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INTRODUCCIÓN
La población de asnos (Equus asinus) se ha incrementado ampliamente a lo largo de las últimas décadas en América del Sur, dado que su interés radica en la producción de mulares para el deporte, el ocio y sobre todo para el manejo de los rebaños de ganado vacuno1. La inseminación artificial con semen criopreservado, es considerada como una de las biotecnologías de la reproducción más importantes para incrementar el número de individuos de muchas especies, como también para mejorar la distribución genética y reducir la consanguinidad2. Sin embargo, la criopreservación del semen ha requerido convencionalmente la centrifugación del eyaculado, con la finalidad de retirar el plasma seminal, al ser considerado perjudicial para los espermatozoides durante el almacenamiento a bajas temperaturas3,4. En équidos se ha observado que el uso de altas proporciones de dilución de los eyaculados, así como la eliminación parcial o total del plasma seminal, pueden reducir los efectos nocivos de este fluido biológico sobre los espermatozoides5,6.
El plasma seminal contiene una gran diversidad de componentes, sin embargo su papel fisiológico todavía no se entiende completamente7. En condiciones naturales, se sabe que está involucrado en varios eventos que preceden la fertilización, como la activación de la movilidad, la acción antimicrobiana, la neutralización de metabolitos y la mediación de la capacitación espermática y de la respuesta inflamatoria uterina postcoital7,8. En equinos (Equus caballus) se han identificado diversos componentes del plasma seminal, así como su relación con calidad del semen fresco y criopreservado5,9. Sin embargo, poco se conoce en este sentido, respecto al plasma seminal de los asnos y sus componentes. El objetivo de este trabajo fue evaluar la suplementación con plasma seminal y la relación existente entre algunos de sus componentes, con la calidad del semen congelado-descongelado de asnos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Recolección de semen
Cinco asnos criollos colombianos (Equus asinus), localizados en el Valle del Aburra, Antioquia (Colombia), se utilizaron para la recolección de dos eyaculados (fracción espermática) por animal. Los animales estuvieron entre los 4 y 8 años de edad, con fertilidad probada por el nacimiento de crías vivas después de la inseminación artificial de yeguas, condición corporal entre 7 y 8 (escala 1-9) y condiciones similares de manejo en estabulación. El semen se colectó por el método de vagina artificial, con un periodo de descanso sexual de ocho días entre los eyaculados (para cada animal). Una fracción de 5 a 10 ml del eyaculado se utilizó para extraer el plasma seminal, mediante centrifugación a 850 xg durante 15 min. El resto del eyaculado se diluyó en proporción 1:1 en EquiPlus® (Minitube, Alemania) y se transportó en refrigeración a 5 ºC (Equitainer®, Hamilton Research Inc, USA).
Evaluación de componentes del plasma seminal
Concentración de proteínas totales (PT) . Se evaluó por triplicado para cada muestra de plasma seminal, el cambio de color de Coomassie Brilliant Blue G-250 (BIO-RAD, USA) en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas (método de Bradford). Se construyó una curva patrón con una solución de albumina sérica bovina (1 mg/ml) (Sigma-Aldrich, USA). La evaluación se realizó por espectrofotometría (Multiskan™, Thermo Scientific, USA) a 595 nm, por 5 min a temperatura ambiente10.
Vitamina C (VC) y vitamina E (VE). Se realizó la liofilización del plasma seminal mediante un liofilizador FreeZone®Plus de 2.5 L (Labconco Corp., USA). El contenido de ambas vitaminas se evaluó por triplicado para cada muestra de plasma seminal, mediante HPLC con un cromatógrafo líquido LC-20AD (Shimadzu Sci. Inst. USA), equipado con un auto inyector (SIL-20A /HT), un módulo de comunicación (CBM-20A) y un detector de fila de diodos a 245 nm. El plasma liofilizado se diluyó en agua suprapura, antes de la inyección al cromatógrafo. El contenido de VC (ácido ascórbico) se evaluó según un protocolo modificado11. La cuantificación se llevó a cabo en una columna C-8 de dimensiones (5 (m) 250*4.6. Como fase móvil se utilizó ácido fórmico 0.1 %. El contenido de VE (α-tocoferol) se evaluó según un protocolo modificado12. La cuantificación se llevó a cabo en una columna LiChrospher RP-18 de dimensiones (5 (m) 250*4.5. Como fase móvil se utilizó metanol/diclorometano (85:15, % v/v). Para ambas lecturas la razón de flujo de la fase móvil fue 0.8 ml/min, 35 °C y condiciones isocráticas. Para la identificación y cuantificación de los compuestos se construyeron previamente curvas de calibración con ácido ascórbico y α-tocoferol grado HPLC.
