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Introducción
Cryptosporidium spp., es un parásito protozoario que causa infección entérica en varias especies animales, así como en los seres humanos, y es un importante problema de salud animal, así como de salud pública, principalmente en individuos jóvenes o inmunocomprometidos; los ooquistes del parásito son resistentes al medio ambiente y pueden contaminar agua y alimentos1,2,3. En los ovinos, la criptosporidiosis se presenta con un cuadro de diarrea de leve a severa, de color amarillento con un fuerte olor, acompañada de dolor abdominal, pérdida de peso, depresión, y eventualmente la muerte; es más frecuente en corderos lactantes a partir de su nacimiento y hasta un mes de edad4,5. Cryptosporidium spp., es uno de los principales patógenos entéricos asociados con diarrea neonatal y mortalidad en corderos; los borregos adultos asintomáticos son una importante fuente de infección para los animales jóvenes y la principal condición de diseminación dentro de la granja6. Las especies de Cryptosporidium identificadas en ovinos son: C. parvum, C. xiaoi y C. ubiquitum, aunque C. andersoni y C. fayeri también se reportan2,7,8; C. parvum es una especie zoonótica9,10. A la fecha, no se han reportado tratamientos efectivos contra este parásito3,11. El diagnóstico de la infección por Cryptosporidium mediante métodos moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha permitido identificar especies y genotipos del parásito, así como caracterizar la dinámica de transmisión de la infección en los seres humanos y en los animales10,12. Así, se conoce la distribución geográfica de las especies y la diversidad genética del parásito. En el ganado ovino se han reportado diferentes especies de Cryptosporidium en EUA, Reino Unido, Italia, Bélgica, España, Túnez, China, Australia y Brasil, principalmente12,13. Los análisis moleculares han confirmado que C. parvum infecta de forma natural a corderos y cabritos14. En México, este parásito se identificó por primera vez en bovinos lactantes en el año de 1983, mediante microscopía15; sin embargo, en el país hay pocos estudios sobre la infección por Cryptosporidium spp., en ovinos5,15.
El objetivo de la investigación fue determinar la frecuencia de la infección por Cryptosporidium spp., en corderos lactantes de razas de pelo, mantenidos en pastoreo en la región de la Huasteca Alta del estado de Veracruz, México, y realizar la identificación de la especie de los ooquistes encontrados, utilizando herramientas moleculares.
Material y métodos
Sitio de estudio
El estudio se desarrolló en la región de la Huasteca Alta del estado de Veracruz, México, la cual se localiza en la zona norte del estado, en las coordenadas 21º46´ N y 98º27´ O, a una altura de 1 a 150 msnm. Está integrada por siete municipios: Pánuco, Tampico Alto, Tempoal, Ozuluama, Tantoyuca, Naranjos y Tamiahua (Figura 1). La temperatura media anual es 24.4 °C y la precipitación promedio anual es de 1,239 mm. La región cuenta con diversidad climática amplia, que va del clima cálido-extremoso al templado subhúmedo (16.
Granjas y manejo de animales
La región de la Huasteca Alta cuenta con 6,678 ovejas en etapa reproductiva y 1,991 corderos17. El método epidemiológico de conveniencia de Thrusfield18, se usó para seleccionar el 10 % de la población de corderos; 21 granjas de ganado ovino distribuidos en siete municipios de la región bajo estudio, Panuco, Tampico Alto, Tempoal, Ozuluama, Tantoyuca, Naranjos y Tamiahua, tres granjas por cada uno de ellos; la inclusión de las granjas fue en función de que contaran con ovinos encastados de razas de pelo, principalmente Pelibuey, Black Belly y Katahdin, y que los productores mostraran interés por participar en el estudio. Los ovinos se mantuvieron bajo un sistema de libre pastoreo en praderas naturales o cultivadas, o ambas, con pastos estrella (Cynodon plectostachyus), pangola (Digitaria decumbens), guinea (Panicum maximun) y brizantha (Brachiaria brizantha), sin ningún control reproductivo, y sin aplicar prácticas de manejo y control sanitario.
