Introducción

Las enfermedades parasitarias son una de las principales causas de pérdidas económicas para la industria ganadera en los sistemas de producción tropical y subtropical. Estas enfermedades tienen un impacto enormemente prevalente relacionado con factores de la cadena epidemiológica tales como la presencia de vectores y los cambios ambientales¹. La ivermectina es una lactona macrocíclica popular desde su introducción en el mercado^2,3. Este fármaco es una mezcla de dos homólogos, en una proporción de 80 % de 22,23-dihidroavermectina B1a (H₂B_1A) y no más de 20 % de 22,23-dihidroavermectina B1b (H₂B_1b)⁴. En la comunidad europea se han determinado límites máximos de residuos (LMR) para el uso de la porción de B1A como indicador⁵. Su destacado uso en la medicina veterinaria se deriva de la actividad espectral para el control de los nematodos y artrópodos, lo cual genera un marcado interés en el desarrollo de la investigación. Además, también se ha utilizado el grupo de las lactonas macrocíclicas en la agricultura para el control de plagas, y en la medicina humana, sobre todo para el tratamiento de la oncocercosis^6,7.

Desde el punto de vista farmacocinético, los estudios han demostrado que el principal órgano en el que se detectan los residuos de la ivermectina es el hígado en casi todas las especies evaluadas^8,9,10. Por ello, debido a su excesivo uso en el campo, al consumo de vísceras y a su posible toxicidad, este órgano fue elegido como matriz para realizar este estudio. Se han desarrollado diversas metodologías para detectar los residuos, entre las cuales la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, en inglés) y la espectrometría de masas son las más recomendadas por su elevada sensibilidad y selectividad; sin embargo, también presentan ciertas desventajas, por ejemplo: el proceso de extracción es complejo y se requiere de un equipo costoso¹¹. Otras metodologías semi-cuantitativas tales como la prueba competitiva ELISA se utilizan como método de detección en diversas matrices. Algunas ventajas son su bajo costo, su rapidez con una sensibilidad y especificidad relativamente buenas en comparación con la HPLC^4,12.

El propósito de esta investigación fue determinar la presencia de residuos de ivermectina en hígados bovinos de la Sabana de Bogotá, D.C., utilizando la técnica de ELISA competitiva y correlacionando la presencia de residuos con las variables género y edad. Además, este estudio describe los cambios hisopatológicos en las muestras evaluadas.

Material y métodos

Resultados

Los coeficientes de determinación obtenidos para calcular la concentración de residuos fueron, en promedio, de 97 %. La mayoría de los individuos presentaron niveles de menos de 8 ppb (78 %); el 19 % presentaron entre 8 y 100 ppb, y solamente el 3 % presentaron residuos de más de 100 ppb, los cuales rebasan los LMR (Figura 1).

Figura 1 Distribución de residuos de ivermectina en la población evaluada 

La población sin residuos (LDD <8 ppb) se originó principalmente en Zipaquira (44 %, 28/70), seguida de Cogua (26 %, 18/70) y a Sopo y Chiquinquira, respectivamente, correspondieron el 10 % restante (7/70) de los animales evaluados. Para la variable raza, la proporción más elevada de animales fue la Normanda (34 %, 24/70), seguida de Holstein 28 % (20/70) y Mestiza 23 % (16/70). En cuanto a la variable edad, sólo el 13 % (9/70) fueron animales de menos de 1.5 año de edad, y el 87 % eran mayores de 1.5 año. Para la variable género, se observó que el 59 % (41/70) de los animales muestreados fueron hembras, y el 41 % (21/70) fueron machos.

Los individuos con presencia de residuos se originaron sobre todo en Cogua (35 %, 7/20), Zipaquira (30 %, 6/20), Sopo (20 %, 4/20). Solamente un individuo de La Vega, Bogotá y Guasca, respectivamente, fue positivo. Las razas en las que se encontraron residuos fueron Mestiza (35 %, 7/20), Cebú (25 %, 5/20), Normanda (20 %, 4/20) y Jersey x Holstein (15 %, 3/20); para Holstein se registró solamente un individuo. El 85 % (17/20) de los animales fueron mayores de 1.5 año, y el 15 % restante (3/20) fueron menores de 1.5 año. En lo que se refiere al género, fueron sobre todo machos (65 %, 13/20); el 35 % (7/20) fueron hembras.

