La identificación de los genes que codifican rasgos complejos se ha logrado tradicionalmente por medio del escaneo del genoma entero en conjunto con el enfoque del gen candidato. Sin embargo, estos métodos no constituyen una estrategia confiable para la exploración sistemática de una red genética en la cual ocurre variación fenotípica en rasgos complejos¹.

Las redes de proteínas proporcionan una visión general de la organización genética a nivel de los sistemas y permiten la disección de los módulos funcionales que subyacen a los rasgos complejos. Esto facilita la predicción de nuevos genes candidatos para un rasgo². En el ganado bovino, se han utilizado algunos enfoques relacionados con las redes de interacción para identificar los genes candidatos relacionados con diferencias fenotípicas. Algunos ejemplos de estos comprenden: el marmoleado³, los genes involucrados en el estro (comportamiento) en el ganado lechero⁴ y los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) asociados con rasgos de crecimiento en vacas de la raza Charolais en México⁵.

La reproducción es un elemento esencial en la producción de ganado y los rasgos genéticos de la fertilidad tienen una relevancia económica muy significativa. Este proceso complejo involucra varios eventos consecutivos, los cuales incluyen la gametogénesis, la fertilización y el desarrollo embrionario temprano, entre otros. Ellos deben de ocurrir de una manera bien orquestada para lograr una preñez exitosa⁶.

Una mejor comprensión de los mecanismos que controlan los rasgos de fertilidad a nivel orgánico, celular y molecular podría ayudar en el desarrollo de estrategias diseñadas para mejorar o controlar la fertilidad⁴. El objetivo de este trabajo fue aplicar una red de interacción funcional para guiar a la identificación de los genes clave que controlan los rasgos reproductivos en el ganado bovino y explorar la variación genética dentro de estos genes para descubrir los que tienen el potencial de estar asociados con rasgos reproductivos.

Se llevó a cabo una revisión de la literatura. Se utilizó el software Genie (http://cbdm-01.zdv.uni-mainz.de/~jfontain/cms/?page_id=6) para extraer de texto basada en el PubMed a los genes que se han asociado previamente con rasgos reproductivos en bovinos (es decir, los genes de referencia). Para identificar y priorizar los genes candidatos para la red funcional se extrajeron las interacciones de los genes de referencia y se calculó el grado de asociación con la reproducción (DAR, por sus siglas en inglés) en la subred para cada uno de los genes usando la siguiente formula:

Donde W_ij es el peso del enlace que conecta la proteína i a la proteína de referencia j; y P_ij es el número de enlaces que conectan la proteína i a la proteína de referencia j (excluyéndose a sí mismo). Desde luego, la probabilidad de que cada una de estas proteínas está asociada con la reproducción se evaluó considerando sus interacciones con otros genes cuyas funciones biológicas se saben están relacionadas con la reproducción⁵. La selección de los genes candidatos asociados con las variaciones fenotípicas en los rasgos reproductivos se hizo por medio de la puntuación DAR. Con ésta se calculó el valor predictivo positivo (VPP), el cual representa la probabilidad de que un gen esté asociado con la reproducción; el criterio de selección fue el VPP más alto resultando de este análisis, es decir, 0.3^5,7.

De los genes candidatos identificados, se seleccionó el gen Ubiquitina B (Ubb) como blanco. Luego se analizó la variación genética en el Ubb utilizando once muestras de ADN de cuatro razas de ganado diferentes (3 Holstein, 2 Charolais, 3 Brahman y 3 Angus). Los cebadores UBB-F 5’-GAGAGATTTGTGAGAGATCTTGACG-3’ y UBB-R 5’-CCATTTTAACCTGTTGAGTACCCA-3’ fueron diseñados para cubrir y resecuenciar el Ubb bovino (número de acceso GenBank: AC_000176.1). Se purificaron los fragmentos producidos en el PCR usando el Exo-SAP-it (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Se hizo la secuenciación bidireccional por medio del procedimiento BigDye^® Terminator y usando un secuenciador de ADN ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las secuencias se alinearon con el programa de ClustalX 2.0.8⁸.

Por medio de la inspección visual de los cromatogramas de secuencia se confirmó la presencia de los SNP en las secuencias resultantes. Se definieron a los SNP de acuerdo a su presencia en la población de selección asociada con los tres genotipos esperados.

Se diseñaron sitios de restricción creados por la amplificación y acoplados al PCR (PCR-ACRS) para identificar los genotipos del SNP no sinónimo rs110366695 encontrados en el anterior cribado de secuenciación. Después de la PCR, se digirieron a los fragmentos usando 2.5 U del enzima Hinf I para luego analizarlos en un gel de agarosa al 2.5%. Se observaron los siguientes patrones de digestión: 210+132+130+18 pb (alelo G), y 210+155+150 pb (alelo T).

