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Revista mexicana de ciencias pecuarias

versión On-line ISSN 2448-6698versión impresa ISSN 2007-1124

Rev. mex. de cienc. pecuarias vol.10 no.2 Mérida abr./jun. 2019

http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i2.4759 

Notas de investigación

Estudio de asociación genómica para resistencia a Cooperia punctata en bovinos cruzados en el trópico subhúmedo de México

Adriana García-Ruíza 

Felipe de Jesús Ruíz-Lópeza 

Miguel Alonso-Díazb 

Elke Von-Son-de-Fernexb 

Sara Olazarán-Jenkinsc 

Vicente Eliezer Vega-Murillod 

Maria Eugenia López-Arellanoe  * 

a Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología y Mejoramiento Animal. Ajuchitlán, Querétaro.

b Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical. Martínez de la Torre, Veracruz. México.

c Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Sitio Experimental las Margaritas, Hueytamalco, Puebla. México.

d Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Campo Experimental La Posta, Paso del Toro, Veracruz. México.

e Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud Animal e Inocuidad. Jiutepec, Morelos. México.

Resumen:

El objetivo del presente estudio fue evaluar la resistencia a la infección natural por Cooperia spp. en bovinos jóvenes cruzados Cebú x Holstein, en trópico. Catorce (14) becerros de cuatro meses de edad fueron tratados con desparasitante y trasladados a potreros naturalmente contaminados con nematodos gastrointestinales bajo condiciones de trópico sub-húmedo. Muestras de heces se colectaron cada siete días durante tres meses por individuo, para cuantificar el número de huevos por gramo de heces (HPG) e identificar el género por PCR de punto final. Se colectaron muestras de pelo para llevar a cabo estudios de asociación genómica utilizando la plataforma GeneSeek Genomic Profiler HD-V3 que contiene139,376 marcadores SNP. Los resultados obtenidos indican variación en el número de HPG por individuo (mínimo 7+7 y máximo 4657+1886 HPG). En los análisis de componentes principales se identificaron diferencias raciales entre los animales con genes de las razas Cebú y Holstein. Los estudios de asociación del genoma completo detectaron 5 haplotipos estadísticamente significativos (P<0.001). El haplotipo del cromosoma 2 incluye cuatro marcadores, el 10 incluye a tres, el 15 incluye a dos, el 23 cuatro y el del cromosoma X incluye tres. De estas regiones sólo el cromosoma 23 se encontró asociado a resistencia por parásitos, medidos como fenotipo de HPG; los cromosomas restantes identificados no mostraron asociación en ninguno de los individuos en estudio. Se considera que estas regiones podrían ser secuenciadas y probar la expresión de genes para la resistencia contra este nematodo y de otros nematodos del complejo gastrointestinal.

Palabras clave: Marcadores SNP; Asociación genómica; Cooperia spp.; Bovinos; Cruzamientos

La infección por nematodos gastrointestinales (GI) en bovinos jóvenes es uno de los principales problemas de salud que afecta a la ganadería bajo condiciones de pastoreo en clima tropical1. Cooperia es un parásito GI que tiene un efecto negativo en el crecimiento y la productividad de bovinos, debido a que afecta la función del intestino delgado2. Se han estudiado diversos mecanismos para combatir la infección por Cooperia, tanto a nivel de fármacos como a nivel de resistencia genética3. Con la disponibilidad de paneles densos de marcadores de ADN de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), ha sido posible realizar el mapeo de loci de características de interés económico y de esta manera incrementar la presencia de genes deseables en la población. Los haplotipos son regiones del genoma (que comprenden entre 100 y 150 pares de bases) que son heredados de manera conjunta en una población específica y pueden tener efecto significativo sobre los genes que estén localizados dentro de una región del cromosoma4. Los estudios de asociación en el genoma completo (GWAS) son una herramienta que nos permite identificar estas regiones en el material genético. Recientemente, se han identificado regiones del genoma que indican resistencia a enfermedades y parasitosis5.

El objetivo del presente trabajo fue identificar regiones del genoma asociadas a carga parasitaria (número de huevos por gramo de excremento) de Cooperia en ganado bovino cruzado (Cebú x Holstein y viceversa) que se encuentran en pastoreo en una región del trópico en México.