Sólo el 3 % (3/90) de las muestras rebasó el LMR). Todos los animales positivos fueron machos; dos muestras provenían de Sopo y una de Cogua, y dos de ellos eran mayores de 1.5 año. Estos animales pertenecían a las razas Mestiza, Holstein y Jersey x Holstein (Cuadro 2). Cuando se realizó la prueba de asociación de Ji² no se encontraron asociaciones entre las variables edad (P=0.84), género (P=0.06) y concentración de ivermectina.

Para el análisis histopatológico se evaluaron 86 muestras, y como se mencionó antes, 20 hígados presentaron residuos de ivermectina, y 66 hígados fueron considerados negativos. La Tabla 3 registra los datos por severidad de la lesión y según las diversas variables analizadas. Cabe mencionar que en las muestras analizadas no se observaron inversiones lobulares ni lesiones compatibles con la necrosis. La mayoría de los cambios observados fueron leves en ambos casos. Para las muestras sin residuos, los principales cambios observados correspondieron al nivel inflamatorio, entre los cuales destaca una presencia de monocitos leve (28/66), moderada (6/66) y severa (3/66). También se describieron cambios leves en la vacuolización (41/66), hiperplasia (15/66), hiperplasia moderada (22/66), fibrosis leve (27/66) y fibrosis moderada (21/66). Encontramos asociación entre las variables alteración microcirculatoria, alteración inflamatoria y cambio similar a la muerte celular (P<0.05) (Cuadro 3).

Los animales con evidencia de residuos (20) presentaron alteraciones en las variables arquitectónicas: 10 muestras exhibieron cambios vacuolares (7, leves, y 3, moderados); 9 tuvieron hiperplasia canalicular (8, leve, y 1, moderada), y 14 tuvieron fibrosis portal (11, leve; 2, moderada, y 1, severa) (Figura 2). Dieciocho (18) muestras que contenían residuos de ivermectina presentaron congestión centrilobular (11, leve, y 7 moderada); 13 muestras presentaron congestión generalizada y dilatación sinusoidal (10, leves, y 4, moderadas), y 4 focos hemorrágicos (1, leves, y 3, moderados) (Figura 3).

A. Arquitectura normal en los hepatocitos (400X) y B. el área portal (100X). Cambios arquitectónicos en el parénquima hepático de ganado con residuos. C. Cambios vacuolares, obsérvese la presencia de vacuolas intracitoplásmicas (punta de la flecha) (400x). D. Fibrosis leve del área portal (flecha) (100X).

Figura 2 Hígado bovino sin residuos de ivermectina 

Figura 3 Cambios microcirculatorios en el parénquima hepático de ganado con presencia de residuos de ivermectina. Se evidenciaron congestión leve y dilatación sinusoidal. 

En relación con el infiltrado inflamatorio, 13 de los 20 animales presentaron infiltración mixta, predominantemente por células mononucleares (15, leve, y 1, moderada) en distribución centrilobular. En comparación, en ambos grupos se halló una amplia gama de cambios asociados a procesos microcirculatorios, arquitectónicos, inflamatorios y de muerte celular (apoptosis) (Figura 4). Y en cuanto a la última alteración, sólo ocho de las muestras analizadas mostraron alteraciones asociadas con cambio similar a muerte celular, caracterizados por una distribución multifocal en los tejidos con presencia de residuos de ivermectina (Cuadro 3).

Figura 4 Cambios compatibles con la apoptosis, hígado de bovino con residuos de ivermectina obtenido de un rastro. Células con alteraciones relacionadas con muerte celular (flechas)  

Discusión

La ivermectina es un compuesto activo que se ha utilizado durante casi 20 años en numerosos países y en diferentes sistemas de producción de animales. Como resultado de su uso, se realizan pruebas de control en productos alimenticios derivados del ganado a fin de armonizar los procesos de comercialización. Se han realizado varios estudios que reportan distintas metodologías para este propósito, tales como la técnica de ELISA competitiva. Este método se desarrolló antes⁴, utilizando antisuero policlonal de conejo y el límite de detección (LDD), fue de 1.6 μg/kg, y los anticuerpos presentaron una reacción cruzada con la doramectina, pero no con la moxidectina. En ese estudio se analizaron muestras de hígados negativos (1.6 ng/g), hígados fortificados con 100 ng/g de ivermectina e hígados tratados tópicamente con 0.5 mg/kg, de animales sacrificados en los días 7, 14, 21 y 28. En este caso, los niveles de ivermectina fueron de 52.7 ng/g en el 7° día después del tratamiento y se redujeron a 4.1 ng/g en el 28° día. Los datos fueron confirmados mediante otra técnica complementaria, como la cromatografía líquida de alto desempeño (en inglés, HPLC). El rango de ambas pruebas fue de 1 a 58 ng/g con una correlación cercana (r = 0.99).

