Población y muestra

Se utilizaron 10 lechones de traspatio, de 35 días de edad, en lactación, alimentados con dietas sin antibióticos, provenientes del caserío El Limón, ubicado en el distrito Pampas de Hospital, departamento de Tumbes (3°43´35” S, 80°26´38” W). La muestra comprende bacterias ácido lácticas aisladas de la parte final del tracto digestivo (excretas).

Obtención de las muestras

De cada lechón, se colectó excretas con hisopos estériles (raspado) y fue colocado individualmente en tubos plásticos estériles y herméticos, para ser transportados en cadena de frío¹⁹ hasta el Laboratorio de Biología Molecular ubicado en la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Nacional de Tumbes.

Análisis microbiológico

Se sumergió cada muestra en solución salina fisiológica estéril al 0.85 % (diluyente), las diluciones se homogeneizaron por 5 a 10 seg y se transfirió 1 ml para los siguientes tubos con 9 ml de caldo MRS, diluciones de 10^-1 hasta 10^-5 para recuento de colonias bacterianas. La siembra se realizó por el método de superficie, tomando 25 µl de las diluciones decimales en placas con agar selectivo para BAL (agar MRS + Azul de anilina 0.13%), seleccionando las colonias teñidas de azul (de la superficie del agar), las que se purificaron en agar MRS realizándose por el método de estría, verificando así la población de BAL, y se realizó la caracterización macroscópica por tamaño, forma, color, densidad, consistencia y tinción Gram para identificación^21,22. Para la conservación se realizó en tubos con agar MRS inclinado con ángulo de 20º, sembrado por el método de estría, conservando a 4 ºC, crio preservados en medio TSB con glicerol al 30 % a -20 ºC, previa refrigeración^21,22.

Para las muestras patógenas se procedió a la siembra por el método de agotamiento, en medios específico como: agar SS (salmonella, shiguella) y agar EMB (eosina azul de metileno)²². Se aislaron, purificaron, identificaron y conservaron las cepas de las muestras, obtenidas de las excretas fluidas de lechones.

Análisis bioquímico y pruebas de tolerancia

A las cepas BAL aisladas y purificadas, se les realizaron pruebas para ser seleccionadas como probiótico: prueba de oxidasa, utilizando tiras de papel impregnadas con el reactivo para-amino-N-dimetil-anilina, que por la presencia de la enzima citocromo C-oxidasa, cambia el color, considerado positivo o negativo. Prueba de la catalasa, se observó la capacidad para desdoblar el H₂O₂ al 30 %, en agua y oxígeno, se verificó con el burbujeo intenso que puede determinarse como positivo o negativo (atribuida a la enzima catalasa) ^16,23. La generación de gas (CO₂), se verificó por el proceso fermentativo metabólico. Para las pruebas de tolerancia, se utilizó las cepas BAL seleccionadas, y cultivadas en caldo MRS a 37 °C por 24 h, se midió su crecimiento por densidad óptica (DO= 1) a 600 nm en un espectrofotómetro UV y se utilizó un ml de BAL para cada prueba. Se evaluó la viabilidad mediante el recuento de bacterias en el agar MRS antes y después de incubación^15,16,23. Tolerancia a pH bajos, en tubos falcón de 15 ml de capacidad se añadió 10 ml de caldo MRS ajustados a los pH 2.5, 3.5, 4.5 con HCl. Tolerancia a sales biliares, en tubos falcón de 15 ml de capacidad se añadió 10 ml de caldo MRS enriquecidos con 1 g (1% p/v), 5 g (5% p/v) y 10 g (10% p/v) de Ox-Bilis^15,16,23. Tolerancia a concentraciones de NaCl, en tubos falcón de 15 ml de capacidad se añadió 10 ml de caldo MRS enriquecidos con 5 g (5% p/v), 9 g (9% p/v) y 13 g (13% p/v) de NaCl^15,16,23.

Actividad inhibitoria frente a microorganismos patógenos del lechón

Consiste en el enfrentamiento de cada una de las cepas BAL seleccionada contra cada cepa patógena del lechón (E. fergusonii y S. flexneri). Se utilizaron las células y sobrenadantes según el método propuesto; se consideró como actividad inhibitoria positiva la observación del halo^2,15,16. Las BAL y bacterias patógenas (homogeneizadas DO= 1; a 600 nm), fueron conservadas en tubos con agar PCA inclinado y se activaron a 37 °C por 24 h para su uso.

Método directo o por contacto. En placas de Petri se sembró la cepa BAL en agar MRS

por técnica de hisopado, paralelamente en agar Mueller Hinton se sembró 25 µl de la cepa patógena por técnica de superficie. De la placa con BAL se extrajo bocados circulares de 6 mm de diámetro y se colocaron sobre la placa con el patógeno^15,16.

