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Introducción
La mastitis bovina es una inflamación de uno o varios cuartos mamarios que se debe con mayor frecuencia a una infección intramamaria (IIM)1. La severidad de la inflamación se puede clasificar como subclínica o clínica. La mastitis subclínica es difícil de detectar debido a la ausencia de cualquier signo visible, pero tiene un alto impacto económico2. El costo de esta enfermedad se ha estimado hasta en 320 dólares por vaca por lactación, siendo aproximadamente el 70 % de estas pérdidas por la reducción en la producción de leche3. Un método eficaz en campo para detectar mastitis subclínica en un establo es la prueba de California para mastitis (CMT) basada en la cantidad de células somáticas presentes en la leche4.
Se han identificado más de 135 especies de bacterias causantes de mastitis5, las cuales se clasifican como microorganismos contagiosos y ambientales de acuerdo a su reservorio primario y al modo de transmisión6. Los patógenos contagiosos incluyen Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Mycoplasma spp., Corynebacterium bovis y Staphylococcus coagulasa negativos (SCN)7. Los patógenos contagiosos sobreviven en la ubre de la vaca, donde la leche es la principal fuente de infección primaria para las vacas sanas, y ocurre durante la ordeña8. Los patógenos ambientales se encuentran comúnmente en los corrales y bebederos e incluyen especies como Escherichia coli, Klebsiella spp. y Streptococcus spp., entre otras. La combinación de alta humedad y materia fecal incrementa el riesgo de exposición de la ubre a patógenos ambientales1. Al identificar la especie que está provocando esta condición, se puede deducir y reducir la fuente de infección, diseñar programas de prevención y control, y orientar una estrategia terapéutica. Por otra parte, la leche y los productos lácteos elaborados con leche proveniente de vacas con mastitis, pueden provocar enfermedades en los seres humanos que los consumen9; de hecho, algunas especies bacterianas aisladas de vacas con mastitis se consideran zoonóticas, tales como S. aureus, Streptococcus spp., E. coli, Leptospira spp., Mycobacterium bovis, Trueperella pyogenes, Campylobacter jejuni, Yersinia pseudotuberculosis10 y Pasteurella multocida11.
En Baja California (BC) existe una población de 43,300 bovinos de leche con una producción de 158 millones de litros anuales, en tanto en Baja California Sur (BCS) existen 14,200 bovinos de leche con una producción de 42 millones de litros anuales12; sin embargo, no se han realizado investigaciones documentadas sobre los agentes que provocan mastitis bovina, a pesar de su importancia nacional en la producción de leche y el hecho de que la prevalencia de mastitis es relativamente alta13. Considerando todo lo anterior, en el presente trabajo se identificaron las especies bacterianas aisladas de vacas en producción con mastitis, mediante técnicas moleculares, y se determinó su frecuencia relativa en siete establos lecheros participantes, ubicados en las principales zonas productoras de la Península de Baja California, México.
Material y Métodos
Ubicación del estudio
Se muestrearon siete establos lecheros tecnificados representativos de las principales regiones productoras de leche; cuatro del estado de Baja California y tres del estado de BCS (Figura 1), los cuales se identificaron con la letra A hasta la letra G (A-D, Baja California; E-G, Baja California Sur), con un total de 1,302 vacas en lactación (Cuadro 1).
*Los círculos con contorno en puntos indican las principales cuencas lecheras de la península, los círculos con contorno contínuo representan los establos muestreados.
Figura 1 Distribución de los establos muestreados en la zona de estudio
Cuadro 1 Identificación de establos, número de animales en lactación y su procedencia
| Establo | Vacas en producción | Municipio | Estado |
|---|---|---|---|
| A | 46 | Mexicali | Baja California |
| B | 600 | Mexicali | Baja California |
| C | 371 | Ensenada | Baja California |
| D | 218 | Tecate | Baja California |
| E | 24 | Comondú | Baja California Sur |
| F | 10 | Comondú | Baja California Sur |
| G | 33 | La Paz | Baja California Sur |
Criterio de inclusión y recolección de muestras
Se tomaron muestras de leche siguiendo la metodología del Consejo Nacional de Mastitis de los Estados Unidos14 de los cuartos afectados de todas las vacas en producción que tuvieron grado 2 o mayor a la prueba de California (CMT) utilizando el reactivo Mastitest® (México).
Cuestionario sobre prácticas de ordeña
Se recabó información relevante de cada establo mediante la aplicación de un cuestionario, con énfasis en el protocolo de ordeña que incluyó: uso de guantes, cambio de toallas de papel o tela por cuarto, pre-sello, post-sello y secuencia de ordeña.