En un estudio realizado por otros autores¹² en el que se desarrolló una prueba ELISA para la detección de múltiples avermectinas (abamectina, eprinomectina e ivermectina), la avermectina modificada 4C-O-succinil avermectina se conjugó con albúmina bovina y ovoalbúmina como inmunógenos para generar anticuerpos policlonales en preparación. El LDD para esta prueba fue de 1.06 ng/ml para las tres avermectinas. El porcentaje de recuperación osciló entre 53.8 % y 80.6 %, y fue similar al de reportes anteriores en los que se utilizó HPLC, lo que hace de esta técnica en un método rápido de tamizaje para detectar avermectinas en los hígados bovinos. En el presente estudio, el LDD de 8 ppb (reportado por el fabricante). 70 muestras se encontraron por debajo del mismo; 17, entre 8 y 100 ppb, y sólo 3 superaron los 100 ppb. Es importante tener en cuenta que en este caso no se realizaron pruebas confirmatorias adicionales; sin embargo, dados los datos obtenidos, sería pertinente extender este tipo de enfoque a otros sistemas de producción con un mayor uso de este compuesto activo, situación que se ha reportado en otras áreas del país.

Volviendo al LMR, sólo el 3 % de las muestras rebasaron el valor máximo reportado por las autoridades colombianas (>100 ppb); este porcentaje puede considerarse como un nivel bajo. En Colombia se llevó a cabo un estudio para determinar la residualidad de los insecticidas organofósforo, carbamatos e ivermectina en la leche cruda de granjas ubicadas en zonas tropicales. De 609 muestras analizadas, 37.44 % contenían niveles de organofosfato por encima del LMR; la mayoría de las muestras positivas fueron encontradas en la Región de Magdalena. Sin embargo, se analizaron 180 muestras de leche para detector y cuantificar residuos ivermectina, y todas las muestras rebasaron el LMR¹⁵. Los datos obtenidos en este estudio fueron similares a los observados en otros países como México, donde se evaluó la presencia de residuos de ivermectina debido al uso incrementado de esta molécula en las granjas. En este caso, se tomaron 234 muestras de hígados en el transcurso de un mes y se las analizó mediante HPLC. Sólo una muestra no estuvo dentro de los parámetros (149 μg/kg), situación similar a otra reportada anteriormente por un esquema de control para esta área¹⁶.

Estos datos arriba difieren de otro reportado en el Brasil. Debido a problemas de residualidad durante 2010, se desarrollaron varias técnicas de detección en matrices musculares, permitiendo el establecimiento del LMR, y se tomaron las medidas pertinentes para ejercer el control de los medicamentos dentro de los sistemas de producción¹⁷. Algunas de las estrategias utilizadas correspondieron a campañas educativas para productores a fin de prevenir las enfermedades parasitarias mediante el manejo y el uso de medicamentos, tomando en cuenta varios factores que pueden ocasionar que se rebasen los niveles máximos de residuos, tales como la formulación del producto, las propiedades del ingrediente físicoquímico activo, sobredosis, método de administración, uso del producto en especies no recomendadas, lotes de animales heterogéneos y, por último, el incumplimiento de los tiempos de retiro^2,11.

Por lo que respecta a las características epidemiológicas, no se observó ninguna asociación entre las variables género y edad y la presencia de residuos. Pese a este hecho, hubo una mayor presencia de residuos en los machos que en las hembras. Tomando en cuenta esto, los datos farmacocinéticos reportados muestran que hay diferencias relacionadas con el género y con la disposición plasmática del ingrediente activo. Estas características han sido estudiadas en diversas especies animales y específicamente en el ganado se han encontrado diferencias relacionadas con el género en función de la concentración en plasma cuando se evaluó la ivermectina y la doramectina; la biodisponibilidad de ambas moléculas fue 10 % más elevada en las novillas que en los cabestros¹⁸. Esta diferencia se asoció a la cantidad de tejido adiposo en los machos y en las hembras, considerando las características del ingrediente activo, tales como la elevada liposolubilidad del agente endectocida que promueve su almacenamiento en este tejido y favorece su persistencia⁹.