Se identificaron los genotipos de una población de sesenta y siete toros jóvenes de las razas Angus y Charolais usando el PCR-ACRS. Las frecuencias alélicas y genotípicas se calcularon para cada raza y se probaron las desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg con el paquete estadístico GENEPOP versión 4.2⁹.

Un conjunto de 385 genes de referencia asociados con rasgos reproductivos en bovinos se identificó por medio de sus SNP, sus perfiles de expresión o su función biológica. Según el VPP, los genes que presentaban un DAR≥11 tenían una probabilidad superior al 33% de estar asociados con rasgos reproductivos en el ganado. Los que cumplían este criterio pertenecían a la familia de la ubiquitina: Ubiquitina C (Ubc; ID del gen: 444874) y B (Ubb; ID del gen: 281370).

Se determinó la importancia de estas proteínas, Ubb y Ubc, en la topología de la red de interacción en base con el número de interacciones de las cuales forman parte. Tanto Ubb como Ubc tienen 3,775 interacciones de 3,856 posibles, indicando que ambas son centros muy importantes. Por medio de la herramienta BiNGO (por sus siglas en inglés - Biological Network Gene Ontology) (https://www.psb.ugent.be/cbd/papers/BiNGO), se identificó que en la subred que forma Ubb y Ubc la anotación de “Gene Ontology 51094” (lo cual significa la “regulación positiva del proceso de desarrollo”) tiene un valor de p de 4.8 E-09, lo que indica una sobrerrepresentación. Este resultado tiene sentido y está relacionado con la reproducción en el ganado ya que este término del proceso biológico se refiere a cualquier proceso que activa o aumenta la tasa o la extensión del desarrollo y el resultado específico de lo cual es la progresión de un organismo a lo largo del tiempo desde una condición inicial (por ejemplo, un cigoto, o un adulto joven) a una condición posterior (por ejemplo, un animal multicelular o un adulto de edad avanzada). Este se vea apoyado en la representación de las interacciones del Ubb y Ubc con 23 módulos de genes de referencia, es decir, genes previamente asociados con la reproducción en bovinos (Figura 1)^8-33.

A) Tasa de concepción de las vaquillas, son los SNP relacionados con el intervalo hasta la inseminación; B) Los efectos del sistema Well-of-the-Well (WOW) y la densidad embrionaria en las tasas de desarrollo, genes de regulación diferencial en embriones cultivados in vitro; C) Tasa de embarazo de la hija, tasa de concepción de las vaquillas, tasa de concepción de las vacas; D) Plazo de supervivencia en embriones de genes de regulación diferencial, potencial de los patrones de expresión de los genes endometriales y los embrionarios pretransferencia: E) Bloqueo de la apoptosis en embriones bovinos, embriones de genes de regulación diferencial tratados con CSF2; F) Función inmune y los genes de desarrollo expresados en el endometrio, genes endometriales de regulación diferencial en vacas lactantes; G) Genes de regulación diferencial en ovocitos en comparación con embriones de 8 células, activación global del genoma embrionario; H) Tasa de concepción de las vacas; I) Igf1 actúa en la protección termal en embriones bovinos, genes de regulación diferencial en embriones tratados con Igf1; J) Genes endometriales de regulación diferencial en vacas gestantes y asociaciones con la fertilidad en vacas lecheras lactantes; K) Genes de regulación diferencial en ovocitos en comparación con blastocistos, genes candidatos para la caracterización del desarrollo; L) Los genes del hígado regulados de manera diferencial durante el período de transición, la determinación de las adaptaciones hepáticas que se producen al final de la gestación; M) Genes regulados de manera diferencial en el oviducto de vacas en diestro en comparación con el estro; N) Genes en las células del cúmulo regulados por la oleada de LH, células del cúmulo en desarrollo y la fertilidad de los ovocitos; O) Genes regulados de manera diferencial en diferentes etapas de la maduración de los ovocitos; P) Tasa de concepción relativa estimada, mérito neto y rendimiento de grasa; Q) Tasa de parto (ganado de vacuno), mérito neto, porcentaje de grasa y vida productiva; R) SNP relacionados con el intervalo a la inseminación; S) Desarrollo embrionario en la etapa del blastocisto; T) Regulación diferencial en células cúmulos de embriones in vivo en comparación con embriones in vitro; U) El anti-apoptótico en los embriones mejora la competencia del embrión; V) Genes mamarios regulados de manera diferencial durante la lactancia.