El estudio se llevó a cabo en el Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical (CEIEGT), de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, de la Universidad Nacional Autónoma de México, localizado en el municipio de Tlapacoyan, Veracruz, a 112 msnm. El clima es cálido húmedo, con lluvias todo el año, sin estación seca definida (Af(m) w”(e)6, con temperatura promedio de 23.5 ± 0.5 °C y 1,991 mm ± 392 mm de precipitación media anual y la prevalencia de nematodos GI es mayor al 75 % durante todo el año7. En el proyecto se incluyeron 14 animales cruzados (– Cebú x ¼ Holstein (n= 6) y ¼ Cebú x – Holstein (n= 8) de cuatro meses de edad que se encontraban en pastoreo y que previo a su destete, tanto las crías como las madres, se trataron con Levamisol a dosis de 7.5 mg por vía intramuscular para eliminar posibles contaminaciones con nematodos GI.

Todos los animales se infectaron naturalmente con larvas infectantes (L3) de Cooperia punctata (confirmado por PCR de punto final) como género dominante por vía oral, y posterior a la infección se realizaron monitoreos semanales por tres meses del número de huevos por gramo de excremento (HPG). El primer registro de HPG se realizó a los 21 días después de iniciada la infección de los animales en pastoreo y los posteriores se realizaron cada siete días por tres meses. El número de HPG se determinó con la técnica de McMaster. Las muestras se colectaron directamente del recto para evitar contaminación y se procesaron inmediatamente. Se obtuvo el promedio de HPG durante los muestreos, y los resultados se incluyeron en un estudio de casos y controles, considerando como casos a los animales que presentaron más de 200 HPG8,9. La clasificación que se observa en el Cuadro 1, indica el nivel de infección por el número de HPG de nematodos parásitos. Así mismo, se tomaron muestras de sangre para determinar el porcentaje de volumen celular aglomerado (VCA), tomando como base 24% como la medición de un individuo no anémico9. Así mismo, se determinó el VCA con un porcentaje mínimo de 22 + 1.6 y máximo de 28 + 3.3. Es importante señalar, que el género Cooperia presenta hábitos de histiofagia y no afecta directamente el porcentaje del VCA. Además, este género fue predominante durante los tres meses de estudio. La disminución del VCA se relacionó al estado nutricional de los animales, por ello, se identificaron seis individuos como resilientes.

Cuadro 1: Selección de becerros resistentes, susceptibles y resilientes a Cooperia punctata con base en el número de huevos por gramo (HPG) y el porcentaje de volumen celular aglomerado (VCA) 

ID  HPG
Media ± EE
VCA (%)
Media ± EE
C
62 7 ± 7 24 ± 2.2 RR
58 164 ± 89 24 ± 1.1 RR
61 200 ± 107 26 ± 2.2 RR
57 178 ± 154 23 ± 2.8 RR
55 86 ± 291 22 ± 0.7 Rs
56 650 ± 291 28 ± 1.7 Rs
51 557 ± 291 24 ± 3.3 Rs
67 607 ± 165 22 ± 1.5 Rs
65 764 ± 283 23 ± 1.5 Rs
63 1193 ± 636 25 ± 3.3 Rs
59 1221 ± 558 25 ± 0.8 SS
53 1378 ± 291 26 ± 2.7 SS
54 3100 ± 291 22 ± 2.3 SS
64 4657 ± 1886 23 ± 2.1 SS
X ± EE 1055 ± 1155 24 ± 2.0

ID= identificación por individuo; EE= error estándar C= clasificación de fenotipo por individuo; RR= resistente; Rs= resiliente; SS= susceptible.

A todos los animales se les tomó una muestra de pelo que incluyó el folículo piloso a partir de la cual se obtuvo su ADN. Posteriormente, se genotiparon con la plataforma GeneSeek Genomic Profiler HD-V3 que contiene139,376 SNP. Se realizó el análisis de control de calidad de los genotipos, eliminando los marcadores que presentaran una tasa de llamado un call rate <0.90, una frecuencia del alelo menor a 0.05 y aquellos que tuvieran un valor de P<0.001 para el equilibrio de Hardy Weinberg. Después del control de calidad, se incluyeron 120,405 SNP en la determinación de 3,054 haplotipos. Para corregir el efecto de origen racial, se realizaron los análisis de componentes principales (PCA) y se incluyeron como factor de ajuste en los análisis de asociación. Los GWAS se realizaron con un modelo de regresión logística, corrigiendo por la prueba de Bonferroni y por la tasa de falsos descubrimientos. Todos los análisis genómicos se realizaron con el software SVS-Golden Helix v-8.610.

