Área de estudio

Se consideraron suelos y plantas de áreas que son irrigadas con aguas residuales procedentes de la industria, retornos agrícolas y de los hogares, así como la leche de las vacas que consumen dichos forrajes. Por ello se muestrearon cuatro zonas (Figura 1); la zona 1 correspondió al municipio de Tepetitla de Lardizábal, la zona 2 a Nativitas (en ambas se aprovecha el río Atoyac), la zona 3 en Santa Isabel Tetlatlahuca irrigada por el río Zahuapan; estas tres zonas pertenecen al estado de Tlaxcala y la zona 4 en Tecamachalco, Puebla, donde se riega con aguas de la presa Manuel Ávila Camacho (canal de Valsequillo).

Figura 1 Localización de los sitios de muestreo de suelo, alfalfa y leche en las áreas irrigadas con aguas residuales en el estado de Puebla y Tlaxcala, México 

En las zonas de muestreo prevalece un clima templado húmedo con lluvias en verano, donde las principales actividades agropecuarias son la siembra de maíz y alfalfa, asociados a la producción de bovinos lecheros. Se localiza en la porción central del estado de Tlaxcala entre los paralelos 19°06’ y 19°40’ N y 97°58’ y 98°03 O; cubre total o parcialmente 50 de los 60 municipios, representando el 52 % de la superficie total del estado. Por otra parte, Tecamachalco, Puebla que se ubica en los paralelos 18° 52´ 57" N y a 97° 43´ 49" O^14,15.

Muestreo de suelo, alfalfa y leche

El muestreo se realizó en dos épocas del año, comprendidas en julio 2014 (verano) y marzo de 2015 (primavera). Las muestras de suelo se recolectaron en cuatro zonas definidas por la fuente del agua de riego, formando un total de 16 sitios, correspondientes a cuatro muestras por zona (Figura 1). Las muestras se tomaron de la capa superficial del suelo (0 a 30 cm) debido a que los metales en los suelos cultivados se encuentran distribuidos de manera homogénea a este nivel, como consecuencia de la aplicación de abonos, fertilizantes y el contenido de materia orgánica del suelo¹⁶. Se colectaron 10 sub muestras en cada sitio, las cuales se mezclaron para formar una muestra compuesta de cada sitio. Estas se colocaron en bolsas de polietileno negro, que se cerraron evitando la presencia de aire, y llevadas al laboratorio, donde se secaron en bandeja de papel, alcanzando una profundidad máxima de 2.5 cm, una temperatura no superior a 35 °C y una humedad relativa entre 30 y 70 % a la sombra durante ocho días, con el fin de hacer un mejor manejo y homogeneización de las muestras. Se removieron las rocas y material orgánico, luego las muestras se trituraron utilizando un mazo de madera, y se realizó el tamizado en un tamiz de nylon de <2 mm de diámetro, y se conservaron en bolsas de nylon perfectamente cerradas hasta su digestión de acuerdo con la norma NOM-021-SEMARNAT-2000¹⁷.

La alfalfa utilizada se colectó por triplicado al inicio de la floración, de los mismos sitios de donde se extrajo el suelo, a una profundidad de 0 a 30 cm¹⁸ y se trasportaron en bolsas oscuras al laboratorio, donde se les lavó con agua desionizada hasta eliminar todo tipo de residuos de suelo, al mismo tiempo que fueron pesadas en su totalidad y por partes, siendo separadas en parte comestible (hoja-tallo) y raíz^19,20, congelándolas para luego ser liofilizadas. Posterior a ello se molieron, tamizaron y almacenaron en bolsas de nylon hasta su digestión.

La leche se colectó de 160 vacas, correspondiendo a 40 vacas de cuatro hatos diferentes por zona, todas alimentadas con alfalfa cultivada en los suelos muestreados. Para ello se utilizaron tubos Falcón de 50 ml, previamente lavados con HNO₃ al 10% v/v y fueron enjuagados por tres veces con agua desionizada para eliminar los residuos ácidos y evitar alteraciones en la leche. El muestreo se realizó una sola vez por la mañana al inicio del ordeño, directamente de la ubre, transportándolas en neveras al laboratorio, donde se congelaron a -65 ºC y posteriormente liofilizadas. Para la liofilización de la alfalfa y leche se utilizó un equipo de liofilización LABCONCO Freezone de 4,5 litros (Kansas City, Missouri).