Figura 1 La red de interacción de Ubb and Ubc 

La proteína ubiquitina (Ub) es común en todas las células eucariotas. La conservación de su estructura sugiere que tiene un papel importante en el metabolismo celular. A través del proceso de la ubiquitinación, el Ub guía la degradación de la proteína y regula diferentes eventos biológicos como son la progresión del ciclo celular, la endocitosis membrana-receptor, la aparición de antígenos en el sistema inmune e incluso la infección retroviral³⁴. La ubiquitinación se logra mediante la unión covalente del 76-AA ubiquitina (8.5 kDa) al grupo ε-amino en los residuos Lys del sustrato a través del residuo AA C-terminal de la ubiquitina (G76). Este proceso requiere de la hidrólisis de ATP y un conjunto de factores para la conjugación de ubiquitina, entre ellos las enzimas activadoras de ubiquitina (UBA) y los conjugadores de ubiquitina (Ubc)¹¹.

De las múltiples funciones del sistema Ub, las que participan en los procesos de desarrollo y reproducción son especialmente relevantes. Su papel en el desarrollo se ha estudiado usando modelos como las transiciones del desarrollo en Dictyostelium discoideum y la especificidad del desarrollo en Caenorhabditus elegans^35,36. Se sabe que el sistema Ub está involucrado en la embriogénesis en pollitos, así como en la miogénesis y el desarrollo del cerebro en los humanos³⁴. En cuanto a los procesos reproductivos, en los humanos la Ub es la proteína principal en el plasma seminal, y el sistema de ubiquitinación se ha relacionado con problemas de fertilidad en humanos y otras especies, incluido el ganado^37,38. En varias especies una alta proporción de espermatozoides ubiquitinados en el eyaculado está relacionada con infertilidad³⁸.

En el ganado bovino, un aumento en los niveles de ubiquitina está asociado con un aumento en los niveles de daño al ADN espermático y con una reducción en la fertilidad³⁹. En los toros se ha reportado una correlación negativa entre el nivel de ubiquitina de los espermatozoides y el recuento de espermatozoides, la movilidad y el porcentaje de morfología normal; es decir, niveles elevados de ubiquitina en los espermatozoides auguran una mala calidad del semen y una baja fertilidad³⁹. A raíz de esta evidencia se puede utilizar a los espermatozoides ubiquitinados como una herramienta eficaz para identificar algunos problemas de fertilidad^40,41. Aunque existan evidencias de que los mecanismos biológicos en los sistemas de ubiquitinación puedan afectar la fertilidad en diferentes especies, el proceso del marcado de la ubiquitina de los espermatozoides y el papel que juega este proceso en la biología de los espermatozoides todavía no se entiende por completo.

Al buscar datos adicionales para apoyar la posibilidad de que estos genes pueden ser genes candidatos, se logró la caracterización molecular del gen del Ubb. Según la base de datos del NCBI la longitud del gen es de 1898 pb y contiene un exón en la posición 841 a 1758. En esta base de datos se han reportado 19 SNP en las secuencias codificantes y 15 SNP en los no codificantes. El fragmento 1328 pb amplificado permitió la identificación de 5 SNP en la población de estudio, 3 (rs109592218, rs110007734 y rs110366695) en la región codificante y 2 (rs720990890 y rs439271103) en la región no codificante. La transversión rs110366695 (G/T) ubicada en el exón 1 es particularmente interesante porque causa un cambio funcional no sinónimo. Además, el codón GAG, que produce el ácido glutámico (Glu, E), cambia a UAG, que es un codón de terminación. Este cambio predice la presencia de una proteína truncada que es 287 aminoácidos más corta que la proteína no mutada. En el análisis de las frecuencias alélicas de SNP rs110366695 en el ganado vacuno de las razas Angus y Charolais el alelo G tenía las frecuencias más altas (0.542 y 0.750, respectivamente) (Figura 1). Había desviaciones significativas (P<0.001) del equilibrio de Hardy-Weinberg en la raza Angus, y el número de heterocigotos encontrado era más bajo de lo esperado para estos loci.

Hasta la fecha no hay estudios moleculares enfocados en la evaluación de los efectos de la variación genética de Ubb en la calidad del semen, a pesar de la importancia fisiológica del gen Ubb. Los resultados del presente estudio respaldan el gen Ubb como un gen candidato fuerte con variaciones genéticas que se deben de probar para confirmar su asociación con rasgos reproductivos. Desafortunadamente, en México el análisis de fenotipos para los rasgos reproductivos no es una práctica común. Este hecho resalta la necesidad de preparar una base de datos amplia para permitir la confirmación de su influencia genética en estos rasgos, particularmente de la transversión rs110366695 (G/T).

Una red de interacción proteína-proteína basada en el análisis ha sido validada previamente como una herramienta útil en la identificación de los genes causales asociados con rasgos económicos en bovinos y otras especies. Los resultados obtenidos proporcionan información sobre el potencial de Ubb y de Ubc como genes candidatos para los rasgos reproductivos, en particular para la calidad del semen. Resaltan la importancia de una exploración más a fondo tanto sobre los efectos del truncamiento de las proteínas como su potencial como marcador molecular.