Preparación de extractos de ADN y determinación del grupo filogenético

Se estudiaron 34 E. coli resistentes a antibióticos, que fueron aisladas de casos de mastitis bovina subclínica en el occidente del estado de Michoacán, México, y las cuales fueron descritas previamente²³. A partir de estos aislados se prepararon extractos totales de ADN de acuerdo a lo descrito en la literatura²⁴. Para la determinación del grupo filogenético al que pertenecen las E. coli se siguió el esquema descrito en la literatura¹⁰. Los primers utilizados para la amplificación de los fragmentos fueron: ChuA.1 (5’-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3’) y ChuA.2 (5’-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3’), YjaA.1 (5’-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3’) y YjaA.2 (5’-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3’) y TspE4C2.1 (5’-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3’) y TspE4C2.2 (5’-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3’). Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 µl conteniendo: 1X PCR Master mix (Promega, Madison, WI, USA), 1 µM de cada primer y 2 µl de extracto de ADN bacteriano (50 ng). La amplificación de los fragmentos se llevó a cabo en un termociclador C1000 (Bio-Rad, México, DF, México) en las siguientes condiciones: un ciclo inicial de desnaturalización inicial a 94 °C por 5 min, seguido de 30 ciclos en las siguientes condiciones; desnaturalización a 94 °C por 30 s, alineamiento a 55 °C por 30 s y extensión a 72 °C por 30 s. La amplificación se terminó con un ciclo de extensión a 72 °C durante 5 min. Los productos amplificados se separaron en geles de agarosa al 1.5 % y se visualizaron en un fotodocumentador Universal Hood II (Bio-Rad).

Producción de biopelículas

La producción de biopelículas se realizó de acuerdo a la literatura²⁵ con algunas modificaciones como se describe a continuación. Las bacterias se sembraron en cajas Petri con agar soya tripticasa (AST, BD, México, DF, México), a partir de dichos cultivos se inocularon tubos con 2 ml de caldo soya tripticasa (CST) adicionado de 0.25 % de glucosa, se incubaron toda la noche a 37 °C con agitación constante. Al día siguiente los cultivos se diluyeron hasta igualar con el tubo 0.5 de la escala de MacFarland en TSB con 0.25 % de glucosa. De la dilución bacteriana se depositaron 200 μl por triplicado en placas de Elisa de 96 pozos y se crecieron por 24 h a 37 °C sin agitación. Como control negativo se usó medio de cultivo sin inocular y como control positivo se utilizó la bacteria formadora de biopelículas Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Se descartó el cultivo bacteriano y los pozos de la placa se lavaron tres veces con solución salina estéril, para la fijación de las células la placa se dejó secar a 60 °C por 1 h. Posteriormente, se adicionaron 200 μl de cristal violeta al 1% y se dejó a temperatura ambiente por 20 min, se lavó la placa con agua corriente hasta que no se observó desprendimiento de color y se dejó secar a temperatura ambiente. A cada pozo de la placa se le adicionaron 200 μl de etanol al 96%, se agitó para solubilizar el cristal violeta, el sobrenadante se transfirió a un tubo de microcentrífuga y se repitió el proceso, el volumen del tubo se llevó a 1 ml y se midió la densidad óptica a 570 nm (D.O.) en un espectrofotómetro SmartSpec Plus (Bio-Rad). El ensayo se repitió cuatro veces por triplicado y con los datos obtenidos se calculó el promedio de la D.O. De igual forma se calculó la densidad óptica de corte (D.O.c.), para lo cual se tomó como base el promedio de la D.O. del control negativo más tres veces su desviación estándar, obteniéndose un valor de 0.22. La clasificación de las bacterias formadoras de biopelículas se realizó como sigue: formadoras fuertes D.O>4xD.O.c., moderadas 2xD.O.c.<D.O≤4xD.O.c., débiles D.O.c.<D.O.≤2xD.O.c. y negativas D.O.≤D.O.c.²⁵.