Perfil lipídico . Se evaluó por triplicado para cada muestra de plasma seminal, mediante un cromatógrafo de gases 6890N (Agilent Tech, USA) acoplado a un detector selectivo de espectrofotometría de masas MS 5973N (Agilent Tech, USA) y equipado con un inyector split/splitless. La temperatura del inyector fue 300 ºC y la muestra previamente derivatizada con KOH-metanol se inyectó automáticamente en el modo Split-less. Se usó una columna HP-5 ms (5 % fenilmetilsiloxano) de 30 m, 0.25 mm con un espesor de película 0.25 μm y una temperatura máxima de 325 ºC. El programa de temperatura se inició a 50 ºC hasta 200 ºC (5 min) con una temperatura final de 300 ºC (14 min) a una tasa de 10 ºC/min. Se usó helio como gas portador a un flujo constante de 1 ml/min. La temperatura del detector fue de 300 ºC. Para el análisis se utilizó el software MSD ChemStation D 02.00.275 (Agilent Tech, USA) y la base de datos NIST 200513.
Criopreservación de semen
Se realizó por medio de un protocolo de congelación modificado en cuanto al diluyente utilizado y el tiempo de exposición a vapores14. El semen se centrifugó por 12 min a 850 xg y el precipitado se resuspendió en diluyente EquiPlus® (Minitube, Alemania) suplementado con 3 % de glicerol (% V/V), 5 % de yema de huevo (% V/V) y 20 % de plasma seminal (% V/V). El plasma seminal utilizado para cada proceso provino del mismo asno y eyaculado procesado. La dilución se realizó hasta alcanzar una concentración final de 100 x 106 espermatozoides/ml. El semen se mantuvo a 5 °C por 60 min y se empacó en pajillas de 0.5 ml en un equipo MRS1 Dual V2 (IMV Technologies, Francia). Las pajillas se mantuvieron en refrigeración a 5 ºC durante 1 h y luego se sometieron a vapores de nitrógeno líquido por 15 min (tasa de enfriamiento aproximada de -8.3 ºC/min) y se almacenaron en un tanque para nitrógeno líquido (tasa de enfriamiento aproximada de -38 ºC/seg). El semen permaneció congelado durante 15 días y se descongeló en agua a 37 ºC por 1 min. Luego se mantuvo temperado a 37 ºC por 5 min antes de la evaluación de la calidad seminal post-descongelación.
Evaluación de la calidad seminal
Movilidad espermática . Se evaluó mediante el sistema SCA® versión 5.1 (Microptic S.L., España) de acuerdo a un protocolo previamente reportado15. Se utilizó un microscopio de contraste de fase (Eclipse E200, Nikon, Inc., Japón) con una cámara digital (Scout SCA780, Basler, USA). Se evaluaron los parámetros: movilidad total (MT), movilidad progresiva (MP), velocidad rectilínea (VSL), velocidad curvilínea (VCL), velocidad media (VAP).
Integridad estructural de membrana (IEM). Se evaluó utilizando un procedimiento previamente descrito mediante el kit Live/Dead (Molecular Probes Inc., USA)16. Se suspendieron 200 µl de la muestra espermática en solución Hanks Heppes con 1% de albúmina sérica bovina, para una concentración aproximada de 20 x 106 espermatozoides/ml. Luego la mezcla se incubó a 37 °C por 8 min, con 6 mM de SYBR14. Seguidamente se incubó de la misma manera, con 0.48 mM de yoduro de propidio. Luego a partir de una muestra de 5 µl, se realizó el conteo de 200 espermatozoides, mediante un filtro UV-2A de un microscopio E200 con fluorescencia HBO (Nikon Inc., Japón).
Morfología anormal (MA). Se evaluó mediante la tinción con eosina-nigrosina17. Sobre un portaobjetos se depositó una gota de muestra y una gota de eosina-nigrosina (Sigma-Aldrich, USA). Ambas gotas se mezclaron y se realizó un extendido, el cual se fijó sobre una platina térmica a 37 °C. En un microscopio de contraste de fase Eclipse E200 (Nikon Inc., Japón), se realizó la evaluación de la morfología de 200 espermatozoides.