Determinación de metales pesados

Todas las muestras de suelo, planta y leche fueron previamente digeridas en un horno de microondas (CEM-MarsX, CEM corporation Mathews, Notrh Carolina). Para el suelo, se realizó una digestión bajo el protocolo EPA 3051, pesando 0.5 g de suelo y se añadieron 10 ml de ácido nítrico (HNO₃), se utilizó una potencia de 1,600 W, con una rampa de 5 min, presión de 350 psi, temperatura de 175 ºC y un intervalo de 5 min.

Para la alfalfa se utilizó la parte comestible y la raíz, de cada uno, y por separado se pesaron 0.3 g y se agregaron 5 ml de HNO₃ más 5 ml de peróxido de hidrógeno al 30% w/v a 1,600 W de potencia, con un tiempo de rampa de 15 min, presión de 800 psi, 200 ⁰C de temperatura y 10 min de espera. La digestión de la leche liofilizada se realizó utilizando 0.5 g, a la cual se le agregaron 10 ml de HNO_3, colocándola a una potencia de 1,600 W, rampa de 5 min, presión de 350 psi, temperatura de 175 ºC y un intervalo de 5 min. Una vez digeridas cada una de las muestras se filtraron sobre papel Whatman grado 42, se aforaron a 50 ml con agua desionizada y se refrigeraron hasta su análisis. El ácido nítrico utilizado para cada digestión fue HNO₃ High purity (65%, Suprapur, Merck, Darmstadt, Germany).

Los metales pesados Cd, Pb, Ni, Cu, Cr, Zn y As se determinaron por medio de espectroscopia de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP - OES, Varian 730 - ES). Todos los productos químicos utilizados fueron de grado reactivo analítico. Se prepararon las soluciones en agua desionizada 18.2 MΩ cm. Los estándares de calibración para cada metal se prepararon utilizando solución patrón ICP multielemento standard XVI, compuesta de 21 elementos en HNO₃ Suprapuro 6%, con densidad de 1.032 g/cm³ y 20 °C de Merck KGaA, Frankfurter Str. 250, 64293 Darmstadt, Germany.

Los niveles de precisión y exactitud se realizaron con cinco blancos y diez repeticiones. El valor de recuperación analítica se determinó en 106 % en promedio, el coeficiente de correlación (r²) fue 0.9999 para todos los metales. Los límites de detección y los límites de cuantificación (LOD - LOQ) se calcularon con 3 y 10 veces la desviación estándar del blanco.

Factor de bioconcentración (BCF) y factor de translocación (TF)

Con los valores de suelo y planta se realizaron los cálculos para determinar el factor de bioconcentración (BCF), que indica la capacidad o eficiencia que poseen las plantas para acumular metales pesados en la raíz con relación a la concentración de metales existente en el suelo o sustrato, calculándose en base a peso seco^21,22; y el factor de translocación (TF) que indica la absorción de metales pesados que ejercen las plantas a los diferentes órganos vegetativos con respecto a la raíz^23,24,25. Ambos factores se calcularon siguiendo las siguientes ecuaciones, las cuales han sido utilizadas por varios autores^26-29:

Donde BCF es el factor de bioconcentración, TF es el factor de translocación y C es la concentración del metal (suelo, raíz y parte aérea o comestible).

Análisis estadístico

La información obtenida de cada componente se analizó bajo un diseño completamente al azar con arreglo factorial, en el que los factores fueron: la estación del año y las zonas, utilizando un modelo lineal generalizado (GLM), y para la comparación de medias se efectuó la prueba de Tukey con el paquete estadístico SAS Ver. 9³⁰.