Toma de muestras
Las granjas se visitaron en una sola ocasión, eligiendo al azar diez animales clínicamente sanos de la población de corderos que tuviera entre 7 y 21 días de edad, ya que en este intervalo de edad son más susceptibles a la infección11. Se tomaron muestras de excremento directamente del recto, anotando el nombre de la granja, identificación del animal y su edad; las muestras se conservaron a 4 °C, y se procesaron en el laboratorio dentro de 24 a 72 h después de colectada la muestra.
Limpieza y concentración de las muestras fecales
Previo al diagnóstico microscópico y molecular, se realizó la limpieza de las muestras fecales2, tomando 15 g de heces de cada muestra que se transfirieron a tubos de 50 ml que contenían 35 ml de agua destilada (dH2O). El contenido de cada tubo se mezcló vigorosamente durante 2 min, pasando la muestra a través de una malla de poro de 50 mm a un segundo tubo de 50 ml, y el volumen final se ajustó a 50 ml con dH2O. Los tubos se centrifugaron a 1,800 xg durante 15 min, y el sobrenadante se desechó; el sedimento se suspendió de nuevo en 25 ml de dH2O y se mezcló vigorosamente durante 2 min. Se añadieron 25 ml de cloruro de cesio (CsCl) a una concentración de 1.4 g L-1 en cada tubo y se centrifugó a 300 xg durante 20 min. Solamente 4 ml de sobrenadante se aspiraron de la parte superior de cada muestra, los cuales se transfirieron a un tubo de centrífuga, y se agregó dH2O hasta obtener un volumen final de 15 ml. Las muestras se centrifugaron a 1,800 xg durante 15 min y se lavó el material dos veces con dH2O, posteriormente el pellet final fue resuspendido en 500 µl de dH2O.
Diagnóstico microscópico
Un frotis fecal se realizó con 100 µl del material concentrado previamente con CsCl, diluyendo la muestra 1:1 con agua oxigenada. Después se dejó secar por 24 h a temperatura ambiente (25 °C), se procesaron mediante la técnica de tinción ácido-alcohol resistente de Kinyoun19, y se observó el frotis en un microscopio (LCD Digital, Leica®) a 100X. La muestra se consideró negativa al no observar ningún ooquiste después de revisar seis campos microscópicos en cada portaobjetos (laminilla de vidrio 75 mm x 26 mm); con la finalidad de minimizar las lecturas de falsos positivos la muestra se consideró positiva cuando se observaron al menos ≥ 5 ooquistes de Cryptosporidium spp., los cuales se presentan de forma esférica y teñidos de color rosa brillante20.
Extracción de ADN
La extracción de ADN total de cada muestra se realizó a partir del material concentrado previamente con CsCl, utilizando el paquete comercial DNeasy Tissue Kit (Qiagen®, Valencia, CA), de acuerdo a lo recomendado por el proveedor11.
Amplificación del Gen 18S rARN.
Un fragmento de la región 18S rARN del gen de Cryptosporidium spp., se amplificó utilizando una PCR anidada con los iniciadores descritos Xiao et al21, (5'-TTCTAGAGC TAATACATGCG-3' y 5'- CCCTAATCCTTCGAAACAGGA-3' para la PCR primaria, y 5’-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3’ y 5’-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3’ para la PCR secundaria. Para la primera PCR, la reacción contenía: buffer 1X de PCR (Sigma-Aldrich®); MgCl2, 3 mM (Sigma-Aldrich®); dNTP (Invitrogen® Life Technologies), 0.2 mM de cada uno; Taq polimerasa (Invitrogen® Life Technologies) 2.5 U; Albumina sérica bovina (BSA; Sigma-Aldrich ®) 2.5 ml (0.1 g/10 ml) y 1 µM de cada iniciador (New England Biolabs, Beverly, MA), en un volumen de 50 µl de reacción. La mezcla se sometió a 35 ciclos, cada uno de 94 °C durante 45 seg, 59 °C durante 45 seg, y 72 °C durante 1 min, un arranque en caliente a 94 °C durante 3 min. También se incluyó un paso de extensión final a 72 °C por 7 min. Para la segunda PCR la reacción fue idéntica a la primera, excepto que se utilizó una concentración de 1.5 mM de MgCl2. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 40 ciclos de 94 °C durante 30 seg, 58 °C durante 90 seg, y 72 °C durante 2 min, con un arranque en caliente a 94 °C durante 3 min y una etapa de extensión final de 72 °C durante 7 min, utilizando un Termociclador Bio-Rad® T100.
Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% en TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA). El marcador de peso molecular utilizado fue de 1 kb (Invitrogen®) para identificar la banda correspondiente a 830 pb. Controles positivos y negativos se incluyeron en todos los casos. Después se tiñó el gel con bromuro de etidio a una concentración de 5 mg ml-1 durante 15 min. Los resultados de esta fase se observaron en un Transiluminador Bio Doc.it Imagin System®.
Identificación molecular
Las muestras identificadas como positivas a Cryptosporidium spp., se purificaron con el paquete comercial Min Elute PCR Purification Kit, (Qiagen®, Valencia, CA). Las muestras purificadas se secuenciaron en ambos sentidos, utilizando los iniciadores ya descritos, con el sistema de secuenciación BigDye Terminator Cycle Sequencing utilizado en el equipo 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), en el Laboratorio Nacional de Genómica (CINVESTAV Unidad Irapuato, Guanajuato, México). Las secuencias obtenidas en el estudio fueron alineadas y comparadas por homología con las reportadas en el GenBank, empleando el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tools)22.
Análisis de la información
La frecuencia de corderos positivos a la presencia de ooquistes de Cryptosporidium spp., se calculó en el total de las muestras, por municipio y por granja incluida en el estudio, así como por intervalo de edad de los corderos, considerando los resultados obtenidos por microscopia y por técnicas moleculares.
Resultados
La técnica parasitoscópica de frotis fecal teñido por el método de Kinyoun, permitió identificar 41 muestras positivas a Cryptosporidium spp. La frecuencia general de casos fue de 19.5 % (41/210; IC 95% 14-25). La frecuencia entre rebaños varió de 10 a 50 % (Cuadro 1), existiendo 62 % (13/21) de las granjas con al menos un cordero infectado. En el grupo de corderos de 7 a 14 días de edad se identificó una frecuencia de 10.4 % (22/210; IC95% 6-15) mientras que en el grupo de 15 a 21 días fue 9 % (19/210; IC95% 5-13). En los siete municipios estudiados se encontraron corderos positivos a la presencia de ooquistes del parásito; la frecuencia en los municipios se presentó en un rango de 6.7 % (2/30; IC95% 1-23) en Pueblo Viejo a 36.7 % (11/30; IC95% 20-56) en Tamiahua (Cuadro 2).
Cuadro 1 Frecuencia de Cryptosporidium spp., en la región de la Huasteca Alta de Veracruz, México, distribuida por la granja y el grupo de edad
| Municipio | Granja | + | - | Edad 7-14 días + | Edad 15-21 días- | Frecuencia por grupo de edad (%) | Frecuencia por granja (%) | |
| 7-14 | 15-21 | |||||||
| 1 | 0 | 10 | 0 | 0 | 0 | |||
| Naranjos | 2 | 4 | 6 | 3 | 1 | 13.3 | 10.0 | 40 |
| 3 | 3 | 7 | 1 | 2 | 30 | |||
| 1 | 4 | 6 | 2 | 2 | 40 | |||
| Ozuluama | 2 | 0 | 10 | 0 | 0 | 10 | 16.6 | 0 |
| 3 | 4 | 6 | 1 | 3 | 40 | |||
| 1 | 3 | 10 | 7 | 2 | 1 | 2 | 30 | |
| Pánuco | 2 | 0 | 8 | 10 | 0 | 0 | 6.6 | 0 |
| 3 | 1 | 10 | 9 | 0 | 1 | 10 | ||
| 1 | 0 | 10 | 0 | 0 | 0 | |||
| Pueblo viejo | 2 | 2 | 8 | 0 | 2 | 0 | 6.6 | 20 |
| 3 | 0 | 10 | 0 | 0 | 0 | |||
| 1 | 3 | 7 | 2 | 1 | 30 | |||
| Tamiahua | 2 | 3 | 7 | 2 | 1 | 20 | 16.6 | 30 |
| 3 | 5 | 5 | 2 | 3 | 50 | |||
| 1 | 2 | 8 | 2 | 0 | 20 | |||
| Tabtoyuca | 2 | 4 | 6 | 3 | 1 | 16.7 | 3.3 | 40 |
| 3 | 0 | 10 | 0 | 0 | 0 | |||
| 1 | 0 | 10 | 0 | 0 | 0 | |||