Integridad funcional de membrana (HOS). Se evaluó mediante la prueba hipoosmótica18. Se tomaron 20 μl de semen y se adicionaron a un tubo con 200 μl de una solución hipoosmótica de sacarosa 5.4 % (100 mOsmol/L). Esta mezcla se incubó a 38.5 ºC por 30 min y luego se evaluó mediante microscopia de contraste de fase (Eclipse E200, Nikon, Inc., USA) la reacción de 200 espermatozoides.
Manejo de información y evaluación estadística
El control de calidad de los análisis de laboratorio para la recolección de datos experimentales, estuvo sujeto a procedimientos de seguimiento, control, mantenimiento y calibración de equipos, acordes a la normatividad de las entidades participantes. Para los métodos de evaluación de componentes del plasma seminal, las curvas de calibración empleadas se validaron en base a ecuaciones de regresión lineal, con coeficientes de determinación (R2) superiores a 0.95. Se definió como unidad experimental la pajilla de semen congelado-descongelado. Se realizó el ajuste de modelos mixtos donde se establecieron como variables dependientes, los parámetros de calidad seminal (MT, MP, VCL, VSL, VAP, IEM, MA y HOS). Como variables independientes se incluyeron los efectos del asno y el eyaculado (como un efecto aleatorio anidado) y el efecto fijo del nivel (bajo, medio y alto) de cada componente del plasma seminal. Los rangos de clasificación de los niveles de cada componente se establecieron a partir del análisis descriptivo de la distribución (por cuartiles) de los resultados de los eyaculados evaluados. La normalidad de los datos se aseguró mediante la evaluación por la prueba de Shapiro-Wilk y el uso de transformaciones logarítmicas (logaritmo natural). Se validó el cumplimiento de los supuestos de homogeneidad de varianzas y normalidad de los errores, mediante las pruebas de Bartlett y Kolmogoroff-Smirnoff, respectivamente. Se realizó un análisis de correlación de Pearson entre las variables de calidad seminal y los componentes del plasma seminal. Las comparaciones de medias se realizaron por la prueba de Tukey. Todos los análisis se realizaron con el programa SAS 9.2 (SAS Inst. Inc., Cary, NC).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La presencia del plasma seminal durante el almacenamiento del semen a bajas temperaturas, es considerado como perjudicial4, dado que puede generar efectos deletéreos sobre la calidad y la vitalidad de los espermatozoides19. Para la especie equina, se ha descrito que componentes del plasma seminal como vitaminas y enzimas, tienen funciones como antioxidantes8,9, mientras algunas proteínas cumplen roles importantes en la interacción con el tracto genital o la modulación del sistema inmune de la hembra20. Así mismo, proteínas como las denominadas proteínas del plasma seminal (HSP) y las proteínas secretoras ricas en cisteína (CRISP), se han relacionado con la fertilidad y la criotolerancia del semen equino21,22. Respecto a los lípidos del plasma seminal, se conoce que el colesterol y los fosfolípidos tienen la función de prevenir la aparición prematura de la capacitación, a través de la estabilización de la membrana plasmática de los espermatozoides23.
Los resultados de composición del plasma seminal muestran una amplia variabilidad para la concentración de estas vitaminas entre los asnos evaluados (Cuadro 1), lo cual podría relacionarse con las marcadas diferencias reportadas en la concentración de ácido ascórbico plasmático en otros équidos24, que al igual que la concentración plasmática del ɑ-tocoferol, está ligada a su consumo o administración25.
Cuadro 1 Componentes del plasma seminal (media ± desviación estándar)*
| Media | CV | Asno 1 | Asno 2 | Asno 3 | Asno 4 | Asno 5 | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| PT | 15.4± 1.0 | 6.8 | 15.3±0.6 | 15.5± 0.0 | 14.6± 1.2 | 16.85± 0.2 | 14.8± 0.8 |
| VC | 163.9±118.6 | 72.3 | 38.1±6.4 | 175.4±39.5 | 124.7±15.1 | 345.40±101.7 | 136.0±89.4 |
| VE | 238.2± 62.2 | 26.1 | 133.4±0.0 | 202.7±60.0 | 266.9± 7.0 | 253.70± 60.6 | 282.1±41.8 |
*= 10 muestras por componente; CV= coeficiente de variación (%); PT= proteínas totales (mg de BSA equivalente/ml); VC= vitamina C (mg/l); VE= vitamina E (mg/l).