Si bien se observaron residuos en las hembras, el porcentaje encontrado fue muy bajo (15 %). Posiblemente los animales evaluados se encontraban en un periodo de no lactancia (seco), lo que llevó a que fueran descartadas y sacrificadas, pero en todo caso superaron los límites, y los datos más relevantes se encontraron en los machos. Aun así, es importante tener en cuenta que la única avermectina aprobada para su uso en granjas lecheras es la eprinomectina y que otros factores, como la influencia de las hormonas, puede afectar el metabolismo del fármaco en lo relativo a su transformación y eliminación^15,19.

La evaluación histopatológica de este estudio permitió una amplia gama de hallazgos de alteración hepática parenquimal, uniforme en los animales con y sin residuos. Cuando se evaluaron las alteraciones microcirculatorias, algunos animales con residuos presentaron un mayor grado tanto de cambios congestivos como de severidad de focos hemorrágicos, lo que sugiere una mayor susceptibilidad de desarrollar trastornos asociados con alteraciones de la red vascular del parénquima hepático; sin embargo, el número de animales que desarrollaron este tipo de trastornos no resulta ser significativo.

Numerosas sustancias químicas sufren parte de su biotransformación en el tejido hepático; esto también significa que una parte considerable de estos compuestos podrían generar alteraciones celulares del parénquima y causar así posibles trastornos asociados a alteraciones de funciones hepáticas como la síntesis de proteínas, la transformación de los carbohidratos y el metabolismo de los lípidos. Entre las sustancias que el hígado procesa se encuentran los fármacos, las toxinas bacterianas y las plantas tóxicas. En este sentido, no se puede descartar el efecto, único o concomitante, de este tipo de compuestos en las muestras analizadas.

Un estudio realizado en ratas para evaluar el efecto de tratamientos masivos y prolongados con ivermectina y otras moléculas contra diversos parásitos demostró algunas alteraciones clínicas compatibles con la hepatotoxicidad, y los cambios anatomopatológicos revelaron distorsión arquitectónica, necrosis hepatocelular e hiperplasia celular de Kupffer²⁰. En los casos hiperagudos de intoxicación en cabras, se reporta muerte repentina sin alteraciones patológicas sistémicas²¹. En los seres humanos, un reporte de caso demostró el potencial hepatotóxico de la ivermectina después de su administración a un paciente con filariasis, puesto que se detectó infiltrado inflamatorio intralobular y acumulación de pigmento ceroide, así como necrosis perivenular, necrosis y apoptosis²². Según las directrices internacionales, la ingesta diaria aceptable establecida para los seres humanos es de 10 μg/kg (600 μg/persona/d)⁵; estos niveles no fueron observados en las muestras analizadas. Cabe señalar que, al igual que estos reportes, el presente estudio evidenció cambios similares a la apoptosis exclusivamente en animales con presencia de residuos; sin embargo, sería necesario efectuar otros estudios, por ejemplo, una inmunohistoquímica, a fin de clarificar la asociación entre los residuos y el desarrollo de lesiones hepáticas.

Se ha asociado el envenenamiento con ivermectina con la sobredosis o con la presencia de una mutación de P-glicoproteína que promueve el desarrollo de síntomas neurológicos en varias especies animales. Se ha asociado la intoxicación humana con efectos leves a moderados de una reacción de Mazzotti y de una encefalopatía ligadas a un tratamiento microfilaricida o a la exposición a lactonas macrocíclicas²³.

Conclusiones e implicaciones

En conclusión, la prueba de ELISA comparativa utilizada en este estudio sirvió como método de tamizaje para analizar los residuos de ivermectina en hígados bovinos. Sólo un 3 % de las muestras rebasó el LMR, y no se halló correlación entre la presencia de residuos y las variables género y edad (P>0.05). La mayoría de los cambios histopatológicos fueron leves o moderados, entre los cuales destacan las alteraciones en la arquitectura y los cambios inflamatorios. Existe una asociación estadística entre la presencia de residuos de ivermectina y las variables alteración microcirculatoria, alteración inflamatoria y cambios similares a la muerte celular (P<0.05).