Método de pocillo sin neutralizar. Se sembró la cepa BAL en caldo MRS a 37 °C por

24 h, se determinó el pH y se agregó 1 ml del caldo en microtubos de 1.5 para centrifugar a 16,800 xg durante 10 min, obteniendo el sobrenadante para realizar las pruebas de antagonismo. Sembrando paralelamente en agar Mueller Hinton 25 µl de la cepa patógena por el método de superficie, aquí se realizó perforaciones cilíndricas de 6 mm diámetro donde se agregó 35 a 40 µl del sobrenadante de la BAL^15,16.

Método de pocillo neutralizado. El procedimiento fue igual al método del pocillo sin

neutralizar, cambia el sobrenadante, ya que este se neutralizó, ajustándolo a pH 7 con una solución de NaOH 1N^15,16.

Análisis molecular

Se realizó la identificación molecular de las bacterias BAL de lechones sanos y bacterias patógenas de lechón con diarrea, siendo la extracción de ADN, por el método estándar CTAB-DTAB de Gustincich, adaptado para células bacterianas^15,24, para la PCR (Reacción en cadena polimerasa) se utilizó la amplificación del gen 16S ARNr, los cebadores universales 8F (5´ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3´) y 1510R (5´ GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3´) descritos por Weisburg para estudios filogenéticos bacterianos, la electroforesis se realizó en gel agarosa al 1%. Para la secuenciación de los productos de la PCR, se empleó 10 μl, se depositó en microtubos de 0.2 ml porciones de 5 μl de cada cebador universal para el gen 16S ARNr, los cuales fueron empacados y enviados para su secuenciación a la empresa Macrogen de Korea¹⁵. Las secuencias de ADN se alinearon con el software libre MEGA 7 y comparadas con las secuencias de 16S ARNr, que se encuentra en la base de datos de acceso público del GenBank mediante el software libre BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)^15,24.

Elaboración del inóculo lácteo (IL)

La elaboración y evaluación del IL, se realizó según las normas del INEN²⁵. Las etapas fueron, recepción de leche fresca, inspección organoléptica, tamizado, homogeneización mecánica^21,26,27, pasteurización, que se realizó a 75 °C por 10 min, enfriamiento e incubación, que oscila entre los 40 y 45 °C^26,27.

Mezcla del inóculo lácteo. Se activaron las BAL seleccionadas con capacidad probiótica^28-29, en agar MRS y se incubó a 37 ºC por 48 a 72 h según la cepa, una alícuota se sembró en 10 ml caldo MRS y se incubó a 37 ºC por 48 h, para ser utilizada se homogeneizó a DO= 1; a 600 nm^26,27,28. En frascos estériles de 250 ml, se agregaron 100 ml de leche pasteurizada y 1 ml del caldo MRS con cepa BAL seleccionada y se incubó a 32 ºC por 12 h. Para la preparación de la mezcla final de IL (yogurt) se retiraron 50 ml de cada inóculo anterior (por cepa) y se mezcló (cepas 1, 2 y 5 y cepas 1, 5 y 6) en medio litro de leche pasteurizada, se incubó a 32 ºC por 12 h y se conservó a 4 ºC^(27,28,).

Análisis químico del inóculo lácteo. Se evaluó el pH, acidez titulable, sinéresis y recuento de colonias a los 0, 5, 10 y 15 días en refrigeración a 4 °C. El valor de pH del IL se midió por el método 981.12 (AOAC, 1990) con el potenciómetro digital, calibrado, se tomó entre 40 a 45 ml del IL en un recipiente, se introdujo el electrodo del pH y registró la lectura. Para la determinación de la acidez titulable, se tomaron 5 g de muestra, tres gotas de fenolftaleína, se homogeneizó y tituló con NaOH 0.1N, hasta obtener un color rosa pálido persistente (factor de fórmula 0.09 de ácido láctico)^29,30,31. Para la evaluación de sinéresis, se utilizaron 10 g de muestra, se colocaron en tubos falcon, se centrifugó por 20 min a 4,200 xg; después de la centrifugación se obtuvo el peso del sobrenadante y se calculó el porcentaje de sinéresis (p/p) mediante la relación entre peso del sobrenadante y el peso de la muestra multiplicado por 100^31,32,33.

Análisis microbiológico del inóculo lácteo. Se realizó teniendo en cuenta la identidad bacteriana para yogurt, empleado por NTP 202.092:2014, se utilizó el método ISO 7889:2003 (IDF 117:2003) según la enumeración de microorganismo característicos por la técnica de recuento de colonias a 37 °C^27,28,30,34.