Algo similar sucedió con el perfil lipídico del plasma seminal, para el cual no se observó homogeneidad en los ácidos grasos presentes entre asnos y eyaculados. Tan solo para el ácido esteárico (C18:0), correspondiente al ácido graso con una presencia más consistente en la mayoría de eyaculados, se encontró un coeficiente de variación (CV) de 35.6 %. Mientras para ambos eyaculados de uno de los asnos evaluados (asno 3), no se detectó la presencia de ácidos grasos (Cuadro 2). Sin embargo, en este caso es posible considerar limitaciones en el método analítico empleado para la detección de los ácidos grasos y otros factores intrínsecos al reproductor que podrían explicar dicho fenómeno. Un grupo de investigadores demostraron actividad de lipasa en el plasma seminal equino y su relación adversa en la refrigeración del semen de algunos ejemplares26; aunque estos autores, plantearon la necesidad de caracterizar la naturaleza de la actividad de la lipasa en el plasma seminal, es posible que su actividad de hidrólisis esté involucrada en las variaciones en la composición de los ácidos grasos del plasma seminal de équidos.
Cuadro 2 Perfil lipídico del plasma seminal de asnos (%)
| Asno | Eyaculado | C13:0 | C15:0 | C16:0 | C18:0 | C18:1 | C18:2 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 1 | 0 | 0 | 15.16 | 19.46 | 49.29 | 16.09 |
| 2 | 0 | 57.48 | 0 | 42.52 | 0 | 0 | |
| 2 | 1 | 73.49 | 0 | 0 | 26.51 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 64.78 | 0 | 35.22 | 0 | 0 | |
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 4 | 1 | 33.44 | 0 | 0 | 14.56 | 39.98 | 12.01 |
| 2 | 0 | 0 | 79.08 | 20.98 | 0 | 0 | |
| 5 | 1 | 0 | 0 | 60.71 | 39.29 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 66.38 | 0 | 24.33 | 0 | 9.29 |
C13= ácido tridecanoico; C15:0= ácido pentadecanoico; C16:0= ácido palmítico; C18:0= ácido esteárico; C18:1= ácido oleico; C18:2= ácido linoleico.
En general, se reporta que existe una variación considerable en la composición del plasma seminal entre los sementales, al igual que en la interacción de éste con los espermatozoides27. Como excepción, en esta investigación el contenido de PT fue bastante similar incluso entre los asnos, con un CV inferior al 10 % (Cuadro 1). No se conocen investigaciones donde se reporte la medición de estos componentes en el plasma seminal de asnos.
En el plasma seminal equino se reportan valores de VC equivalentes a 1.76, 1.08, 2.05 y 0.84 mg/L, para el otoño, invierno, primavera y verano, respectivamente9, mientras otros investigadores encontraron una concentración total de VC de 6.0 mg/L en equinos ubicados en el trópico28. Estos resultados son ampliamente inferiores a los encontrados en esta investigación, lo cual indicaría una marcada influencia de la especie en la concentración de VC del plasma seminal de los équidos. Respecto al contenido de proteínas del plasma seminal, se reportan resultados de proteínas totales por eyaculado en caballos fértiles y subfértiles, de 740.8 ± 489.6 mg y 416.4 ± 254.7 mg, respectivamente29.
Las muestras colectadas de semen fresco presentaron resultados promedio de volumen (libre de gel) de 45.7 ± 18.2 ml y concentración de 249 ± 67 x 106 espermatozoides/ml. (Cuadro 3). Todos los asnos presentaron una buena calidad seminal, tomando como referencia reportes previos30,31. Se conoce que la edad de los reproductores puede ser una fuente de variabilidad en los resultados de calidad seminal; en equinos, un estudio con machos de nueve razas y un rango de edad entre 2 y 26 años, reveló una variación significativa por efecto de la edad, en el volumen, la concentración y la morfología espermática32. En el presente estudio, aunque el rango de edad fue sólo de 4 años, los parámetros volumen y concentración presentaron igualmente mayor variabilidad (CV: 39.8 y 26.9 %, respectivamente), en comparación con los demás parámetros evaluados (CV ≤ 20 %). En este trabajo, en el análisis de modelos mixtos para cada variable de calidad y composición seminal se incluyó el efecto aleatorio del asno, con el fin de reducir la variabilidad por factores inherentes al reproductor, como sería el caso de la edad.
