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Revista mexicana de ciencias pecuarias
versión On-line ISSN 2448-6698versión impresa ISSN 2007-1124
Rev. mex. de cienc. pecuarias vol.11 no.4 Mérida oct./dic. 2020 Epub 02-Mar-2021
https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i4.5437
Revisiones bibliográficas
Tasa de preñez post vitrificación en los embriones de équidos producidos in vivo. Revisión
a Universidad Autónoma de Sinaloa. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Boulevard San Ángel S/N, Fraccionamiento San Benito, Predio Las Coloradas, Culiacán Sinaloa, México.
b Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Reproducción . Ciudad de México, México.
La vitrificación es un método de criopreservación que se utiliza a menudo con los embriones que se obtienen de yeguas o de burras. Consiste en la drástica reducción de la temperatura a niveles cercanos a los -196 °C lo cual causa que la solución criopreservadora que contiene el embrión pase del estado líquido al vítreo. Varias mejoras en los protocolos de vitrificación han hecho posible criopreservar embriones de diferentes tamaños. Los embriones recolectados al sexto día después de la ovulación (DO) suelen tener un diámetro menor o igual a 300 micrómetros (≤300 µmØ) y se pueden vitrificar de forma rutinaria siguiendo protocolos simples. Las tasas de preñez post vitrificación (TPPV) son más altas con embriones pequeños que con los grandes (˃300 µmØ). Las TPPV elevadas en los embriones ≤300 µmØ se debe a que la cápsula embrionaria (CE) aún no está completamente desarrollada y desde luego tiene una alta permeabilidad a las soluciones criopreservadoras. Los embriones recolectados en el séptimo u octavo día DO son ˃300 µmØ y se caracterizan por tener una baja supervivencia post vitrificación. Para aumentar la TPPV con los embriones ˃300 µmØ se puede perforar la CE para hacerla más permeable a las soluciones criopreservadoras, reducir su tamaño aspirando el fluido del blastocele e inducir un alto índice de transferencia de temperatura para alcanzar con más rapidez la vitrificación a los -196 °C.
Palabras clave Yeguas; Burras; Embrión; Criopreservación; Vitrificación; Tasa de preñez
Vitrification is a cryo-preservation method often used in embryos obtained from mares or jennies. It consists in the dramatic reduction of temperature to levels close to -196 °C, that allows the cryopreserving solution containing the embryo to pass from liquid to vitreous state. Several improvements to vitrification protocols have made possible to cryo-preserve embryos with different sizes; since during the first decade after the year 2000, only small embryos were successfully vitrified. Embryos collected at the sixth day post ovulation (PO) are usually smaller or equal to 300 micrometers in diameter (≤ 300 µmØ) and can be routinely vitrified following simple protocols; they have a higher post vitrification pregnancy rate (PVPR) when compared to large embryos which have more than 300 micrometers in diameter (˃ 300 µmØ). The high PVPR of embryos ≤ 300 µmØ is due to an embryo capsule (EC) that is not fully developed yet and has a high permeability to cryo-preserving solutions. At present time, embryos collected either the seventh or eighth day PO are ˃ 300 µmØ and are characterized to have a low post vitrification survival; in order to increase their PVPR their EC might be punctured to make it permeable to cryopreserving solutions. Additionally, there are at least two factors that can be manipulated to increase the PVPR of embryos ˃ 300 µmØ; one is to reduce their size by aspiring their blastocoelic liquid (BL), and the other is to induce a high temperature transfer index (TTI) to rapidly reach -196 °C.
Key words Mares; Jennies; Embryo; Cryopreservation; Vitrification; Pregnancy rate
Introducción
Según estimaciones de la FAO1, durante el período 2007-2017 el número de burros (Equus africanus asinus) se redujo en países como Brasil (1’163,316 a 841,307), China (7’306,000 a 4’568,500), Ecuador (102,058 a 49,729), India (438,000 a 247,000) e Italia (24,000 a 20,928). La población de burros también ha disminuido en el continente africano debido a la demanda del mercado chino por productos como la piel de burro2. Sin embargo, en países como Italia3 y Brasil4 los burros forman una parte importante de la industria de los équidos por su producción de leche5,6, queso7 y carne4. La recuperación de la población de burros es un asunto importante debido al papel que juegan en la economía de los países emergentes8 y en la producción de animales híbridos como las mulas9. Los ciclos estrales de las burras y las yeguas (Equus ferus caballus) difieren principalmente en la duración del período del celo; el estro es de mayor duración en las burras10. Sin embargo, el intervalo entre la ovulación-fertilización y la entrada del embrión en el útero parece ser similar entre las burras11,12,13 y las yeguas14,15. El tamaño del embrión recuperado durante el sexto, séptimo, octavo o noveno día después de la ovulación (DO) varía drásticamente tanto en las burras12,13,16,17 como en las yeguas15,16,18, aunque la tendencia de aumentar en tamaño es similar entre ellas. En los équidos se sabe que el embrión ingresa al útero al sexto día DO18.