Detección de genes asociados a la formación de biopelículas

Se analizó mediante PCR la presencia de dos genes asociados con la formación de biopelículas, fimA (subunidad principal de la fimbria tipo I) y csgA (subunidad principal de la fimbria curli). Para lo cual se amplificó un fragmento de 119 pb de fimA con fimA-F (5’-CTCTGGCAATCGTTGTTCTGTCG-3’) y fimA-R (5’-GCAAGCGGCGTTAACAACTTCC-3’) y de 178 pb de csgA con csgA-F (5’-GATCTGACCCAACGTGGCTTCG-3’) y csgA-R (5’-GATGAGCGGTCGCGTTGTTA CC-3’)²⁶. Las reacciones se realizaron en 25 µl conteniendo 1X PCR Master mix (Promega), 1 µM de cada primer, 2 µl de extracto total de ADN. Las condiciones utilizadas fueron las siguientes: un ciclo inicial de desnaturalización a 95 °C por 5 min, seguido de 30 ciclos a 94 °C por 30 s, 55 °C por 30 s y 72 °C por 30 s, las reacciones se terminaron con un ciclo de extensión a 72 °C por 10 min. Los productos amplificados se separaron en geles de agarosa al 2% y se visualizaron como se describió anteriormente.

Determinación de la movilidad tipo “swarming”

El análisis de movilidad bacteriana se realizó siguiendo el protocolo ya descrito¹⁵. Para la movilidad tipo swarming los cultivos se crecieron toda la noche en caldo LB (Lysogeny Broth). Posteriormente se depositaron 5 µl en placas con agar swarming (LB con agar al 0.5%) adicionado con 0.5 % de glucosa. Las bacterias se incubaron por 12 h a 37 °C. Posteriormente se midió el diámetro del desplazamiento bacteriano, las determinaciones se repitieron al menos tres veces y con los datos obtenidos se calculó el promedio.

Rep-PCR de E. coli causante de mastitis bovina

Para el análisis de la diversidad genética se purificó ADN genómico de acuerdo a protocolos estándar²⁷, con el DNA purificado se realizaron amplificaciones por PCR en 25 µl de mezcla de reacción con los siguientes componentes: 12.5 µl de 2X Master mix (Promega), 3 mM de MgCl₂, 5% de DMSO, 0.16 µg/µl de albumina de suero bovino, 100 ng de ADN y 2 µM del primer (GTG)₅ (5’-GTGGTGGTGGTGGTG-3’). La amplificación se realizó en un termociclador C-1000 (Bio-Rad) en las siguientes condiciones: un ciclo de desnaturalización inicial a 95 °C durante 2 min, seguido de 30 ciclos a las siguientes condiciones; desnaturalización (94 °C/3 s y 92 °C/30 s), alineamiento (40 °C/1 min), extensión (65 °C/8 min) y se finalizó con un ciclo de extensión a 65 °C durante 8 min²⁸. Los productos amplificados se separaron en geles de agarosa al 1.5% y se visualizaron en un fotodocumentador Universal Hood II (Bio-Rad).

Para el análisis de los patrones de bandas obtenidos se usó el software GelJ versión 2²⁹. El tamaño de las bandas fue normalizado usando como estándar de referencia el marcador 1 kb DNA ladder (Promega), que tiene fragmentos entre 250 y 10,000 pb. Los coeficientes de similitud fueron generados por el método de Dice con 2 % de tolerancia entre los carriles y el dendrograma se construyó usando el método UPGMA.

Virulencia en Galleria mellonella

Se analizó la virulencia in vivo de bacterias representativas que mostraron los mayores índices de formación de biopelículas, así como no formadoras en larvas de G. mellonella; para lo cual, se utilizaron larvas de 150 a 200 mg, libres de daño aparente y sin melanización (manchas necróticas) (Petmmal, Cuautitlán Izcalli, México). Las larvas se almacenaron en a 30 °C en obscuridad hasta su uso. Para los ensayos de infección se utilizaron cultivos bacterianos crecidos en caldo LB hasta la fase exponencial media de crecimiento (D.O. 600 nm= 0.5), se centrifugaron a 12,000 rpm/min, se lavaron dos veces con 1 ml de MgSO₄ 10 mM, al final las bacterias se re-suspendieron en 1 ml de MgSO₄ 10 mM. A partir de esta suspensión celular, se realizaron diluciones seriales hasta obtener una concentración bacteriana de aproximadamente 1x10⁵ UFC/ml, lo cual fue confirmado mediante el conteo de UFC en agar LB.

Para cada una de las bacterias a estudiar se utilizaron 10 larvas de G. mellonella, a las cuales se les inyectaron 10 μl de la suspensión bacteriana (1 x 10⁵ UFC/ml) en la última pro-pierna, con una jeringa de insulina con aguja calibre 29G. Como controles negativos se inyectaron 10 larvas con MgSO₄ 10 mM sin bacterias y 10 más sin inocular. Las larvas, tanto inoculadas como no inoculadas se colocaron en cajas Petri estériles y se incubaron a 30 °C en obscuridad por 96 h. Se determinó el porcentaje de sobrevivencia a las 24, 48, 72 y 96 h, se registraron como muertas aquellas larvas que no respondieron al tacto²¹. Los ensayos de infección con cada bacteria se repitieron al menos dos veces de forma independiente.