Cuadro 3 Calidad del semen fresco de asnos (media ± desviación estándar)
| n | Media | CV | Asno 1 | Asno 2 | Asno 3 | Asno 4 | Asno 5 | |
| MT | 10 | 92.2± 7.1 | 7.7 | 98.8± 0.3 | 95.5± 0.7 | 84.6± 5.4 | 97.9±0.7 | 84.2± 2.8 |
| MP | 10 | 68.2±12.1 | 17.7 | 85.5± 0.6 | 63.9±10.2 | 66.8± 9.5 | 69.5±5.6 | 55.3±10.3 |
| VCL | 10 | 117.8±19.5 | 16.5 | 143.5± 7.5 | 110.2±15.1 | 104.6±18.9 | 107.6±2.2 | 123.3±27.1 |
| VSL | 10 | 49.9 ± 8.8 | 17.5 | 54.9± 4.9 | 51.2±15.9 | 48.1± 5.0 | 40.6±3.9 | 54.5± 9.6 |
| VAP | 10 | 84.5±17.7 | 20.9 | 104.0±13.9 | 82.5±19.2 | 66.8±11.9 | 75.0±5.9 | 93.8±17.8 |
| IEM | 10 | 88.2± 6.5 | 7.3 | 92.0± 1.4 | 92.0± 1.4 | 82.5± 2.1 | 95.0±1.4 | 79.5± 0.7 |
| MA | 10 | 16.3± 2.9 | 18.3 | 14.5± 2.1 | 19.0± 1.4 | 14.5± 0.7 | 20.0±1.4 | 13.5± 0.7 |
| HOS | 10 | 63.9± 6.9 | 10.8 | 69.5± 4.9 | 66.0± 5.6 | 55.0± 4.2 | 69.5±2.1 | 59.5± 4.9 |
n= número de eyaculados evaluados; CV= Coeficiente de variación (%); MT= movilidad total (%); MP= movilidad progresiva (%); VCL= velocidad curvilínea (µm/seg); VSL= velocidad lineal (µm/seg); VAP= velocidad media (µm/seg); IEM= integridad estructural de membrana (%); MA= morfología anormal (%); HOS= integridad funcional de membrana (%).
El análisis de correlación entre los componentes del plasma seminal y la calidad del semen fresco, arrojó coeficientes negativos (P≤0.05), para el contenido de VC con la MT (r= -0.703) y la MP (r= -0.833). Acorde con lo anterior, investigadores hallaron una mayor concentración de VC en caballos de baja fertilidad, lo cual estuvo relacionado no solo con una reducción de la movilidad, sino también con una menor concentración espermática y una mayor proporción de espermatozoides anormales9. También en este mismo estudio la suplementación con altas concentraciones de ácido ascórbico, demostró un efecto negativo sobre la peroxidación lipídica de la membrana. Se conoce que en presencia de metales de transición, la VC puede actuar como pro-oxidante, al tornarse en un radical altamente reactivo y más destructivo, y por lo tanto generar más radicales libres33.
La evaluación post-descongelación de la calidad del semen, denotó diferencias marcadas en la congelabilidad de los espermatozoides, para los diferentes asnos. Lo anterior considerando los resultados de calidad seminal en fresco, donde animales con promedios inferiores para diferentes parámetros de calidad seminal, presentaron resultados superiores post-descongelación y viceversa (Cuadro 4). Son escasos los estudios donde se analice en este sentido, el efecto individual de los reproductores asnales; sin embargo, en equinos se ha descrito la existencia de una alta variabilidad entre machos en la “crio-supervivencia” del semen34. Los parámetros que presentaron una menor variabilidad (CV <30 %) fueron aquéllos relacionados con la cinética espermática como VCL, VSL y VAP.
