiida, familia Sarcocystidae4. La N. caninum en caballos ha sido asociada a abortos y problemas reproductivos5-8, mientras que N. hughesi está relacionada con enfermedades neurológicas9-11, también, asociada con Sarcosystis neuronae, causante de mieloencefalitis protozoaria equina (MPE), identificada como una enfermedad neurológica grave de los caballos, que produce pérdidas significativas en la producción equina, principalmente reportado en Estados Unidos12.
Los hospederos definitivos de N. caninum identificados son el perro doméstico13, coyote14, dingo australiano15 y lobo gris16, y como hospederos intermediarios varias especies silvestres y domésticas17, sin embargo, los hospederos definitivos de N. hughesi, no se han identificado y el caballo es considerado como único hospedero intermediario potencial18. La infección puede ocurrir debido a la ingestión de ooquistes esporulados en alimento o agua contaminados; con respecto a la transmisión vertical actualmente es considerada solo como ruta alternativa19,20.
Las técnicas serológicas utilizadas para la identificación de anticuerpos de Neospora spp., son: técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI), ensayo inmunoenzimático (ELISA), test de aglutinación de Neospora (TAN), Western blot (WB), manejan taquizoítos de N. caninum como antígeno, el uso de éste supone seropositividad para Neospora spp., debido a la reacción cruzada que presenta el parásito21, solo la biotecnología del ADN se utiliza para distinguir N. hughesi de N. caninum22. El objetivo del estudio fue detectar la presencia de anticuerpos anti-Neospora spp., asociados a factores de riesgo en caballos de México.
Material y métodos
Lugar de estudio
Para este estudio se seleccionaron cuatro regiones de México según sus características geográficas y climáticas: Región Centro, Región Norte, Región Occidente, y Región Sur (Figura 1).
Diseño del trabajo
Se realizó un estudio epidemiológico de tipo transversal, durante el periodo comprendido del mes de octubre de 2016 a octubre de 2017. Se llevó a cabo en dos etapas; de campo y de laboratorio. Durante la etapa de campo se colectaron 5 ml de sangre completa en tubos vacutainer sin anticoagulante (BD Vacutainer®) por punción de la vena yugular de caballos aparentemente sanos, obteniendo un total de 684 muestras de las cuales correspondieron 75 a la Región Centro (10.96 %), 54 a la Región Norte (7.89 %), 298 a la Región Occidente (43.57 %) y 257 a la Región Sur (37.57 %).
A todos los animales que fueron muestreados se les realizó un examen físico para determinar su estado de salud, y se aplicó una encuesta a los propietarios de los caballos, la cual consistió en recabar información de las características generales de los animales (raza, edad, sexo y estado reproductivo) y sobre el manejo especifico de la cuadra (uso de caballos, alimentación, alojamiento, fuentes de agua y contacto con otros animales). Las muestras de sangre obtenidas, se transportaron al laboratorio en refrigeración a 4.0 °C, donde fueron centrifugadas a 3,500 rpm durante 10 min para obtener el suero, el cual posteriormente fue separado con una pipeta de transferencia a tubos EppendorfTM de 1.5 ml, los cuales se almacenaron a -20 °C hasta su análisis.
Prueba serológica
La técnica de IFI, se realizó mediante un kit comercial para detectar anticuerpos IgG circulantes específicos de Neospora spp., utilizando laminillas antigenadas con taquizoitos de N. caninum cepa NC-1, (SLD-IFA-NC) y conjugado anti-equine IgG marcado con isotiacianato de fluoresceína (FITC-Conjugate VMRD). Las muestras de suero se diluyeron 1:25 en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se usó un control positivo y negativo como estándar, realizando la técnica de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Todos los sueros que presentaron fluorescencia en la dilución inicial se consideraron positivos y se diluyeron aún más hasta el punto final del título. La dilución más alta del suero que presenta fluorescencia se consideró como el título de punto final en esta técnica.
Análisis de los datos
Los datos generados a través de la encuesta (variables independientes) y los resultados positivos a la presencia de anticuerpos de Neospora spp. (variable dependiente) fueron analizados por el Software Estadístico STATA versión 10. Se obtuvo la distribución de la seroprevalencia con las variables independientes. La asociación entre la seroprevalencia de N. caninum en caballos y la presencia de otros animales, se realizó mediante un modelo de regresión logística (Ji cuadrada), considerando P<0.05. Finalmente se calcularon las razones de probabilidad (OR) entre los resultados positivos, los resultados negativos y la relación con el intervalo de confianza.