Análisis bacteriológico
Se cultivó 0.1 ml de cada muestra de leche en cajas de Petri agar Columbia con sangre de bovino al 5% y se incubó a 35 °C por 24 a 48 h1. La muestra con al menos 10 UFC (unidades formadoras de colonia) con una misma morfología se consideró cultivo positivo a IIM15, la muestra con distintas especies bacterianas con al menos 10 UFC cada una, se consideró IIM mixta, y la muestra que tuviera menos de 10 UFC se consideró cultivo negativo1. Para determinar diferencias entre los aislados se consideró morfología colonial, tipo de hemólisis, tinción Gram y prueba de catalasa16. Finalmente, los aislados obtenidos se cultivaron en 5 ml de caldo Todd Hewitt e incubados a 35 °C por 12 h a 200 rpm, y se hicieron tres alícuotas de 1 ml con glicerol al 10% para su almacenamiento a -80 °C y posterior identificación molecular.
Análisis estadístico
De acuerdo a los datos obtenidos, se utilizó el software Statistix 9®, incluyendo la estimación de Ji cuadrada de Pearson para establecer la asociación entre las proporciones de muestras de leche que tuvieron cultivo positivo entre los dos estados y entre establos, además, se calculó la magnitud de asociación (odds ratio, OR) con un intervalo de confianza de 95% estableciendo un valor de P<0.05 para indicar significancia estadística.
Extracción de ADN
Se extrajo ADN utilizando el juego de reactivos DNeasy Blood & Tissue (Qiagen®, USA). Se realizó la extracción como recomienda el proveedor, adicionando 5 µl de lisostafina de S. staphylolyticus 1 mg/ml para lisar bacterias del género Staphylococcus y 10 µl de mutanolisina de Streptomyces globisporus ATCC 21553 a 1,000 U/ml para lisar bacterias del género Streptococcus. Una vez obtenido el ADN se revisó su integridad por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se cuantificó por espectrofotometría A260nm/A280nm (Genesys 10uv Thermo Spectronic, MA USA) y se almacenó a -20 °C.
Identificación molecular
Se realizó PCR a los aislados obtenidos siguiendo dos metodologías; en la primera se identificaron S. aureus, S. agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus parauberis y Streptococcus uberis, mediante la técnica de PCR punto final y en la segunda se identificaron E. coli, y cinco SCN: S. chromogenes, S. haemolyticus, S. epidermidis, S. sciuri y S. simulans, mediante la técnica de PCR Multiplex también en tiempo final. En ambos casos, se utilizaron protocolos previamente publicados por otros autores y sin modificaciones17,18. Por último, los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa 1.5% en buffer TAE 1X (Ph 8.0; 0.04 M Tris-acetato, 0.001 M EDTA), teñidos con 0.5 μg de bromuro de etidio/ml y corridos a 120 V por 1 h. Se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pb (Promega, EUA.) y el gel se visualizó y fotografió en un sistema de fotodocumentación (UVP, ALE.).
A los aislados que no pudieron identificarse por las pruebas de PCR mencionadas, se les realizó PCR punto final del gen ribosomal 16S, de acuerdo a Negoro et al19 y se mandaron a secuenciar utilizando esos mismos oligonucleótidos mediante el método de secuenciación de ciclo (terminación de cadena dideoxi/secuenciación de ciclo), en un equipo ABI 3730XL (Quimera, Biolabs, México). Las secuencias obtenidas se introdujeron en la base de datos online GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) en el programa BLAST® para compararlas con las secuencias depositadas y determinar la especie, el criterio fue que la secuencia tuviera un mínimo de 98.5 % de identidad en comparación con la secuencia tipo o cepa de referencia, como ya fue descrito20.
Resultados
Se colectaron 316 muestras de leche de 186 vacas con mastitis subclínica. Se aislaron bacterias en el 51.5 % (163/316) de las muestras, correspondientes a 106 animales (Cuadro 2). Se determinó que existe una diferencia estadísticamente significativa entre las proporciones de las muestras de leche que tuvieron cultivo positivo en Baja California (130/270) y BCS. (33/46), presentándose 2.7 veces más probabilidad de que una muestra tomada en BCS tenga cultivo positivo, que una muestra tomada de establos en Baja California (P=0.003, IC 95%, 1.3-5.4). A nivel establo, el establo G, tiene 20 veces más probabilidad de que una muestra de leche tenga cultivo positivo con respecto al tomado como referencia.