La identificación molecular de los géneros de nematodos GI mostró a Cooperia como el género dominante de la región, no encontrándose otros especímenes durante los tres meses de seguimiento. Respecto al nivel de infección observado por individuo, el Cuadro 1 muestra la media y el error estándar por individuo obtenido durante los tres meses de estudio. El valor mínimo fue de 7 ± 7 y el máximo de 4,657 ± 1,886. En los PCA, se pudieron identificar las diferencias de composición racial de los animales incluidos en el estudio (Figura 1), observándose a la izquierda los animales que poseían mayor cantidad de genes de la raza Cebú y a la derecha los que poseían mayor composición Holstein.

Figura 1: Análisis de componentes principales de los animales incluidos en el estudio y su agrupación por composición racial 

A pesar de que para algunos caracteres o enfermedades existe una predisposición genética a razas, cruzas o poblaciones específicas11, en este estudio no se encontraron tendencias de casos y controles por cruzamiento asociados a la presencia de Cooperia (Figura 2).

Figura 2: Distribución de casos y controles a Cooperia de los animales incluidos en el estudio 

En los GWAS se detectaron 5 haplotipos estadísticamente significativos (P≤0.001; Figura 3). El haplotipo del cromosoma 2 incluye cuatro marcadores (BTA-55603-no-rs, BovineHD4100001149, BovineHD0200010866, BovineHD0200010867), el del 10 incluye a tres (BovineHD1000009272, ARS-BFGL-NGS-44351, BovineHD10000 30584), el del 15 incluye a dos (ARS-BFGL-NGS-18481, ARS-BFGL-NGS-103542), el del 23 incluye cuatro (BovineHD2300011368, BovineHD2300011369, BovineHD2300011370, BovineHD2300011371) y el del cromosoma X incluye tres (BovineHD3000031659, BovineHD3000031667, BovineHD3000031676).

Figura 3: Gráfica tipo Manhattan de análisis de asociación con haplotipos encontrados en el estudio de casos y controles de Cooperia. El cromosoma X se encuentra denotado como cromosoma 30 

Debido a que los estudios de asociación genómica a resistencia a enfermedades han sido muy limitados, no se tienen muchas anotaciones en el genoma para tomar como referencia. De las regiones significativas que se encontraron en el presente estudio para los cromosomas 2, 10, 15 y X, no se identificaron genes que pudieran estar relacionados con las regiones encontradas (resultados verificados en la base de datos de NCBI)12. Solo la región que resultó significativa en el cromosoma 23, está asociada con la tasa de infección parasitaria al protozoario Tripanosoma en ganado N'Dama y Boran en África Occidental13. Debido a que la mayoría de las regiones encontradas no se encuentran asociadas a características de HPG y en específico de Cooperia, se considera que estas regiones pueden ser candidatas para secuenciar y probar la existencia de genes para la resistencia contra este nematodo y de otros del complejo gastrointestinal.

En conclusión, a pesar del bajo número de bovinos jóvenes utilizados en el presente estudio, los resultados encontrados sugieren la existencia de SNP asociados con la resistencia a nematodos, principalmente en el cromosoma 23. Sin embargo, se requiere mayor información para definir dicha relación. El estudio de la interacción hospedero/parásito implica mayor conocimiento en la diversidad de mecanismos inmunes de evasión, y detoxificación antihelmíntica en las nematodosis. La contribución en el conocimiento de factores asociados al genoma del hospedero y a los procesos de infección por C. punctata implica determinar mecanismos que podrían indicar en un futuro el uso de marcadores asociados a las nematodosis bajo condiciones de pastoreo en trópico.

Agradecimientos

El presente proyecto fue financiado por el Proyecto Fiscal INIFAP número 16573433030. Se agradece todo el apoyo otorgado por el CEIEGT, FMVZ-UNAM.

Literatura citada:

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Recibido: 30 de Enero de 2018; Aprobado: 08 de Mayo de 2018

*Autor de correspondencia: mlopez.arellano@gmail.com

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