Resultados
Se detectó la presencia de anticuerpos anti-Neospora spp. en muestras de suero de caballos analizados mediante la técnica de IFI (Nc-1 Neospora caninum); las muestras de suero que presentaron títulos en una dilución de 1:50 fueron consideradas positivas. La seroprevalencia general obtenida fue de 2.34 % (16/684).
En base al total de animales seropositivos a Neospora spp, se analizó la variable estado reproductivo; donde el 50 % (8/16) de los animales presentaron anticuerpos anti-Neospora spp, en diferentes niveles de dilución, mayores al punto de corte (1:50), en el Cuadro 1, se observa que, en los machos enteros (4/16), la dilución máxima fue de 1:200, sin embargo, las hembras gestantes (3/16) alcanzaron diluciones de 1:200 y dos de ellas 1:400.
Cuadro 1 Porcentaje de niveles de titulación de anticuerpos de Neospora spp. según diluciones seriadas mediante la técnica de IFI
| Animales | Títulos | |||
|---|---|---|---|---|
| 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | |
| Castrado | 18.75 (3/16) | - | - | - |
| Entero | 25.00 (4/16) | 18.75 (3/16) | 6.25 (1/16) | - |
| Potranca | 6.25 (1/16) | - | - | - |
| Yegua | 12.50 (2/16) | - | - | - |
| Gestante | 18.75 (3/16) | 18.75 (3/16) | 18.75 (3/16) | 12.50 (2/16) |
| Vacía | 6.25 (1/16) | - | - | - |
| Recién parida | 12.50 (2/16) | 12.50 (2/16) | - | - |
| Total | 100.0 (16/16) | 50.00 (8/16) | 25.00 (4/16) | 12.50 (2/16) |
Las variables de la encuesta incluidas en el estudio, se analizaron para identificar los posibles factores de riesgo asociados a la presencia de anticuerpos anti-Neospora spp. Los resultados se presentan en el Cuadro 2, observándose que, el mayor número de casos positivos (62.50 %) fue en caballos de la región occidente, en la centro, de 6.25 %, sur 31.25 % y en la región norte no hubo casos positivos, esta variable no tuvo significancia estadística (P<0.05). Del total de animales positivos a la presencia de anticuerpos anti- Neospora spp. el 43.75 % fueron machos y el 56.25 % hembras. Para la variable convivencia de los caballos con otros animales se observó un OR de 2.34 (IC 95%: 0.28 - 19.0; P=0.04). Mientras que las variables uso de los caballos y alojamiento mostraron valores de P<0.20, al ser analizadas con regresión logística la variable alojamiento obtuvo un OR de 3.12. Las variables edad, raza, estado reproductivo y fuente de agua no presentaron significancia estadística (P>0.05).
Cuadro 2 Distribución de Neospora spp. en sueros positivos y negativos en caballos de México y los factores asociados
| Variable | Muestras | Neospora spp. | P-value | OR (CI 95%) | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| N | % | + | - | |||
| Región: | ||||||
| Centro Norte Occidente Sur |
75 54 298 257 |
10.96 7.89 43.57 37.57 |
1 (6.25) 0 (0.00) 10 (62.50) 5 (31.25) |
74 54 288 252 |
0.36 | 0.79 (0.49-1.29) |
| Sexo: | ||||||
| Macho Hembra |
358 326 |
52.34 47.66 |
7 (43.75) 9 (56.25) |
351 317 | 0.49 | 0.45 (0.03-6.18) |
| Edad: | ||||||
| Joven (7-24 m) Adulto (25-48 m) Viejo (>48 m) |
68 375 241 |
9.94 54.82 35.23 |
1 (6.25) 10 (62.50) 5 (31.25) |
67 365 236 |
0.21 | 1.09 (0.47-2.51) |
| Raza: | ||||||
| Criollo Puro |
262 422 |
38.30 61.70 |
6 (37.50) 10 (62.50) |
256 412 |
0.68 | 1.09 (0.22-5.40) |
| Estado reproductivo: | ||||||
| Estado reproductivo: Entero Castrado Potranca Yegua Gestante Vacía Recién Parida |
293 65 26 121 53 115 11 |
42.84 9.50 3.80 17.69 7.75 16.81 1.61 |
4 (25.00) 3 (18.75) 1 (6.25) 2 (6.25) 3 (18.75) 1 (6.25) 2 (12.50) |
289 62 25 119 50 114 9 |
0.13 | 0.69 (0.32-1.49) |
| Uso de los caballos: | ||||||
| Competencia No competencia |
329 355 |
48.10 51.90 |
6 (37.50) 10(62.50) |
323 345 |
0.10 | 0.25 (0.04-1.35) |
| Alimentación: | ||||||
| Forraje Pastoreo Mixto |
325 269 90 |
47.51 39.33 13.16 |
9 (56.25) 4 (25.00) 3 (18.75) |
316 265 87 |
0.06 | 1.14 (0.27-4.76) |
| Alojamiento: | ||||||
| Caballeriza Potrero |
340 344 |
49.71 50.29 |
8 (50.00) 8 (50.00) |
332 336 |
0.20 | 3.12 (0.49-21) |
| Conviven otros animales: Si No |
598 86 |
87.43 12.57 |
15 (93.75) 1 (6.25) |
583 85 |
0.04 | 2.34 (0.28-19) |