Grupos filogenéticos y relación genética de E. coli asociada a mastitis bovina

De acuerdo a los resultados obtenidos de la amplificación de los fragmentos chuA (279 pb), yjaA (211 pb) y TspE4.C2 (152 pb) (Figura 1), las 34 E. coli asociadas a mastitis bovina se clasificaron en tres grupos filogenéticos. El 67.7 % (23 aislados) pertenece al grupo A, el 17.6 % corresponde al grupo B1 (6 aislado) y el restante 14.7 % (5 aislados) corresponde al D (Figura 2B).

Figura 1 Geles de agarosa de los resultados positivos y negativos representativos de la amplificación por PCR de: A) chuA (279 pb), B) yjaA (211 pb) y, C) TspE.C2 (152 pb) 

Figura 2 Gel de agarosa de la separación de los productos amplificados por (GTG)₅-PCR, se indica el tamaño en pares de bases de algunas bandas del marcador de 1 kb  

El análisis de relación genética mediante rep-PCR con el oligonucleótido (GTG)₅ arrojó 32 patrones distintos de entre 7 y 21 bandas, con tamaños que oscilaron de 250 a 5,000 pb (Figura 2). El dendrograma generado a partir de los patrones de bandas usando el coeficiente de similitud de Dice por el método de UPGMA, indica que la similitud más baja entre los aislados fue de 58 %, mientras que la mayor similitud observada fue del 100 % en dos aislados. También se puede apreciar que considerando una similitud genética del 70 % (línea punteada) se identificaron 7 grupos de bacterias, de los cuales el grupo VII fue el más grande con 22 (64.7 %) aislados, el grupo III con 4 (11.8 %), el grupo VI con 3 (8.8 %) bacterias, el grupo I con 2 (5.8 %) y los grupos II, IV y V con un solo aislado (2.9 %), respectivamente (Figura 3).

Figura 3 Agrupamiento de los patrones de bandas obtenidos en 34 E. coli asociadas a mastitis bovina, basado en el coeficiente de similitud de Dice generado mediante UPGMA  

Movilidad, formación de biopelículas y detección de genes asociados

El análisis de la movilidad de las 34 E. coli, reveló que 10 no fueron móviles (-) y 24 mostraron movilidad. De éstas últimas de acuerdo al diámetro del desplazamiento 12 se consideraron poco móviles (+), 6 con movimiento moderado (++) y 6 fueron muy móviles (+++) (Figura 4 y Cuadro 1).

Figura 4 Resultados representativos de movilidad tipo ”swarming”. A) No móvil, B) Poco móvil, C) Moderadamente  

Para la formación de biopelículas 26 aislados (76.5 %) formaron biopelículas en algún grado (D.O. >0.22) y las restantes 8 (23.5 %) no fueron formadoras (D.O. ≤0.22). Para el caso de las formadoras, siete se clasificaron como formadoras fuertes (D.O. >0.88) y moderadas (D.O. 0.45-0.88), mientras que 12 mostraron capacidad de formación débil (D.O. 0.23-0.44) (Cuadro 1). En 22 (64.7 %) de las 34 E. coli se detectó la presencia de alguno de los dos genes csgA/fimA, mientras que de las 26 formadoras en 15 se detectó uno o los dos genes. También los genes csgA y fimA se observaron en siete aislados no formadores de biopelículas.

Virulencia de E. coli en G. mellonella

Con el propósito de analizar si hay diferencias en la patogénesis de los aislados de E. coli asociadas a mastitis bovina se realizaron ensayos de infección en larvas de G. mellonella con siete aislados representativos, cinco formadores fuertes de biopelículas y dos no formadores. Como se observa en la Figura 5, las bacterias formadoras de biopelículas mataron el 100 % de las G. mellonella a las 24 h después de la infección; mientras que, con los dos aislados no formadores de biopelículas se observó una mortalidad de entre 0 y 20 % a las 24 h y de 10 y 50 % a las 96 h. Para el caso del control no se observaron decesos durante las 96 h que duró el experimento.

Figura 5 Virulencia en G. mellonella de siete aislados representativos de E. coli, los formadores de biopelículas fueron MC2, 6, 13, 19 y 35. MC41 y MC80 no fueron formadores de biopelículas. También se muestra el control negativo (C)