Con los valores obtenidos del contenido de metales en la alfalfa y la leche se determinó el valor de biotransferencia de metales de la planta hacia los animales, utilizando la ecuación propuesta por Stevens³¹; BTF (kg día ⁻¹ ) = Concentración del metal en leche (mg kg ⁻¹ ) / Consumo promedio diario del metal (mg día ⁻¹ ); y para ello se consideró que son vacas de la raza Holstein, con un peso promedio de 600 ± 34 kg y que tienen una ingesta de 10 kg de alfalfa al día en base seca.

Suelo

Por zonas, el suelo agrícola mostró diferencias significativas (P<0.01), para Ni y Cr, siendo la zona 4 la que tuvo los valores más bajos (Cuadro 1). En cuanto a la época del año, no existió diferencia significativa en el contenido de metales en el suelo. Siebe³² en un trabajo realizado en suelos del estado de Hidalgo, irrigados con aguas residuales procedentes de la ciudad de México, reportó niveles de 24, 20, 52 y 77 mg kg^-1 de Pb, Cu, Cr y Zn respectivamente, los cuales son superiores a los encontrados en este trabajo y para Cd 0.57 mg kg^-1 siendo un nivel más bajo que el detectado en esta investigación. Sin embargo, los suelos analizados por Siebe³² estuvieron irrigados por más de 80 años, a diferencia de los de este trabajo que tienen 40 años de irrigación con las aguas residuales de procedencia industrial.

Alfalfa

El contenido de metales en la parte comestible (hoja - tallo) (Cuadro 2) no evidenció diferencia significativa entre zonas. Sin embargo, por época del año el Pb, Ni y Zn fueron diferentes (P<0.01) mostrando valores más altos en el verano, caso contrario para el Cr que tuvo nivel más alto en primavera.

En otras regiones de México, Vázquez-Alarcón et al³³ reportaron un contenido de Cd de 0.7 a 2.7 mg kg^-1 en alfalfa, superior a lo encontrado en esta investigación, y en el caso del Pb (1.2 a 1.7 mg kg^-1), los valores son inferiores a los determinados en este trabajo. El contenido en la raíz de alfalfa indica que existieron diferencias (P<0.01), siendo As, Cu en la zona 4 y Cr en la zona 2 los que obtuvieron los mayores valores. Al comparar entre componentes (parte comestible y raíz) únicamente se obtuvo diferencia significativa (P<0.01) para el contenido de Zn (12.09 ± 5.5 mg kg^-1) en la parte comestible, siendo mayor que el detectado en la raíz (7.15 ± 5.2 mg kg^-1). El resto de metales no mostraron diferencias; esto podría deberse a que el año 2015 fue clasificado como un año de alta precipitación pluvial. Según CONAGUA³⁴, marzo contribuyó con el 7.9 % a la hoja nacional de agua, equivalente a cuatro veces su contribución normal, de modo que en este mes, se produjo una precipitación de 125 mm, a diferencia de 2014 que tuvo una precipitación de 25 mm en el mismo mes. Para julio de 2014, la precipitación fue 150 mm.

En el caso particular del Pb al no haber diferencia entre raíz y la parte comestible, puede deberse a que la vía principal de contaminación con el Pb no es la raíz, aunque tiende a ser acumulado en ésta, debido a que el Pb es poco soluble^35,36, lo cual contribuye a que posea menor movilidad, denotando que este elemento también puede estar ingresando a nivel de las hojas.

Aunque las plantas de alfalfa tienen gran capacidad acumuladora de metales pesados^37,38; existen diferentes mecanismos de absorción y factores que pueden influir a que los metales no sean movilizados o no estén biodisponibles. Los metales se transportan a la raíz por flujo de agua en forma de iones, los cuales se absorben por estar en contacto con las raíces cuando se encuentran solubles en agua. La baja movilización del Pb puede deberse a la capacidad que tiene la planta de excluir el metal del paso de la raíz al suelo, o bloqueando el movimiento del metal dentro de la planta por medios péptidos (fitoquelatinas), aminoácidos (histidina y cisteína), compuestos fenólicos y ácidos orgánicos (cítrico, oxálico y málico) , que secuestran o forman compuestos mediante la unión de ligandos específicos; además del valor del pH y las condiciones de textura y materia orgánica presentes en los suelos³⁹, lo que puede contribuir a que exista menor solubilidad impidiendo la movilización.