Evaluación del análisis microbiológico

Se encontraron 10 cepas con características BAL después del descarte en agar MRS + azul de anilina y purificación en agar MRS, confirmados por método^16,23,29, las BAL se tiñen de color azul intenso en el medio selectivo por la presencia de metabolitos de las colonias al reaccionar con el azul de anilina^23,24,29; la literatura también confirma que las BAL son Gram positivas y pueden tener diferentes formas bacilos, coco y cocobacilos^16,19,29, así como observa en el Cuadro 1, donde también se presenta el crecimiento de las BAL siendo mayor la cepa 05 (2.80 x 10⁴ UFC/ml), seguido por la cepa 01 (2.60 x 10⁴ UFC/ml). Las cepas 04, 09, 07 y 02 tuvieron valores similares; sin embargo, las cepas 03, 06, 08 y 10 presentaron menos crecimiento (1.00 x 10⁴ a 1.20 x 10⁴ UFC/ml), entendiendo que la capacidad de reproducción de las cepas BAL es variable en función a temperatura y condiciones del medio^29,35,36.

Evaluación del análisis bioquímico de las BAL

Prueba de oxidasa, peróxido de hidrógeno, generación de gas y tolerancia a pH, NaCl y sales biliares. En el Cuadro 2, se observa que las 10 cepas fueron oxidasa negativa (no producen la enzima citocromo C-oxidasa en su proceso de respiración), no son aeróbicas, por lo que no necesitan oxígeno en su membrana celular; éstas también presentaron reacción catalasa negativa (no reaccionar con el H₂O₂) y no produjeron CO₂^7,16,24 (excepto 04, 08 y 10). En el experimento las cepas 03, 04, 08, 09 y 10, no lograron tener tolerancia a las concentraciones de pH, ClNa y sales biliares, características de células probióticas^19,23,29, por lo que fueron descartadas definitivamente.

En el Cuadro 3, se presenta la cantidad inicial y final en UFC/ml de las cepas sometidas a diferentes concentraciones de tolerancia con fines de selección, siendo la cepa 1 la que presentó mayor crecimiento final, seguida de las cepas 2, 5 y 6 en pH 4.5 y 3.5, suficiente para selección^3,16,35, pero, todas fueron susceptibles al medio de cultivo muy ácido (pH 2.5). En el mismo cuadro, se presenta la tolerancia a ClNa, donde la cepa 5, 1 y 6 evidenciaron mayor tolerancia en todas las concentraciones y las cepas 2 y 7 fueron susceptibles a la mayor concentración (p/v). También, se observa tolerancia a sales biliares en todas las cepas en concentración máxima de 5 % motivo de selección^24,29,35, donde la cepa 5 presentó mayor crecimiento 7.0 x 10³ UFC/ml, seguido de las cepas 6, 1, 2 y 7.

Las BAL encontradas en el estudio demostraron características probióticas evaluadas según la tolerancia a concentraciones bajas de pH, lo que coincide con la mayoría de autores, que consideran sobrevivencia a pH 3 a 3.4 y un óptimo pH 3.5^14,35,36. También presentaron tolerancia a concentraciones altas de sales biliares y NaCl como las encontradas en otras investigaciones^7,35,36, condiciones que son consideradas obligatorias como probióticas encontrando que las cepas BAL (5, 1, 2 y 6) presentaron ser viables para su selección como probióticas según la metodología realizada por otros investigadores^16,37,38).

Evaluación del análisis molecular. Secuenciación de ADN

En el Cuadro 4 se presenta la identificación molecular de las cepas BAL y bacterias patógenas del trabajo con alto porcentaje de identidad (99 %).

Las cepas BAL, E. faecium y L. reuteri, encontradas e identificadas molecularmente, están presentes como microorganismos nativos del tracto digestivo del cerdo y tienen efecto antagónico contra Escherichia, semejante también con la evaluación del E. faecium NCIMB 10415 y E. faecium NCIMB 11181^38,39,40 y el L. reuteri I5007 y L. reuteri KT260178, Lactobacillus sp, L. acidophilus, utilizados como probióticos en la producción porcina^29,41,42.

Las muestras de bacterias patógenas de lechones, (Cuadro 4) son reportadas con mayor incidencia en la crianza de cerdos^39,40.

Evaluación de la actividad inhibitoria de las BAL contra bacterias patógenas

Al comparar los tres métodos para determinar la actividad inhibitoria (Cuadro 5), se observa que el método directo y de pocillo neutralizado, presentan menor inhibición que el de pocillo sin neutralizar, ya que este último tiene pH ácido como consecuencia de los ácidos orgánicos presentes, los cuales tienen actividad bactericida^29,35,41.

