Introducción

Escherichia coli (E. coli) puede colonizar al tracto gastrointestinal tanto de los humanos como los animales sin causar daño. Existen varias cepas patógenas de E. coli las cuales constituyen un grupo heterogéneo de organismos con diferentes propiedades de virulencia, serotipos O:H y epidemiología. Con base en los factores de virulencia específicos y las características fenotípicas de cada cepa, las cepas se han subdividido en seis grupos patogénicos: E. coli enteropatógena (EPEC); E. coli enteroagregativa (EAEC); E. coli enterotoxigénica (ETEC); E. coli de difusadherente (DAEC); E. coli enteroinvasora (EIEC) y E. coli enterohemorrágica (EHEC)¹. Uno de los más importantes factores de virulencia en las E. coli son las toxinas Shiga (Stx) y los productos de la isla de patogenicidad como el locus del borrado del enterocito (LEE por sus siglas en inglés). Las cepas que producen la Stx se denominan E. coli productora de toxina Shiga (STEC), y uno de los serotipos más comunes es el E. coli O157:H7. Sin embargo, hay otros serotipos no-O157:H7², y estos se han detectado en diferentes productos, como carnes, lácteos, pescados, mariscos, bebidas, hielo y legumbres³. Principalmente han sido implicados en brotes asociados al consumo de carne bovina, su principal reservorio⁴. En bovinos sanos las cepas STEC se encuentran con prevalencias de 7 a 30 %, y parece que no son patógenas para los animales. Empero, se han detectado con mayor frecuencia en animales que tienen diarrea⁵, sugiriendo que la carne puede contaminarse por medio de materia fecal que contiene E. coli durante un procesamiento inadecuado del canal en el rastro.

La E. coli puede intercambiar material genético a través de elementos genéticos móviles (MGE por sus siglas en inglés) como plásmidos, transposones e integrones. Este intercambio facilita su adaptación a entornos nuevos y adversos, desde luego contribuyendo a las enfermedades intestinales o extraintestinales. Aunque las cepas de E. coli se diferencian por su virulencia, resistencia, incidencia y gravedad, también se distinguen por el resultado de su interacción con los factores del huésped y el medio ambiente⁴.

En animales se utilizan a los compuestos antimicrobianos con tres propósitos principales: promoción del crecimiento, medidas profilácticas y como terapia cuando ocurre una enfermedad^6,7. Su uso constante ha promovido la supervivencia de cepas resistentes que constantemente están desarrollando nuevos mecanismos de resistencia. Estas se están extendiendo por todo el mundo y como consecuencia poniendo en peligro la capacidad para tratar enfermedades infecciosas comunes, además de prolongar la enfermedad e incrementar la discapacidad y la mortalidad⁸. Algunas cepas resistentes de E. coli están presentes en las personas, los animales y el medio ambiente (agua, suelo y aire). Se pueden transmitir de las personas a los animales y viceversa, incluso a través del consumo de productos de origen animal. Desde luego un manejo inadecuado del control de las infecciones, las condiciones de procesamiento, la higiene y la manipulación de los alimentos puede promover la propagación de la resistencia a los antimicrobianos⁸.

El impacto de la enfermedad causada por las STEC hace hincapié a la necesidad de incrementar las medidas preventivas de manipulación de alimentos y la vigilancia de brotes⁹. Además de las investigaciones epidemiológicas tradicionales, el principal método molecular de vigilancia es la electroforesis de gel de campo pulsado (PFGE por sus siglas en inglés). Este método es lo recomendado por el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC por sus siglas en inglés)¹⁰, dado que es crucial en detectar las infecciones por STEC¹¹. En México existen serotipos de STEC en bovinos que pueden estar involucrados en las enfermedades transmitidas por alimentos^12,13. El objetivo del presente estudio fue caracterizar y relacionar STEC de diferentes orígenes para contribuir a la descripción de su diversidad genética en México.

Material y métodos

Resultados

Del total de los 32 aislados probados la mayoría (75 %; 24 de 32) mostraron resistencia a alguno de los antibióticos utilizados. Nueve de los aislados (28.1 %) se clasificaron como MDR, 27 (84.3 %) presentaron un perfil intermedio en al menos un antibiótico y cuatro (12.5 %) fueron sensibles a todos los antimicrobianos. La frecuencia de resistencia varió ampliamente entre los antimicrobianos: 46.9 % (15/32) con CB, 50 % (16/32) con CF, 37.5 % (12/32) con AK, 28.1 % (9/32) con GE, 21.9 % (7/32) con AM y 3.1 % (1/32) con CTX. Varios aislados mostraron un perfil de resistencia intermedio: 56.3 % (18/32) con AM y 46.9 % (15/32) con PEF. Solo el SXT generó sensibilidad en todos los aislados (Figuras 1 y 2).