Por tanto, la presencia del Pb y As en hojas puede deberse a que han sido absorbidos a nivel de las hojas debido a contaminación aérea. Otro mecanismo de absorción de metales por las plantas es la difusión que ocurre por gradiente de concentración de mayor a menor. También la intersección de la raíz con el suelo, la cual depende del tamaño, profundidad y el agua libre del suelo, que puede ser absorbida del espacio entre las partículas del suelo, siendo aprovechada esta vía tanto para los nutrientes como por los metales pesados⁴⁰. Además, se ha mencionado que las sinergias y antagonismos que pueden existir entre los metales conducen a una mayor absorción, que puede ser benéfica o perjudicial al crecimiento de las plantas, y con ello la acumulación en la misma⁴¹. Tal es el caso del Pb y Cd, que de manera individual ocasionan daños negativos en las plantas, pero cuando aparecen juntos dentro de ésta, la fitotoxicidad se ve aumentada.

Factor de bioconcentración (BCF) y factor de translocación (TF)

Los valores de BCF (Figura 2) indican que las plantas de alfalfa en las cuatro zonas tuvieron un valor inferior a uno para todos los metales estudiados. En el análisis del BCF por épocas se encontró que existió diferencia significativa (P<0.01), donde los valores de Pb, Ni y As fueron superiores en el verano (Figura 3) y el Zn mostró su nivel más alto en primavera. Así se tiene que los metales menos disponibles en orden ascendente fueron el Cd, Cr, Pb. Sin embargo, para ningún metal y en ninguna de las dos estaciones climáticas muestreadas existieron valores BCF >1.

Los datos son medias y la línea vertical representa la desviación estándar.

Figura 2 Factor de bioconcentración (BCF) de metales pesados en alfalfa cultivada en áreas irrigadas con aguas residuales 

Los datos son medias y la línea vertical representa la desviación estándar.

Figura 3 Factor de bioconcentración (BCF) por época del año en alfalfa cultivada en áreas irrigadas con aguas residuales 

Algunos autores^42,43 mencionan que cuando TF >1, se considera que las plantas son acumuladoras de metales pesados, y en el presente estudio los valores encontrados (Figura 4) demuestran que en orden decreciente los metales que mostraron mayor movilidad de la raíz a la parte aérea de la planta fueron; Zn, Cu, Ni, Pb y Cr. En el caso del Cd, estuvo en el límite y el As es el metal con la menor movilidad presentada en esta investigación.

Los datos son medias y la línea vertical representa la desviación estándar.

Figura 4 Factor de translocación (TF) de metales pesados en alfalfa irrigada con aguas residuales 

En consecuencia, se considera que las alfalfas muestreadas en este trabajo tienen características de ser acumuladoras de metales pesados. Los valores obtenidos al evaluar el TF (Figura 5) durante las épocas demuestran diferencia significativa (P<0.01), siendo en verano donde se detectó mayor movilidad de Pb, Ni, Cu y Zn. En el caso de Cr la movilidad fue mayor en primavera. El Cd presentó valores que están en los límites, y se le considera con buena movilidad por la importancia tóxica que representa, y por ser altamente soluble en agua⁴⁴.

Los datos son medias y la línea vertical representa la desviación estándar.

Figura 5 Factor de translocación (TF) de metales pesados por época del año en alfalfa irrigada con aguas residuales 

Siendo la alfalfa una planta considerada como acumuladora de metales pesados, hace suponer un riesgo de contaminación por la ingestión que de ella realizan los animales⁴⁵. Algunos metales como el Co, Mn, Fe, Se, Zn, Cu y Ni, son esenciales para las funciones biológicas y fisiológicas de plantas, incluyendo la biosíntesis de proteínas, ácidos nucleicos, sustancias de crecimiento, síntesis de clorofila entre otras funciones; pero más allá de los límites permisibles, estos elementos metálicos se vuelven tóxicos dependiendo de la naturaleza, especies de metal y plantas⁴⁶.