En el proceso de la recolecta de embriones en las burras y las yeguas para la preservación por vitrificación, el día DO seleccionado (día de la infusión intrauterina de soluciones y recolección) determina la etapa de desarrollo del embrión (mórula, blastocisto o blastocisto expandido). Desde luego, dicta el protocolo adecuado para optimizar la tasa de preñez post vitrificación (TPPV)12,13,15,19-22. Al infusionar el útero en el sexto DO, el embrión recuperado generalmente será de un tamaño menor que 300 micrómetros12,16,21, mientras que los embriones recolectados en el séptimo, octavo o noveno día DO tendrán un tamaño igual o mayor a 300 micrómetros12,13,20,23,24. Para optimizar los protocolos de vitrificación embrionaria se requiere de una determinación precisa del día de la ovulación (día cero) para calcular con exactitud la edad/etapa del embrión. Esto es vital porque los embriones recolectados durante el sexto día DO no requieren de una reducción en tamaño antes de la vitrificación, pero los recolectados el séptimo, octavo o el noveno día DO sí la requieren12,21,25,26,27.
Las biotecnologías como la vitrificación de embriones podrían facilitar la reproducción en burras y promover la recuperación gradual de sus poblaciones. El objetivo del presente estudio fue generar información enfocada al mejoramiento del protocolo de la vitrificación de embriones y un consecuente incremento de la TPPV para embriones ˃300 µmØ tanto en burras como en yeguas.
Relevancia del tamaño del embrión sobre la tasa de preñez post vitrificación (TPPV)
Durante los primeros diez años del Siglo XXI el tamaño del embrión que se utilizaba en el protocolo de vitrificación afectaba claramente la TPPV, con los embriones pequeños (≤300 µmØ) resultando en tasas más altas y los grandes (˃300 µmØ) en tasas más bajas15. En yeguas se obtuvieron TPPV cercanas al 62 % usando embriones vitrificados ≤300 µmØ28, mientras que las tasas eran de 10 % cuando se utilizaron embriones vitrificados ˃300 µmØ29. A partir del 2010, se desarrollaron ajustes a los protocolos de criopreservación diseñados para embriones ˃300 µmØ. Entre ellos se encuentran la punción de la cápsula embrionaria (CE) y la reducción de su tamaño mediante la aspiración del fluido del blastocele (FB)23. Estos ajustes permitieron la vitrificación exitosa de embriones ˃300 µmØ, la supervivencia del embrión post vitrificación en burras30 y TPPV superiores al 40 % en yeguas31. No se han realizado investigaciones sobre el efecto del tamaño del embrión en la TPPV utilizando embriones derivados de burras17,30.
Asociación entre la permeabilidad de la capsula embrionaria (CE) y la tasa de preñez post vitrificación (TPPV)
En las especies équidas los embriones desarrollan una estructura glucoproteica denominada cápsula embrionaria (CE) la cual es necesaria para una adecuada progresión de la gestación32. La vitrificación de los embriones derivados de las yeguas ha demostrado que la presencia de la CE disminuye la permeabilidad del embrión a soluciones criopreservadoras, tanto in vitro33 como in vivo34,35. Una de las primeras preñeces exitosas en una yegua con embriones vitrificados ˃300 µmØ se logró gracias al tratamiento de la CE con tripsina previo al proceso de vitrificación para aumentar su permeabilidad a las criopreservados36. Sin embargo, el aumento en la permeabilidad de la CE por medio de la tripsina o los inhibidores de microfilamentos (citocalasina-B) no han producido resultados positivos de manera consistente37. En embriones equinos ˃300 µmØ el grado de integridad de la CE parece estar relacionado estrechamente con la TPPV. Este se debe a que la CE está mucho más desarrollada en esta categoría de embriones y cualquier alteración dramática de ella puede reducir la TPPV23. Todavía faltan estudios sobre la permeabilidad de la CE en embriones de burra o mula y para determinar si la permeabilidad está asociada con la TPPV.