Cuadro 4 Calidad seminal post-descongelación (media ± desviación estándar)*
| Media | CV | Asno 1 | Asno 2 | Asno 3 | Asno 4 | Asno 5 | |
| MT | 34.2±22.6 | 66.2 | 34.8±20.8b | 31.5±22.6b | 52.8±21.2a | 26.2±18.0b | 25.5±19.4b |
| MP | 22.0±17.3 | 78.6 | 21.8±15.5b | 19.7±15.6bc | 38.3±19.2a | 14.2± 9.7c | 16.2±14.3bc |
| VCL | 86.3±20.8 | 24.1 | 83.2±21.1b | 92.6±17.9a | 92.2±18.7a | 80.5±12.5b | 83.2±28.2b |
| VSL | 62.0±18.4 | 29.7 | 61.9±19.7bc | 67.9±17.3a | 65.3±12.9ab | 56.6±11.5c | 58.7±25.5bc |
| VAP | 74.4±20.9 | 28.1 | 72.7±21.7ab | 80.9±18.3a | 80.4±17.7ab | 67.9±12.4c | 70.5±28.4c |
| IEM | 34.1±14.0 | 41.0 | 32.8± 6.2b | 29.0±10.4a | 46.7±10.5b | 31.2±12.6b | 22.1± 4.8b |
| MA | 15.0± 5.8 | 39.0 | 14.2± 3.0b | 23.8± 3.6a | 13.7± 2.9b | 12.8± 5.0b | 10.5± 3.5c |
| HOS | 26.7±12.2 | 45.5 | 23.4±12.1b | 26.4±10.6b | 39.7±10.9a | 23.7± 7.4b | 15.7± 3.2c |
*= 320 pajillas por cada parámetro evaluado; CV= coeficiente de variación (%); MT= movilidad total (%); MP= movilidad progresiva (%); VCL= velocidad curvilínea (µm/seg); VSL= velocidad lineal (µm/seg); VAP= velocidad media (µm/seg); IEM: integridad estructural de membrana (%); MA= morfología anormal (%); HOS= integridad funcional de membrana (%).
abc Letras diferentes denotan diferencia entre valores (P≤0.05).
Para el perfil lipídico del plasma seminal sólo se incluyó el ácido esteárico (C18:0), dado que fue el único ácido graso presente en la mayoría de los asnos evaluados. Se encontró que una alta concentración de VC en el plasma seminal suplementado, tuvo un efecto deletéreo post-descongelación sobre la MT y la MP (Cuadro 5), al igual que se hallaron correlaciones negativas (P≤0.05) de la VC con estos mismos parámetros (Cuadro 6). Sin embargo, se observó menor MA en muestras suplementadas con plasma con un nivel alto de esta vitamina. Otros autores han reportado una relación negativa entre la concentración de VC y la calidad del semen equino9,28, la cual sería explicada por un efecto pro-oxidante y por lo tanto generador de radicales libres, del ácido ascórbico en presencia de metales de transición33, sumado al incremento en la generación de ERO, atribuido a los efectos osmóticos y tóxicos de la criopreservación35.
Cuadro 5 Calidad seminal post-descongelación por niveles de componentes (media ± desviación estándar)
| Nivel | n | MT (%) | MP (%) | VCL (µm/seg) | VSL (µm/seg) | VAP (µm/seg) | VIT (%) | MA (%) | IM (%) | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| PT | Bajo | 128 | 38.5±24.8a | 26.8±20.2a | 94.5±21.3a | 65.7±18.3a | 82.4±21.4a | 37.5±14.3a | 15.1±6.5a | 27.4±13.5a |
| Medio | 128 | 33.8±21.4b | 21.2±15.6b | 81.1±21.1b | 67.9±19.6a | 69.9±21.7b | 32.2±13.7b | 16.0±5.2a | 27.6±12.4a | |
| Alto | 64 | 26.2±17.9c | 14.2± 9.6c | 80.5±12.5c | 45.6±11.5b | 67.9±12.3b | 31.2±12.6b | 12.8±5.0b | 23.7± 7.4b | |
| VC | Bajo | 160 | 34.8±20.7a | 25.0±15.5a | 83.2±21.1b | 64.2±19.7a | 72.7±21.7a | 32.8±14.4a | 14.2±3.0b | 23.4±12.0b |
| Medio | 64 | 37.5±25.2a | 21.8±20.1a | 86.1±21.9a | 61.9±18.8a | 74.0±21.8a | 35.1±14.4a | 17.4±6.3a | 29.7±13.7a | |
| Alto | 96 | 28.2±17.6b | 17.3±11.7b | 88.8±18.5a | 60.9±16.9a | 72.7±18.7a | 33.3±12.9a | 11.6±4.7c | 24.1± 7.4b | |
| VE | Bajo | 96 | 30.4±18.7b | 19.3±13.5b | 88.3±20.1b | 65.8±18.4a | 77.2±20.4a | 31.3±12.7b | 15.4±5.5b | 24.4±10.4b |
| Medio | 160 | 46.7±24.1a | 33.0±20.3a | 93.6±17.9a | 67.0±13.9a | 81.7±17.2a | 41.8±12.6a | 17.4±6.2a | 34.8±12.4a | |