Columnas (izq. a der.): serotipos (O:H), identificación, origen (Heces, Canal), rastro (A, B, C), perfil de virulencia (stx, etcétera) y perfil de resistencia (NF-Nitrofurantoína, CB-Carbencilina, PEF- Pefloxacina, NET-Netilmicina, GE-Gentamicina, CTX-Cefotaxina, STX-Trimetoprima-sulfametoxazol, AK-Amikacina, AM-Ampicilina, CRO-Ceftriaxona, CL-Cloranfenicol y CF-Cefalatoxina; S = susceptible, R = resistente, I = intermedio).

Figura1 Perfil de PFGE (XbaI) generado con aislados de STEC de canales y heces de ganado de tres rastros municipales en el centro de México 

Se analizó la relación genética entre los diferentes aislados de E. coli mediante la genotipificación con la enzima XbaI-PFGE. De los 32 aislados estudiados se observaron 27 pulsotipos de PFGE. Se formaron siete agregaciones con dos o más aislados (A-F e I) y dos constituidas por una sola cepa (G y H); todos estos tenían porcentajes de similitud superiores al 85% (Figura 2). Las agregaciones D, E, F y G agruparon los aislados clasificados como MDR. Se identificaron cinco pulsotipos clonales. Los pulsotipos clonales 1 y 2 son del serotipo O22:H8 (agregación B). El primero proviene de diferentes fuentes como canales (aislado 48) y heces (aislado 50) mientras el segundo es de heces (aislados 46 y 51); sin embargo, sus perfiles de resistencia son diferentes. El tercer pulsotipo clonal (agregación D) es del serotipo O118:H21 y su origen es heces y canales (aislados 44 y 21), pero el perfil de resistencia es diferente. El cuarto pulsotipo (agregación F) es del serotipo O?:H51 y proviene de canales y heces (aislados 25 y 28); uno de los aislados es MDR. El quinto pulsotipo (agregación I) es del serotipo O37:H7, es de heces y canales (aislados 3 y 6) y ambos están sensibles a todos los antimicrobianos. Es de notar que los aislados MDR se encuentran en diferentes pulsotipos, lo que muestra su diversidad (Figura 2).

Figura 2 Resistencia antimicrobiana de los aislados STEC de canales y heces bovinas de tres rastros municipales en el centro de México 

Discusión

Cada año las STEC contribuyen a 265,000 casos de enfermedades transmitidas por alimentos en los Estados Unidos; hay informes de la resistencia a los fármacos antimicrobianos entre las STEC pero es probable que la subestiman¹⁶. Responsable por más de 700,000 muertes al año, la resistencia a los compuestos antimicrobianos entre los microbios es uno de los problemas más graves en el ámbito médico actual¹⁷. En las bacterias la resistencia se debe a una aceleración de los genes de resistencia a los antimicrobianos (ARG por sus siglas en inglés) a través de una mutación de novo. La transferencia horizontal de MGE, como los plásmidos, los transposones y los integrones¹⁸, se puede volver un asunto grave de salud pública particularmente en las bacterias transmitidas por la carne ya que es un importante portador de las cepas de E. coli resistentes a los antimicrobianos¹⁷. En el presente estudio se identifica las cepas de STEC en canales y heces bovinos y el 28.1 % de ellas son MDR, representando un riesgo especial. Todos los aislados STEC se mostraron sensibles al STX, pero su uso como tratamiento en infecciones de STEC en los humanos puede inducir la producción de la toxina Shiga lo cual puede llevar a una enfermedad más grave¹⁹.

La mejor estrategia para evitar las infecciones con STEC es tener un control del procesamiento de la canal. Varios estudios indican que los alimentos de origen animal suelen estar contaminados con bacterias y que es necesario mejorar el procesamiento del canal ya que la contaminación de las canales se produce por un mal manejo del contenido intestinal de los animales portadores². Por ejemplo, en un estudio realizado en México usando muestras aisladas de carne de res se encontró que el 92.4 % de las cepas eran MDR²⁰. En contraste al presente estudio, estas cepas mostraron patrones de resistencia contra siete a nueve antibióticos a la vez (44 %, n= 77), lo que podría deberse a que las muestras se obtuvieron en supermercados. La contaminación cruzada es de suma importancia ya que la exposición en la etapa de venta representa una exposición cumulativa a toda la cadena de producción (desde la granja hasta la mesa) lo que incrementa el riesgo potencial para la salud pública¹⁷. En otro estudio se analizaron aislados de STEC asociados con brotes, recolectados durante 2010-2014 y guardados en el Laboratorio de Referencia del Departamento de Salud y Servicios Humanos de Michigan (Lansing, MI, EE.UU.)¹⁶. Estos aislados presentaron resistencia a la ampicilina, la trimetoprima/sulfametoxazol y la ciprofloxacina, y su frecuencia de resistencia varió según su ubicación y origen, aunque no hubo diferencias en frecuencia entre localidades, lo cual coincide con observaciones en México.