| Fuentes de agua: Pozo abierto Bordo |
341 343 |
49.85 50.15 |
8 (50.00) 8 (50.00) |
333 335 |
0.78 | 0.86 (0.31-2.41) |
| Total | 684 | 100.00 | 16 (100.00) | 668 | - | - |
Discusión
La neosporosis en caballos ha sido reportada a nivel mundial con diferente seroprevalencia23-26. En el presente estudio se detectó el 2.34 % de anticuerpos anti-Neospora spp. en caballos de cuatro regiones de México. Otros estudios han reportado seroprevalencias similares al presente, en Brasil del 2.5 % y 4.1 % a la presencia de Neospora spp.6,18, Costa Rica el 3.5 %, Nineveh región de Iraq 3.7 % y en Durango, México reportaron una seroprevalencia del 3 % a la presencia de anticuerpos anti-N. hughesi27-29, sin embargo se han reportado seroprevalencias más altas a la presencia de anticuerpos anti- Neospora caninum en Estados Unidos 34 %, Irán 20 %, Brasil 48.27 % y Perú 12 %23-26. La importancia de detectar en caballos la presencia de anticuerpos anti- Neospora spp., contribuye con la aportación del estado epidemiológico que guarda esta enfermedad en México, y en esta especie que representa un sistema productivo importante en las explotaciones pecuarias. La seroprevalencia a Neospora spp. detectada en hembras y machos fue de 2.7 % y 2.0 % respectivamente. Estudios en Brasil reportaron un 4.3 % en hembras y 3.7 % en machos6; a diferencia de los resultados de Israel que fueron el 13,0 % en machos y 10.9 % en hembras8, coincide con lo reportado en Brasil, que a pesar de no ser estadísticamente significativo, se debe observar que tienen similitud de riesgo de infección tanto hembras como machos.
Los caballos que participaron en el presente estudio, fueron de diferentes regiones de México, observándose que las regiones occidente y sur presentaron un mayor porcentaje de caballos positivos a la presencia de anticuerpos anti-Neospora spp. en comparación de la región centro y norte. Estudios similares reportaron que en Brasil hubo variaciones 5.6 % y 2.6 % en las regiones costeras y de las montañas respectivamente6; en Jordania también se documenta la presencia del parásito en los caballos de acuerdo a su ubicación30, esto podría sugerir la influencia de la presencia de Neospora spp. en caballos por su localización geográfica y el clima de cada región.
En este estudio se obtuvo un OR de 1.1 para las variables edad, raza y alimentación, no observándose diferencia estadística. Estos resultados coinciden con los reportes de Israel8, Brasil25, Jordania30 e Italia31, y se puede considerar que estas variables, aunque no sean estadísticamente significativas, la importancia biológica como factor de riesgo es mayor con su incremento, aumenta la probabilidad de adquirir la infección de este parásito. Para la variable tipo de alojamiento el OR obtenido fue de 3.12 en este estudio, coincidiendo con lo reportado en Israel8, considerándose como un factor de riesgo para aumentar la probabilidad de infección a Neospora spp. La variable convivencia con otros animales asociada a la presencia de Neospora spp., el OR obtenido fue 2.34 (P<0.05), coincidiendo con diversos estudios realizados principalmente en Brasil5,6,25, que analizaron la misma variable con un OR 1.35 (P<0.05). Estos resultados indican, que la presencia de otros animales aumenta el riesgo de los caballos a adquirir el parásito Neospora spp.
Conclusiones e implicaciones
En este estudio se identificaron anticuerpos anti Neospora spp. en los caballos de las regiones estudiadas, lo que implica el riego de la presencia de Neosporosis en las explotaciones equinas; de los casos positivos ninguno mostro signos clínicos característicos de la enfermedad. La variable convivencia con otros animales es el factor de riesgo que presentó mayor relación con la seropositividad, sin embargo, es necesario realizar un análisis considerando las diferentes categorías de cada variable. Se requiere realizar estudios que permitan identificar al huésped definitivo para conocer mejor el mecanismo de transmisión de la enfermedad a los caballos, e identificar de manera precisa la especie de Neospora presente en caballos.