| Alto | 64 | 24.8±21.4c | 12.4±12.0c | 70.3±18.3c | 45.7±15.1b | 56.9±17.5b | 29.7±14.5b | 10.6±3.1c | 20.6± 9.6c | |
| C18:0 | Bajo | 192 | 38.6±21.8a | 26.1±17.6a | 90.6±18.9a | 65.7±15.8a | 78.8±18.7a | 38.0±13.6a | 12.8±4.1b | 29.7±11.5a |
| Medio | 64 | 31.5±22.5b | 19.7±15.5b | 92.6±17.9a | 67.9±17.3a | 80.9±18.3a | 29.3±10.4b | 23.8±3.5a | 26.4±10.6b | |
| Alto | 64 | 23.6±21.4c | 12.3±13.4c | 67.3±18.1b | 45.3±17.6b | 55.1±18.4b | 27.5±14.3b | 12.8±3.3b | 18.1±11.7c |
n= número de pajillas de semen evaluadas; PT= proteínas totales; VC= vitamina C; VE= vitamina E; C18:0= ácido esteárico; MT= movilidad total (%); MP= movilidad progresiva (%); VCL= velocidad curvilínea (µm/seg); VSL= velocidad lineal (µm/seg)= VAP= velocidad media (µm/seg); IEM= integridad estructural de membrana (%); MA= morfología anormal (%); HOS= integridad funcional de membrana (%).
Niveles de componentes para PT (mg de BSA equivalente/ml): Bajo < 15.5, Medio 15.5 - 15.8, Alto > 15.8; VITC (mg/l): Bajo < 52.4, Medio 52.4 - 219.6, Alto > 219.6; VITE (mg/l): Bajo < 260.4, Medio 260.4 - 273.5, Alto > 273.5; C18:0 (%): Bajo < 25.4, Medio 24.5 - 37.2, Alto > 37.2.
abc Letras diferentes (columnas por componente) denotan diferencia (P≤0.05).
Cuadro 6 Coeficientes de correlación entre la composición del plasma seminal y la calidad espermática post-descongelación
| PT | VC | VE | C18:0 | |
|---|---|---|---|---|
| MT | -0.264* (320) | -0.134* (320) | 0.082 (288) | -0.073 (256) |
| MP | -0.354* (320) | -0.125* (320) | 0.086 (288) | -0.113 (256) |
| VCL | -0.308* (320) | 0.119* (320) | -0.054 (288) | -0.263* (256) |
| VSL | -0.263* (320) | 0.115* (320) | -0.146* (288) | -0.269* (256) |
| VAP | -0.302* (320) | 0.101 (320) | -0.093 (288) | -0.267* (256) |
| VIT | -0.289* (320) | -0.066 (320) | 0.152* (288) | -0.094 (256) |
| MA | 0.159* (320) | 0.071 (320) | -0.330* (288) | 0.090 (256) |
| IM | -0.192* (320) | -0.043 (320) | 0.065 (288) | -0.203* (256) |
PT= proteínas totales; VC= vitamina C; VE= vitamina E; C18:0= ácido esteárico MT= movilidad total (%); MP= movilidad progresiva (%); VCL= velocidad curvilínea (µm/seg); VSL= velocidad lineal (µm/seg); VAP= velocidad media (µm/seg); VIT= integridad estructural de membrana (%); MA= morfología anormal (%); IM= integridad funcional de membrana (%).
(n)= número de pares de observaciones.
*Coeficientes de correlación significativos (P≤0.05).
Se observó que un nivel medio de VE en el plasma seminal suplementado al diluyente, confiere mejores resultados en la calidad del semen descongelado, lo cual fue evidente no solo en la movilidad y cinética espermática, sino también en la integridad y funcionalidad de la membrana plasmática (Cuadro 5). Sin embargo, los coeficientes de correlación entre la VE y los parámetros de calidad seminal, no fueron significativos (P≥0.05) (Cuadro 6). Es limitada la información disponible sobre el efecto de la VE, en el semen de asnos. En un estudio donde se incluyó α-tocoferol en la dieta de burros, no se observó efecto sobre la calidad seminal36. En una investigación reciente donde se evaluó la adición de α-tocoferol en diluyentes para semen equino, no se encontró efecto sobre la calidad seminal37; sin embargo, otros autores reportaron un efecto promisorio de esta vitamina, en el mejoramiento de la integridad y la estabilidad de la membrana plasmática38. En otro estudio, el tocoferol redujo la peroxidación lipídica de semen equino sometido a periodos cortos de incubación39.