| Tempoal | 2 | 3 | 7 | 2 | 1 | 6.6 | 3.3 | 30 |
| 3 | 0 | 10 | 0 | 0 | 0 | |||
| Total | 21 | 41 | 169 | 22 | 19 | 10.4 | 9.0 | |
Cuadro 2 Frecuencia de Cryptosporidium spp., detectada por microscopía y de identificación de C. parvum mediante PCR, en corderos
| Municipio | n | Cryptosporidium spp. (microscopia) | Frecuencia(%) | n | C.parvum(PCR) | Frecuencia(%) |
| Naranjos | 30 | 7 | 23.4 | 7 | 1 | 14.2 |
| Ozuluama | 30 | 8 | 26.6 | 8 | 2 | 25.0 |
| Pánuco | 30 | 4 | 13.3 | 4 | 1 | 25.0 |
| Pueblo viejo | 30 | 2 | 6.7 | 2 | 0 | 0 |
| Tamiahua | 30 | 11 | 36.7 | 11 | 4 | 36.3 |
| Tantoyuca | 30 | 6 | 20.0 | 6 | 3 | 50.0 |
| Tempoal | 30 | 3 | 10.0 | 3 | 0 | 0 |
| Total | 210 | 41 | 19.5 | 41 | 11 | 26.8 |
Del total de muestras recolectadas, 11 resultaron positivas por microscopía y por la prueba de PCR anidada, mientras que 30 muestras positivas por microscopía no amplificaron el segmento en la prueba de PCR anidada; el resto de las muestras fueron negativas en ambas pruebas, arrojando una frecuencia de 26.8 % (11/41; IC95% 4-43) de muestras que amplificaron el segmento, observándose que por municipios se tuvo un rango de 14.3 % (1/7; IC95% .07-58) a 50 % (3/6; IC95% 13-86) (Cuadro 2).
La identificación de la especie de Cryptosporidium presente en las muestras de ADN de los corderos positivos por microscopía, mostró que tuvieron una homología del 100 % para C. parvum (Accesión GenBank AF093493). Seis muestras positivas a C. parvum correspondieron al grupo de corderos de 7 a 14 días de edad y cinco al grupo de 15 a 21 días de edad. No fue posible identificar alguna otra especie o genotipo en las muestras.
Discusión
La infección por Cryptosporidium spp., se caracteriza por afectar primordialmente a los animales neonatos y se ha estudiado en bovinos, pero en ovinos está poco documentada, en particular en sistemas de pastoreo23. Algunos estudios han mostrado la frecuencia de Cryptosporidium utilizando diversas técnicas de diagnóstico. En México la información sobre la frecuencia de la infección en ovinos es escasa; un estudio desarrollado en el Estado de México realizado en 37 granjas con corderos estabulados se identificó una prevalencia de 34.3 %15, y en el municipio de Perote, Veracruz, México, en ovinos de razas de pelo mantenidos en sistemas de pastoreo se identificó, una prevalencia de 67.5 %, mientras que en los corderos menores de un mes fue de 88.2 %, todos las granjas fueron positivas al parásito, identificado mediante la técnica de microscopia mediante la cual sólo es posible identificar el género Cryptosporidium5; siendo el diagnóstico molecular la manera más certera de identificar especie9,11.
En el presente estudio, la frecuencia general de casos fue de 19.5 % y por grupo de edad, 10.5 % en los de 7-14 días de edad y 9 % en los de 15-21 días, valores menores que los reportados en los estudios desarrollados en México; solo el 62 % de los rebaños presentaron ovinos positivos, aunque en todos los municipios hubo al menos una granja con casos positivos a Cryptosporidium spp. Las diferencias entre estos estudios son comprensibles porque cada uno de ellos se desarrolló bajo condiciones particulares de tiempo, diseño del muestreo, diversidad en las prácticas de manejo, y en última instancia a la competencia de la persona que realiza el diagnóstico microscópico, así como al criterio para considerar una muestra positiva.