Punción de la capsula embrionaria (CE) y extracción del fluido del blastocele (FB) antes de la vitrificación
En embriones equinos ˃300 µmØ es importante perforar la CE38 y extraer la FB para reducir su tamaño antes de proceder con la vitrificación39. Varios estudios han reportado un incremento en la TPPV como resultado de este procedimiento23,24,31,38,40,41. Por ejemplo, antes del 2010 las TPPV en las yeguas usando embriones ˃300 µmØ eran inferiores al 40 %15,29, pero después del 2010 la aplicación de la punción de la CE y la reducción de su tamaño arrojó TPPV entre el 60 y el 80 %23,24,40. Hay pocos datos sobre la eficacia de este procedimiento en embriones derivados de burras. Un estudio reciente demostró que la reducción del tamaño del embrión por aspiración del FB antes de la vitrificación resultó en una tasa de supervivencia del embrión del 83 % post vitrificación30. Es importante notar que en este estudio no se transfirieron los embriones al útero de una burra posterior a la vitrificación y por lo tanto no se documentó el desarrollo del embrión in vivo ni la TPPV. Todavía está por determinar si la punción de le CE es necesaria en embriones ˃300 µmØ derivados de burras21,30, ya que ningún estudio ha documentado aún el TPPV en embriones de burras después de la punción de la CE y la reducción del tamaño16,17,21,30. Cabe la posibilidad de que este procedimiento no sea necesario en los embriones de burras ya que un estudio de embriones de yegua y de burra demostró que los embriones de las burras parecían tolerar mejor la vitrificación16; no se han realizado estudios para probar directamente esta hipótesis. Son pocos los estudios que evalúan el TPPV en embriones de las burras21 y es claro que se necesita más trabajo en esta área16,17,21.
La influencia de un incremento en el índice de transferencia de temperatura (ITT) sobre la tasa de preñez post vitrificación (TPPV) en embriones de équidos
En équidos, un ITT elevado durante el proceso de vitrificación y desvitrificación mejora el TPPV de los embriones ˃300 µmØ. Este índice está relacionado con la velocidad y la cantidad de la temperatura transferida del nitrógeno líquido (alrededor de -196 °C) a la solución criopreservadora que contiene el embrión (temperatura cercana a los 25 °C). Un aumento en el ITT representa un aumento en la velocidad a la cual la temperatura de la solución criopreservadora que contiene el embrión alcanza los -196 °C. Hay diferentes maneras de promover un aumento en el ITT. Una es poner la solución criopreservadora con el embrión en contacto directamente con el nitrógeno líquido, y otra es reducir el volumen de la solución que se pondrá en contacto con el nitrógeno líquido. Recientemente se ha logrado un aumento en la supervivencia de los embriones post vitrificación a niveles superiores al 60 % tanto en yeguas23,40 como en burras17 por medio de un aumento del ITT y utilizando volúmenes de soluciones criopreservadoras inferiores a un microlitro al sumergir el embrión en el nitrógeno líquido. En otro estudio la TPPV se incrementó en yeguas en respuesta al uso de la punción de la CE, un aumento del ITT y el uso de contenedores de volumen pequeño (<1 µl), pero bajó cuando se usó un ITT reducido y contenedores de volumen grande (≥1 µl)40. En teoría el uso de contenedores de pequeño volumen aumenta el ITT. Un estudio de embriones derivados de burras apoya esta suposición ya que al usar un volumen final de la solución de vitrificación <1 µl se incrementó la supervivencia del embrión post vitrificación entre un 40 y 50 %17. No se estableció la TPPV en este estudio ya que no se realizó la punción de la CE ni se transfirieron los embriones al útero de una burra.
Agradecimientos
La presente revisión de literatura forma parte de las investigaciones financiadas por el Proyecto PROFAPI2015/287.
REFERENCIAS
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Recibido: 02 de Julio de 2019; Aprobado: 21 de Octubre de 2019
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