El E. faecium y L. reuteri, tuvieron mayor actividad antagónica frente a la E. fergunsonii que es más susceptible que a S. flexneri como los reportados por otros^12,38,39; así también la Eschericha es susceptible a la mayoría de bacterias acido lácticas como son a cepas de Lactobacillus spp extraídos de terneros lactantes, L. plantarum aislados de cerdos criollos y L. lactis aislados de lechones^40,41,42.

Método directo, los resultados del Cuadro 5, muestran el efecto inhibitorio por contacto directo de las BAL. Las cepas 5, 6 y 7 mostraron inhibición contra las dos cepas patógenas, con mayor tamaño de halos frente a E. fergunsonii, destacando la cepa 5 con halo de 8.46 ± 3.02. Las cepas 1 y 2 presentaron menores halos frente a las patógenas^38,41.

Método de pocillo, sin neutralizar, la prueba se realizó con el sobrenadante del cultivo de las BAL, con pH promedio de 4.486 ± 0.001. En el Cuadro 5, se observa que todas las cepas presentan halos de inhibición en el enfrentamiento contra E. fergusonii, sobresaliendo las cepas 6 y 7, seguido de la cepa 5 y finalmente las cepas 2 y 1. Los halos formados frente a S. flexneri fueron de mayor tamaño frente al otro patógeno, siendo las cepas (ordenadas de mayor a menor tamaño) 5, 7, 6, 2 y 1 respectivamente.

Las BAL 5, 7 y 6 (E. faecium) presentaron mayores halos frente a S. flexneri, resultados semejantes y menores a los obtenidos en prueba con Lactobacillus spp, enfrentados a patógenos del cerdo, presentando halos desde 11.24 ± 0.03 a 32.62 ± 0.04 frente a la Salmonella sp han sido reportados^19,36,41. En pruebas utilizando el sobrenadante bacteriano sin neutralizar, tiene mayor acción de inhibición, debido al efecto de los ácidos orgánicos según las pruebas de antagonismo^29,35,40.

Método de pocillo neutralizado, para este caso el sobrenadante del cultivo de las BAL se ajustó a pH 7.00 (neutralizado con hidróxido de sodio) con el fin de excluir la inhibición de los ácidos orgánicos. Todas las cepas presentaron halos (Cuadro 5), en el enfrentamiento con E. fergusonii, pero en menor tamaño que la prueba sin neutralizar, siendo los halos mayores para las cepas 5, 7 y 6, en la prueba con S. flexneri. En este método al no haber acción ácida se atribuye la acción antimicrobiana a la presencia de metabolitos no ácidos. Se reporta que las BAL producen sustancias peptídicas que producen un modo de acción bactericida o bacteriostático^16,42, lo que también está referido a la actividad de metabolitos proteicos o moléculas complejas lipídicas o carbohidratos¹¹.

Las cepas 5, 6 y 7 (E. faecium) evaluados, presentaron en los tres métodos los mayores halos frente a E. fergunsonii, siendo el método de pocillo sin neutralizar las que generaron mayores halos, semejante a lo ya reportado^11,16. El antagonismo de la BAL está influenciado por varios factores como son el tipo de bacteria, lugar de donde ésta se obtuvo, especie hospedera, temperatura y tiempo de incubación^14,15,41. Las BAL con actividad probiótica presentaron antagonismo frente a patógenos del cerdo y su acción se compara con la mayoría de probióticos obtenidos de bacterias Lactobacillus ssp. L. acidophilus, L. plantarum, (L. casei y L. brevis)^14,19,29, que actúan frente a la bacteria patógena E. coli ATCC 25922 y S. typhimurium¹⁴.