Cuadro 2 Frecuencia y magnitud de asociación (OR) entre las muestras que presentaron aislamiento, tomando como referencia el establo con menor proporción de aislamientos
| Establo | Muestras CMT+ (n) |
Muestras con aislamiento |
Muestras sin aislamiento |
OR | 95% IC | P |
|---|---|---|---|---|---|---|
| A | 27 | 13 | 14 | 2.8 | 1.1-6.7 | 0.02 |
| B | 46 | 23 | 23 | 3.0 | 1.4-6.2 | 0.002 |
| C | 104 | 26 | 78 | Referencia | ||
| D | 93 | 68 | 25 | 8.2 | 4.3-15.4 | 0 |
| E | 6 | 2 | 4 | 1.5 | 0.2-8.67 | 1 |
| F | 17 | 11 | 6 | 5.5 | 1.8-16.3 | 0.001 |
| G | 23 | 20 | 3 | 20 | 5.5-72.8 | 0 |
| Total | 316 | 163 (51.5%) | 153 (48.5%) |
CMT= prueba de California para mastitis.
Durante el proceso de ordeña, ninguno de los establos cumplía completamente con buenas prácticas de ordeña para evitar infecciones intramamarias; sin embargo, por lo menos cumplían con alguna de ellas. Así, se observó, que por ejemplo el establo D, cumplía con la mayoría de las buenas prácticas analizadas en el estudio, sin embargo la proporción de aislados por muestra positiva a mastitis fue alta. En el establo C, se observó una baja proporción de aislados, aún a pesar que no llevaban a cabo todas las buenas prácticas durante la ordeña; aunque se llevaba una secuencia al ordeñar, dejando a las vacas enfermas a lo último, lo que sugiere que el ordeñar las vacas con mastitis al final, puede ser un factor importante para evitar la diseminación de la enfermedad. Los establos E, F y G, llevaban a cabo pocas actividades para evitar la diseminación de la mastitis, observándose en los establos F y G una alta proporción de aislamientos (Cuadro 3).
Cuadro 3 Protocolo de ordeña por establo
| Actividad | A | B | C | D | E | F | G |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Uso de guantes | + | - | + | + | - | - | - |
| Cambio de toallas de papel o tela | - | + | - | + | - | - | - |
| Pre-sello | + | - | - | + | + | + | - |
| Post-sello | + | + | + | + | - | - | - |
| Secuencia de ordeña | - | - | + | - | - | - | + |
Las especies aisladas más frecuentes fueron: S. aureus 59 % (107/182), S. agalactiae 13 % (24/182), S. chromogenes 9 % (16/182), E. coli 2 % y S. uberis 2 % (4/182) (Cuadro 4).
Cuadro 4 Especies identificadas y su frecuencia relativa
| Especies | Numero de aislados (%) |
|---|---|
| S. aureus* | 107 (58.8) |
| S. agalactiae* | 24 (13.2) |
| S. chromogenes* | 16 (8.8) |
| E. coli | 4 (2.2) |
| S. uberis | 4 (2.2) |
| S. saprophyticus* | 3 (1.6) |
| S. dysgalactiae | 3 (1.6) |
| Streptococcus suis | 3 (1.6) |
| P. multocida | 3 (1.6) |
| Klebsiella pneumoniae | 3 (1.6) |
| Proteus vulgaris | 2 (1.1) |
| Bacillus cereus | 2 (1.1) |
| S. agnetis* | 1 (0.5) |
| Pseudomonas aeruginosa | 1 (0.5) |
| Enterobacter hormaechei | 1 (0.5) |
| Klebsiella oxytoca | 1 (0.5) |
| Proteus mirabilis | 1 (0.5) |
| Enterococcus faecium | 1 (0.5) |
| Bacillus licheniformis | 1 (0.5) |
| Bacillus altitudinis | 1 (0.5) |
| Total de aislados | 182 (100) |
*Especies contagiosas
El 83 % de los aislados (151/182) fueron clasificados como especies contagiosas, en tanto el resto fueron especies ambientales (Cuadro 5). De la misma manera, el 91.2 % de los aislados fueron bacterias Gram positivas y el resto Gram negativas.
Del total de cuartos con cultivo positivo, el 6.1 % (10/163) presentaron una infección mixta. Las combinaciones más frecuentes fueron S. aureus con S. agalactiae (30 %) y S. aureus con S. chromogenes (20 %). El 70 % de las infecciones mixtas fueron provocadas por combinaciones entre agentes contagiosos.
Discusión
En el presente trabajo se obtuvo cultivo positivo en el 51.5 % de las muestras, en tanto, en un estudio realizado en Egipto5, se obtuvieron aislados en el 96 % de sus muestras; la discrepancia en estos datos, además de las condiciones medioambientales, se puede deber a que en el trabajo mencionado se pre-incubaron las muestras hasta por 24 h a 37 ºC y no se utilizó un criterio para considerar un cultivo positivo, lo que pudo predisponer al elevado porcentaje de aislamiento que tuvieron por muestra. Una razón por la cual en el presente estudio solo se obtuvo aislamiento bacteriológico en el 51.5 % de las muestras, pudo ser que en los casos de cultivos negativos, la mastitis fue provocada por microorganismos no cultivables mediante los métodos de rutina aquí utilizados (p. ej. Mycoplasma spp, Mycobacterium bovis, Leptospira spp. y Brucella spp.), o debido a causas no infecciosas, tales como traumatismo, altas temperaturas o estrés en los animales.