El mecanismo antioxidante del α-tocoferol consta de la donación de su hidrógeno fenólico de los radicales peroxilo, formando radicales tocoferoxilo que, a pesar de ser también radicales, no son reactivos y son incapaces de continuar la reacción oxidativa en cadena. Sin embargo, se ha descrito un efecto pro-oxidante del α-tocoferol en altas concentraciones40, que podría explicar la reducción obtenida en la calidad seminal post-descongelación, de muestras suplementadas con plasma seminal con un nivel alto de VE, respecto a aquéllas suplementadas con plasma con un nivel medio e incluso bajo de esta molécula.
Un nivel alto de PT en el plasma seminal suplementado al diluyente, coincidió con valores inferiores para diferentes parámetros de calidad del semen criopreservado (Cuadro 5). Es probable que fenómenos como la oxidación proteica descrita en el semen equino, esté relacionada con dicho efecto, toda vez que genera grupos carbonilo que se han asociado con la presencia de defectos severos en la función de los espermatozoides41. Acorde con lo anterior, se hallaron coeficientes de correlación negativos de PT con la mayoría de parámetros de calidad seminal, así como una correlación positiva con la morfología anormal (Cuadro 6). Otros autores no hallaron efecto del contenido de PT sobre la calidad seminal en caballos fértiles y subfértiles29.
Pocos reportes presentan resultados de la composición lipídica del semen en los équidos. Investigadores reportaron una concentración total de fosfolípidos en el plasma seminal equino de 28.4 ± 20.2 μmoles/100 ml42. En una investigación se encontró que el ácido graso predominante en la membrana de los espermatozoides equinos es el ácido docosopentanoico (C22: 5 n-6), que representa un 49.9 ± 8.7 % de todos los ácidos grasos, seguido por el ácido palmítico (C16:0) y el ácido esteárico (C18:0)43. Como se mencionó, en la presente investigación el C18:0 estuvo presente en la mayoría de los eyaculados, sin embargo en diferentes muestras de plasma seminal se observó un predominio proporcional de otros ácidos grasos como el ácido palmítico (C16:0), el ácido pentadecanoico (C15:0) e incluso el ácido oleico (C18:1) (Cuadro 2). Se observó que un alto nivel de esteárico en el plasma seminal suplementado al diluyente, afecta la movilidad y la cinética de los espermatozoides, así como se hallaron correlaciones negativas con la cinética y la integridad de membrana. Son escasos los estudios que aborden el análisis de la relación entre los ácidos grasos del plasma seminal y la calidad espermática de los équidos; sin embargo, se ha descrito una relación del ácido esteárico del plasma seminal, con los parámetros de movilidad del semen humano antes y después de la congelación44. De otro lado, la composición de ácidos grasos de la membrana plasmática, se ha estudiado por su valor en el diagnóstico de la congelabilidad del semen equino, donde el incremento en la rigidez de la membrana plasmática se atribuye a los ácidos grasos saturados de cadena larga, mientras los ácidos grasos con poli-insaturaciones, le otorgan a la membrana una mayor flexibilidad y fluidez45.
CONCLUSIONES E IMPLICACIONES
Existe una asociación negativa entre la concentración de vitamina C y la calidad del semen de asnos, por lo cual se atribuye un efecto deletéreo a la suplementación del diluyente de congelación, con muestras de plasma seminal con un nivel alto de VC. De igual forma, altos niveles de proteínas y ácido esteárico en el plasma seminal suplementado, se relacionan con una menor calidad seminal post-descongelación. Un nivel bajo de proteínas totales y ácido esteárico, así como un nivel medio de ambas vitaminas en el plasma seminal suplementado, favorecen en términos generales, la movilidad y la integridad de membrana post-descongelación de los espermatozoides. De acuerdo a lo anterior, se concluye que la composición del plasma seminal suplementado para la congelación de semen de asno, es determinante en la calidad espermática post-descongelación.