Evaluación del inóculo lácteo

Evaluación físico-química (pH, acidez y sinéresis). De la evaluación de las BAL como probiótico quedaron seleccionadas las cepas 1, 2, 5 y 6 con los cuales se preparó dos mezclas como IL (yogur), en la primera mezcla se utilizaron las cepas 1, 2, y 5 y en la segunda las cepas 1, 5 y 6, (1 ml de cepa activada en 100 ml de leche), utilizando 50 ml de cada cepa según la mezcla, para evaluar su viabilidad, a los 0, 5, 10 y 15 días de almacenamiento hasta su uso como IL (yogurt). En el Cuadro 6, se observó que la mezcla uno presentó mejor estabilidad, donde los valores del pH fueron inversamente proporcional a la acidez, la cual disminuye en función a los días de refrigeración, llegando a los 15 días con pH de 4.53 y pH 4.78 de la mezcla uno y dos respectivamente, valores que están en los parámetros aceptables de estabilidad y vida útil, relacionado con el tiempo de degradación de la lactosa a ácido láctico. Los resultados obtenidos son aceptables, comparables al pH de 4.65 obtenido en la fabricación de yogur con leche de cabra o vaca utilizando microorganismos fermentadores comerciales y yogures simbióticos^26,27, así mismo cumple con la norma del Codex stan 243-2003⁴³, la cual refiere que todos los yogures deben tener un pH ≤ a 4.6, hasta un pH de 4.90, valores semejantes a los yogures y productos lácteos no tradicionales^25,27,30, el pH obtenido fue semejante a fermentos lácteos para cerdos, ensilados con productos lácteos que mantienen los pH entre 3 a 4.9^18,35,44. A pesar de que la mezcla dos presentó pH ligeramente mayor, este también se encuentra dentro de las normas técnicas, NTP 202.092:2014 y Norma INEN 710 de 1996²⁰, el pH se modifica en mayor rango al incorporar fibra de trigo y otros granos en yogures artesanales mexicanos^18,32,33. A pesar de que el yogurt este en refrigeración, se detiene el crecimiento de las cepas BAL, sin embargo, la acidez continúa lentamente por su actividad residual^26,30,31, se aumenta la vida útil al incorporar frutas ácidas y batidos con pectina^27,34, también se mejora la calidad y sabor agregando frutas con componentes funcionales (lúcuma, plátano, mango y otros)^34,45, por lo tanto, el pH en la incubación y almacenamiento del IL determina su aceptabilidad para ser utilizado³¹.

El valor de la acidez (%) está en función al contenido de ácido láctico, llegando hasta 0.93 y 0.58 % valores considerados aceptables como producto lácteo según la norma de preparación del yogurt de acuerdo a lo establecido por Codex stan 243-2003⁴⁴, Norma INEN 710 de 1996, tiene un rango final entre 0.6 a 1.5 % durante la refrigeración²⁰, el porcentaje de acidez obtenido es aceptada en alimentos fermentados y ensilados^28,35,44. El grado de sinéresis medido de los IL (yogur) aumentó lentamente durante su almacenamiento, efecto debido a la pérdida de estabilidad, retención de agua y de sus componentes. En el Cuadro 6 se presentan los valores de la evaluación del grado de sinéresis durante su almacenamiento, a 15 días de refrigeración presentó un rango aceptable de 0.36 a 0.61 % (mezcla uno y dos), resultados semejantes a los obtenidos en yogur y batido de leche de cabra con frutas^26,27,34, pero son mayores a yogures modificados, por la adición de estabilizantes comerciales, microcápsulas de goma arábiga y maltodextrina (0.12 a 0.1 %)^27,30 y fibra que ayuda a prevenir la separación de lactosuero ^32,33.

Evaluación microbiológica. En el Cuadro 6, se presenta la viabilidad de BAL como probióticos en el IL (yogurt), la mezcla uno, muestra mayor aumento de microorganismos probióticos que la mezcla dos, durante su evolución en refrigeración. El recuento de las BAL en ambas mezclas es semejante a lo que recomienda la NTP 202.092:2014, utilizando el método ISO 7889:2003 (IDF 117:2003) para la preparación de yogurt³³, considerando como mínimo para número de microorganismo de bacterias lácticas totales en el yogurt, durante su vida útil de 10⁷ UFC/g, obtenidos por la mezcla uno y dos a los 15 días de refrigeración (3.9 x 10⁷ UFC/g y 1.1 x 10⁶ UFC/g respectivamente), garantizando que el producto elaborado, contiene y conserva su viabilidad y actividad probiótica como en la fabricación de los diferentes yogures utilizando leche de cabra o de vaca, bacterias fermentadores comerciales, saborizantes, frutas y fibra, con una concentración de 10⁷ UFC/g a 10⁶ UFC/g de células probióticas viables en los 16 primeros días^30,34,46. Actualmente el consumidor demanda alimentos funcionales (frutas antioxidantes)^33,45, menos procesados y más naturales, así también se busca mejorar su vida útil proporcionando cualidades antimicrobianas utilizando bacterias nativas benéficas^17,18,42. La reuterina, producida por L. reuteri, es un antibacteriano que puede ser utilizado como un bioconservante con potencial probiótico controlador de Salmonella spp. y E. coli en alimentos para personas o animales, la tendencia es el uso de las BAL nativas y sus extractos bacterianos como potenciales probióticos aislados y utilizados en la misma especie animal^12,38,39.