Aunque las plantas tienen un mecanismo de desintoxicación efectuado por las fitoquelatinas, éstas no logran evitar la captación por parte de los rumiantes, ya que cuando los metales están unidos a las fitoquelatinas, al ser ingeridas por el animal forman un compuesto de glutamilcisteína en el rumen y el intestino delgado, pero es probable que este compuesto sea degradado rápidamente por los microorganismos del rumen, liberando así al metal que tiende a ser acumulado en los tejidos animales⁴⁷. Principalmente en el caso de aquellos metales que no son necesarios para el metabolismo de los animales y que son considerados como de mayor toxicidad (Cd, Pb); y en el caso del As, se le ha considerado con alguna función en el metabolismo de plantas y animales; sin embargo, es un metaloide sumamente tóxico, y se les considera a los tres como cancerígenos.

No obstante los valores encontrados en la parte comestible de la alfalfa, son bajos comparados con las normas establecidas para límites permisibles de metales en alimentos para ganado; pero hay que considerar que dichos límites han sido instaurados sin ser objetivos⁴⁷, por lo consiguiente la acumulación de los diferentes metales en rumiantes está relacionada más con el intervalo de tiempo de ingestión de los metales contenidos en los alimentos y la baja tasa de excreción de estos^47,48. Los metales tóxicos pueden tener bajos índices de absorción, pero logran utilizar mecanismos de absorción supuestos para otros metales tales como el Cd-Zn y Pb-Ca, lo que hace posible la contaminación de los productos y subproductos animales para consumo humano.

Así se tiene que el Cd se acumula principalmente en riñones e hígado y el Pb se deposita primordialmente en huesos largos y puede ser movilizado a la leche de las vacas principalmente después del parto^49,50. La contaminación de los suelos y la edad de los animales son predictores de contaminación animal⁵¹, y los valores de los metales en suelo utilizados para la realización de esta investigación son indicativas de contaminación, aunado a la edad de las vacas, las cuales están por arriba de los tres años de edad, tiempo necesario para que exista acumulación de metales pesados en el cuerpo de los bovinos.

La concentración de metal en la leche (Cuadro 3) fue significativamente diferente entre las zonas (P≤0.001), excepto para As y Ni. El Pb estuvo por encima de los valores permisibles (0.020 mg kg^-1) por la Comisión Europea⁵² y la WHO/FAO⁵³. Sin embargo, los elementos tóxicos Pb y As, fueron inferiores a los valores establecidos por la Norma Oficial Mexicana NOM-184-SSA1-2002⁵⁴, que considera permisible para Pb 0.1 mg kg^-1 y 0.2 mg kg^-1 para As. En el caso del Cd no está reglamentado en las normas internacionales ni en la nacional.

En México, Solís et al⁵¹, informaron valores de 0.065 mg kg^-1 para Pb y 0.27 mg kg^-1 para Cu y 24 mg kg^-1 para Zn en leche producida en áreas de riego con aguas residuales domésticas e industriales, siendo los niveles superiores a los encontrados en este estudio. Rosas et al⁵³ indican valores de As en un rango de 0.9 a 27.4 mg kg^-1 en leche de la Comarca Lagunera en México, considerada como una región rica en arsénico, siendo estos niveles inferiores a los determinados en este trabajo.

La determinación de los valores de biotransferencia de los metales de las plantas a la leche fue de: 1.21E-04; 3.06E-07; 2.10E-05; 8.27E-05; 1.38E-05; 2.12E-04; 1.30E-02, para AS, Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, y Zn respectivamente, donde el As, Pb y Zn muestran una biotransferencia mayor y en el caso del As concuerda con los valores reportados por Rosas et al⁵⁵.