En los establos muestreados en Baja California Sur se encontró que existe más riesgo de que una muestra positiva a CMT tenga cultivo positivo con respecto a los establos muestreados en Baja California, lo cual se puede deber a las medidas deficientes en el protocolo de ordeña en dichos establos, o a una mayor frecuencia de bacterias no cultivables en los establos muestreados en el estado de Baja California.
Todas las especies identificadas en el presente estudio, excepto S. suis y Enterobacter hormaechei, se han aislado de casos de mastitis en investigaciones realizadas en otras partes del mundo y, en algunos casos los resultados han sido muy similares; así por ejemplo en un estudio realizado en Suecia en establos pequeños y tecnificados21, del 31 % de los cuartos se aisló S. aureus, seguido por SCN con 27 %, S. dysgalactiae 15 %, S. uberis 14 % y E. coli 4.8 %. En otro estudio5, los cuatro agentes principales fueron los mismos, sólo que E. coli fue el agente más frecuente con 25.5 %, seguido de S. aureus con 14.8 % y SCN y S. agalactiae, ambos con 12.7 %; el 15 % de las muestras provenían de vacas con mastitis clínica donde generalmente las bacterias coliformes son las principales causales. En un estudio realizado en establos familiares de Guanajuato, México22, también se identificaron especies bacterianas aisladas de mastitis mediante secuenciación del gen 16S rDNA, de 11 muestras de leche, de ellas, cinco muestras presentaron SCN, dos muestras presentaron Streptococcus spp. y una S. aureus, mostrando resultados muy similares a los del presente trabajo.
En los establos muestreados en Baja California Sur, se encontró que no post-sellaban, lo que pudo favorecer una alta incidencia de agentes ambientales con respecto a los establos muestreados en Baja California, lo cual concuerda con lo encontrado en un estudio realizado en Guerrero, México23, en donde el 97.5 % de los aislados fueron Enterobacterias, presentando los establos malas condiciones de higiene tanto en los corrales como en el protocolo de ordeña, ya que no pre-sellaban, post-sellaban, ni secaban pezones.
En el establo D, fue muy alta la proporción de S. aureus, aun llevando buenas prácticas de ordeña; sin embargo, no contaban con un protocolo en el que se contemplara primero ordeñar a las vacas sanas y después a las enfermas, lo que pudo provocar la diseminación de la enfermedad por el equipo o material utilizados. El establo A, de donde se aisló S. suis en dos animales, se encuentra ubicado a 30 m de un área de producción porcina, lo que sugiere que algún trabajador o material pudo haber actuado como diseminador. Al igual que S. suis, las demás especies que pueden provocar enfermedades en humanos transmitidas por ingestión de leche contaminada24,25,26 que se aislaron en este estudio fueron: S. aureus, S. agalactiae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa, Klebsiella spp, P. mirabilis y Enterobacter hormaechei.
En el presente estudio se observó una baja frecuencia de infecciones mixtas (6.1 %), siendo S. aureus con S. agalactiae la más común (30 %). En un estudio similar5, se observaron infecciones mixtas en un 35.8 % de los cuartos con aislamiento, donde la combinación más común fue S. aureus con E. coli (18 %). En ambos estudios las dos especies aisladas más frecuentes, presentaron la mayoría de las combinaciones implicadas en las infecciones mixtas.
Conclusiones e implicaciones
El presente trabajo es el primer reporte en Baja California, en el cual se hayan aislado e identificado, agentes etiológicos por medio de técnicas moleculares a partir de muestras de leche de vacas con mastitis, lo cual permitió la identificación de 20 especies bacterianas, 12 de las cuales no habían sido reportadas en México. Nueve de las especies identificadas son consideradas zoonóticas, lo cual representa un riesgo para el personal que está en contacto directo con los animales o que consume leche y subproductos no pasteurizados en la región. En general, las prácticas durante la ordeña fueron deficientes en los establos participantes, lo cual se vio reflejado en una alta diversidad y proporción de casos de mastitis debidas a agentes contagiosos, por lo que es importante su implementación y la identificación de agentes etiológicos, para llevar a cabo las medidas de control y prevención acordes al tipo de agente presente en cada caso, y así disminuir la incidencia de esta enfermedad.