Una vigilancia permanente de los antibióticos utilizados en el ganado es de gran importancia para determinar la presencia y prevalencia de las cepas resistentes en las canales⁸. Cuando no se manipula y cocina adecuadamente la carne de res contaminada con bacterias resistentes a los antimicrobianos estas pueden transferir sus genes de resistencia a otros patógenos, además de dejar sus toxinas, lo que podría conducir a enfermedades más difíciles de tratar²¹. Cocinar la carne contaminada resulta en una reducción mayor del riesgo de enfermedad¹⁷. Sin embargo, hay estudios que muestran que la E. coli puede sobrevivir al calentamiento hasta los 70 °C, conservando sus características y los genes que codifican la resistencia, y manteniendo la capacidad de transferir por electroporación, resaltando el riesgo de una transformación natural²². Por lo tanto, la estrategia más indicada para reducir el riesgo de infecciones por STEC consiste en reducir su prevalencia en el ganado aplicando prácticas de producción adecuadas y mejoras en el manejo de canales en los rastros.

En los presentes resultados se identifican varios elementos importantes de las STEC. El serotipo O157:H7, lo cual puede presentarse de forma asintomática o puede causar el desarrollo de diarrea, colitis hemorrágica y/o síndrome urémico hemolítico², mostró resistencia a cinco antibióticos: AK, AM, CB , CF y GE. El serotipo O117:H4, un serotipo emergente con una presencia epidemiológicamente fuerte que causa sepsis en humanos y se ha encontrado en bovinos con diarrea²³, presentó resistencia solo al AM. El serotipo O22:H8 presentó resistencia al AK, CB, CF y GE. Se ha asociado a la enfermedad en humanos y se ha identificado en Brasil²⁴, Francia²⁵ y Argentina²⁶. Estos resultados coinciden con la variabilidad en resistencia reportada en otros partes de México y el mundo. En un estudio en el Valle de Culiacán, en el noroeste de México, varias cepas de O157 y no-O157 STEC se encontraron resistentes a los antimicrobianos pertenecientes a clases como los aminoglucósidos, betalactámicos y cefalosporinas¹⁹. En el estado de Tamaulipas, México, un análisis de muestras de carne a la venta a menudo encontró que el 92.4 % de las cepas aislados fueron resistentes a la cefalotina, la ampicilina, la cefotaxima y la nitrofurantoína²⁰. En un estudio realizado en Etiopía, las resistencias más frecuentes entre los aislados fueron contra la cefoxitina, la ampicilina y la amoxicilina²⁷. Aislados de E. coli de muestras de dos granjas avícolas intensivas en China coleccionadas entre el 2000 y el 2012 mostraron ser fuertemente resistentes al SXT, la AM y la GM²⁸. En el mismo estudio se encontró cepas con resistencia a las sulfonamidas, pero esto se debe a que las unidades de producción avícola sufren de cuadros diarreicos de origen bacteriano y parasitario. Asimismo, las STEC no-O157 aisladas de los seres humanos y de animales han mostrado resistencia a múltiples antimicrobianos, incluida la resistencia a la trimetoprima-sulfametoxazol²⁸. Un análisis de aislados de animales y humanos (niños con diarrea) en Egipto encontró que presentaron resistencia a uno o más agentes antibióticos, y que fueron resistentes a la cefalotina, de manera independiente de su origen (alimenticio o humano). Estos mismos aislados han estado estrechamente relacionados (97 %) con las heces del ganado Suizo y las enfermedades en humanas en Alemania²⁹. En conjunto con los resultados de los estudios citados, los presentes resultados resaltan que el uso de antibióticos en entornos ganaderos puede llevar a la existencia de bacterias multirresistentes.