En la literatura hay estudios desarrollados con la misma finalidad que el presente. Así, en Bélgica se reporta una prevalencia en corderos menores de un mes de vida de 13.1 % (18/137), identificando positivos solo en el 40 % de los diez rebaños estudiados22; mientras que en Zambia, la prevalencia fue de 12.5 % en corderos menores de un mes14. En Turquía24, indican en corderos de esta misma edad una prevalencia de 38.8 % (155/400), distribuida en el 90 % (18/20) de las granjas observadas, mostrando que de acuerdo con los grupos de edad, la frecuencia en corderos de una semana de edad fue 44.4 % (67/151), en corderos de dos semanas fue 37.5 % (39/104), en los de tres semanas 40 % (38/95) y 22 % (11/50) en los de cuatro semanas de edad. En la India, se identificó una infección de 65 % en corderos de menos de un mes de edad25; en Zaragoza, España, Cryptosporidium spp., se presentó en corderos de 14 días de edad26. La comparación entre estudios desarrollados en otros países con el nuestro es difícil; la información generada en ellos permite confirmar que este parásito infecta con mayor frecuencia a corderos menores de 30 días de edad, como se reporta en la literatura11, y la prevalencia es tan diversa como los sistemas de producción.
La frecuencia de la infección por Cryptosporidium spp., puede ser influenciada por diferentes factores en mayor o menor intensidad, tales como el sistema de crianza, estado nutricional, el estado inmunológico de los animales, la estación del año y el manejo sanitario en las granjas. Sin embargo, la edad es un factor considerado como marcador de riesgo a contraer la infección; los animales jóvenes, en especial los lactantes, son los más propensos a sufrir esta enfermedad, y a ello se le adicionan al menos otros dos factores de riesgo, el estado inmunológico de los animales y el manejo sanitario25-28. La exposición inicial de los neonatos a la infección ocurre en las áreas de parición, como consecuencia de la eliminación de ooquistes por parte de las borregas gestantes; por lo general los ooquistes contaminan la ubre, el agua, el alimento y las áreas donde habitan los corderos; así, el sistema de manejo interviene en la probabilidad de transmisión del protozoario entre animales infectados y susceptibles27. La infección en el hospedador inmunocompetente es autolimitada y deja en el sujeto una inmunidad sólida ante la re-infección; lo contrario, ocurre en sujetos con deficiencias linfocitarias o de gammaglobulinas; hay que recordar que los ooquistes son infectantes al momento de excretarse de su hospedero2. La resistencia de los ooquistes en el medio ambiente también es importante, ya que sobreviven en camas, paredes, comederos, bebederos y utensilios, y mantienen su capacidad infectante durante largos periodos de tiempo; además, el contacto entre los animales recién nacidos y los adultos representa una importante fuente de contaminación y de dispersión del parásito en su fase infectante12,29. La diseminación del parásito ocurre cuando el excremento contaminado se deposita en el suelo, de tal forma es factible que los ooquistes se transporten por agua o aire a los sitios o materiales que actúan como vehículos de contagio17,10. En sistemas de producción intensivos se detecta una prevalencia más alta que en los manejados en pastoreo4,15, probablemente debido a que las condiciones de confinamiento favorecen la presencia de la infección como se ha demostrado en becerros lactantes2,26,30.
En la presente investigación, C. parvum fue la única especie identificada en las muestras procesadas; esta especie es la que se presenta con mayor frecuencia en los rumiantes domésticos, particularmente en animales jóvenes31-34, además de ser una especie con capacidad zoonótica9,17. En México, C. parvum ha sido identificada mediante biología molecular en ganado bovino lechero33; el hallazgo de su presencia en el ganado ovino incluido en el presente estudio, representa el primer reporte en el país para esta especie animal.
Conclusiones e implicaciones
Los resultados observados en este estudio muestran que la frecuencia de la infección por Cryptosporidium spp., en corderos es moderada en la población estudiada; sin embargo, denota la amplia distribución del parásito en la región. La identificación de C. parvum como única especie presente en las muestras estudiadas, confirma que la misma es de carácter cosmopolita y la más frecuente en rumiantes; así, este hallazgo es de importancia epidemiológica, porque sugiere que los animales infectados pueden actuar como diseminadores del parásito para otros animales domésticos y silvestres, e incluso para los seres humanos, particularmente para los manejadores de ganado.