El serotipo O157:H7 se encontró únicamente en el rastro C, en cuatro muestras de canales y una de heces, todas tomadas en diferentes momentos. Este resultado enfatiza la importancia del manejo de canales en los rastros y demuestra la ocurrencia de la contaminación cruzada. Los hechos de que tomaron las muestras en diferentes momentos y que ninguno de estos aislados era clones (tienen un 83.3 % de similitud) confirma la contaminación cruzada. En un estudio sobre los productos cárnicos llevado a cabo desde el 2004 hasta el 2013, también se encontró una similitud del 67% y la ausencia de una relación clonal entre los aislados³⁰. Este confirma una vez más que los productos cárnicos son una fuente importante de la contaminación debido a un manejo inadecuado durante el procesamiento de canales y la obtención de productos y subproductos de origen bovino³¹. Un ejemplo adicional es un estudio en Argentina, donde el 12% de las infecciones con cepas de E. coli son de origen bovino³². Se identificaron aislados del mismo origen en humanos con síndrome urémico hemolítico, en salsas y en carne de res cocida y cruda.

En el presente estudio los seis aislados del serotipo O22:H8 presentaron diversidad y se agruparon en cuatro pulsotipos: los primeros dos en canales y heces, con perfiles de resistencia diferentes; y los otros dos solo en heces. Este sugiere que estos aislamientos probablemente pertenecen a animales que se encontraron en la misma unidad de producción (91.1 % de similitud). Este serotipo se identificó solo en el rastro C, pero representa un riesgo serio ya que se ha asociado con una enfermedad grave en los humanos. Del serotipo O112:H2 se identificaron tres aislados diferentes: dos de canal y uno de heces. Cada aislado viene de un rastro diferente (A, B y C) y tiene un 88.1 % de similitud, sugiriendo que este serotipo se encuentra a través del área central de México. También se ha encontrado el O112:H2 en carne de vacuno³³ y en hamburguesas³⁴, indicando que la fuente más probable será la canal. Los clones del serotipo O118:H21 vienen de canal y de heces muestreados del mismo rastro (C), aunque en diferentes momentos. Desde luego existe la posibilidad de que los animales sean de la misma unidad de producción o que este serotipo no sea tan diverso. La variación en serotipos encontrado en el presente estudio es menos que la reportada en otros estudios en México. Por ejemplo, en un análisis de aislados de E. coli de cuatro fincas rurales en Culiacán, México, se encontró que el serotipo O157:H7 presenta seis pulsotipos en uno de los clones identificados que viene de bovinos, ovinos y aves¹². En otro estudio realizado en un rastro tipo inspección federal (TIF) en México en 2009-2010, se encontraron 49 pulsotipos en 97 aislados de O157:H7 agrupados en tres agregaciones y con un 80% de similitud¹³. Las diferencias entre los estudios en cuanto al número de aislados y serotipos probablemente es un resultado de los distintos manejos de los animales y/o las canales en cada lugar de muestreo. En las fincas de Culiacán el control del manejo sería menos minucioso que en el rastro TIF donde siguen protocolos estrictos en el manejo de los canales. En el presente estudio los aislados originaron de muestras de rastros municipales, donde el manejo es mucho menos riguroso y los animales vienen de varias unidades de producción. La presencia de STEC en los animales que procesan estos rastros, que abastecen una de las principales áreas metropolitanas de México, es causa de preocupación ya que incrementa de manera considerable la posibilidad de la contaminación de los productos cárnicos durante el procesamiento.

Los resultados del presente estudio hacen hincapié a la necesidad de un monitoreo mucho más extenso y profundo en la industria agropecuaria de México. También sugieren que hay un proceso de contaminación cruzada muy amplia que involucra una variedad de serotipos de E. coli. Este problema no es exclusivo a México. Por ejemplo, en una investigación epidemiológica realizada en el noreste de Inglaterra, indagaron sobre las infecciones producidas por STEC y asociadas con el consumo de productos cárnicos y unidades de producción ganadera. Al secuenciar los aislados se encontró nexos epidemiológicos entre los casos clínicos, los carniceros y la finca proveedora del producto, mostrando de esta manera la contaminación cruzada por medio de la carne molida, entre otros productos³⁵.

Conclusiones e implicaciones

El ganado es el principal reservorio de las cepas de E. coli y desde luego el manejo que se da en las unidades de producción pecuaria y los rastros es de suma importancia. Se recomienda un uso prudente de los antibióticos en el ganado con tal de evitar el desarrollo de la resistencia a ellos y de mantener su eficacia. Su uso inadecuado fomenta la evolución de cepas de bacterias resistentes que pueden colonizar el tracto gastrointestinal humano a través de la cadena alimentaria, como los serotipos que se identificaron en este estudio. Con frecuencia estos serotipos conllevan la presencia de toxinas, que puedan causar efectos adversos y tener implicaciones clínicas. La presencia en México de varios serotipos de E. coli con resistencia comprobada a los antibióticos es, sin duda, un grave problema de salud pública.