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Introducción
El análisis genómico de animales domésticos se usa ampliamente para la identificación, determinación o comparación de evaluaciones genómicas intra-poblacionales, tales como la secuenciación de ADN, variación estructural, genotipado, expresión génica, o anotación de elementos regulatorios o funcionales. Los métodos para el análisis genómico típicamente demandan grandes concentraciones de ADN de alta pureza y sin contaminantes de acuerdo a la fuente donde se obtiene la muestra (tejido piloso, saliva, sangre, cartílago o semen), que pudieran influir en las metodologías para cada estudio1.
La extracción de ADN de semen, a diferencia del uso de células somáticas, considera ciertas dificultades en la metodología de purificación, como las características físicas y sobre todo químicas de la compactación nuclear en espermatozoides, la composición de la fracción no celular del eyaculado y los diluyente utilizados en la conservación de semen congelado1,2,3. Los espermatozoides contienen proteínas nucleares especializadas de bajo peso molecular denominadas protamin as, que crean una cromatina al menos seis veces más densa que las histonas de células somáticas, y que mantienen el ADN muy condensado en el acrosoma; además, la membrana plasmática se encuentra unida por enlaces disulfuro, haciéndola resistente a la desnaturalización mediante agentes químicos utilizados en los métodos tradicionales de extracción de ADN de células somáticas4,5. El acrosoma de los espermatozoides contiene hialuronidasa, enzima que ataca el ácido hialurónico al hacer contacto con el óvulo, pero en la extracción de ADN, esta enzima se libera al romperse la membrana plasmática pudiendo degradar el ADN. De manera similar, las mitocondrias del conector del espermatozoide, al ser lisado, son liberadas manteniendo su actividad oxidativa, pudiendo dañar el ADN presente en el medio6,7.
Por otra parte, la fracción no celular del eyaculado contiene diversos minerales como zinc y cobre, provenientes de la próstata, que si no se retiran de la muestra de ADN final, interfieren en la reacción en cadena de polimerasa (PCR), además del glucógeno y algunos lípidos presentes que sirven como fuente de energía6,7. Además, en el semen congelado, los diluyentes usados simulan la composición de la fracción no celular del eyaculado, por lo que al poseer en mayor medida proteínas, lípidos y minerales como Cr, Fe, Zn, Cu, Cl, K, P, Ca, Mg, Na, y S, es necesario retirarlos por completo de las muestras, previo a la extracción de los ácidos nucleicos, para evitar interferencia durante la PCR7,8,9.
La metodología propuesta en la presente técnica se estableció a partir del método de tiocianato de guanidina10 y otras técnicas para obtener ADN de muestras de semen congelado, con la calidad y cantidad requeridas por las nuevas técnicas de identificación genómica. Adicionalmente, se elimina por completo la necesidad de separar mecánicamente la proteína restante en dichas técnicas, ya que de no retirarse puede ser un factor de variabilidad en la lectura de las muestras7,10,11. El objetivo de este estudio fue modificar y evaluar una técnica que pueda desempeñarse de manera eficiente, a partir del método del tiocianato de guanidina, para obtener ADN genómico de alto peso molecular, con el fin de usarse en técnicas de identificación genómica en animales que requieren alta pureza en el rango de longitud de onda en 260/280 de 1.8 a 2.0, y de 260/ 230 de 2.0 a 2.2.
Material y métodos
El estudio se desarrolló en el Laboratorio de Genética Mol ecu lar del Departamento de Zootecnia de la Universidad Autónoma Chapingo.
Material biológico
Las muestras utilizadas para las pruebas de extracción de ADN se obtuvieron de pajillas de semen congelado comercial (0.25 ml) y caseras (0.5 ml) elaboradas en el laboratorio. Las pajillas preparadas en laboratorio se probaron con diluyentes comerciales (Triladyl, que contiene TRIS, ácido cítrico, azúcar, tampones, glicerina, agua ultrapura, y antibióticos) y yema de huevo. Las pruebas de extracción se realizaron con pajillas de semen congelado de cinco toros, uno Holstein y cuatro Jersey.
Extracción de ADN
La metodología de extracción de ADN se basó en los métodos: a) fenol-cloroformo12, b) tiocianato de guanidina, y c) el propuesto en este estudio, el cual se realizó con cada tipo de muestras de semen congelado, las cuales se lavaron con 1 ml de solución buffer salino fosfato, seguido de una centrifugación a 800 rpm por 10 min a temperatura ambiente, repetido en dos ocasiones. El pellet recuperado se incubó con 1 ml de solución de lisis (6 M tiocianato de guanidina, 30 mM citrato de sodio (pH 7.0), 0.5 % sarkosyl, 0.20 mg/ml proteinasa K y 0.3 M β-mercaptoetanol) por 4 h a 55 °C en baño maría. Al término de la incubación se recuperó el sobrenadante y se lavó con 1 ml de solución FCI (25, fenol: 24, cloroformo: 1, alcohol isoamílico), y después se centrifugó a 9,000 rpm por 10 min a 4 °C. El procedimiento se repitió con la solución de CI (24, cloroformo: 1, alcohol isoamílico), y el sobrenadante se incubó con ARNasa a 37 °C, por 30 min. Posteriormente se precipitó con isopropanol frío y 0.1 volúmenes de 3M acetato de sodio, y se incubó toda la noche a -20 °C. Se centrifugó a 9,000 rpm por 10 min a 4 °C, decantando el sobrenadante y se lavó el pellet con etanol 70% frío. Finalmente, se centrifugó y se decantó nuevamente, dejándose secar y se re-suspendió nuevamente en 50 μl de buffer TE.
Análisis de ADN
La concentración y calidad del ADN en cada uno de los tres métodos evaluados se determinó con: 1) nano-espectrofotómetro (ND-1000 Nandrop®) para determinar la concentración de ADN, relación de longitudes de onda 260/ 230 y 260/280, y 2) con electroforesis en gel de agarosa al 1% para determinar el grado de contaminación y degradación de las muestras.
Análisis estadístico
La concentración y calidad del ADN (n total= 65) obtenidos con cada uno de los tres métodos evaluados se analizaron con un modelo que inicialmente incluyó los efectos fijos de raza, individuo y la covariable volumen de semen de la pajilla. Dado que ninguno de estos efectos fueron significativos en los análisis preliminares, para el análisis final se eliminaron del modelo, el cual sólo consideró el efecto fijo de método de extracción (1= fenol cloroformo, 2 = tiocianato de guanidina, y 3= tiocianato de guanidina modificado). Los análisis se realizaron con el procedi miento GLM del programa estadístico SAS13.
Resultados y discusión
Las medias de mínimos cuadrados obtenidas en este estudio (Cuadro 1) indican diferencias entre los métodos (P<0.0001) para el rango de 260/280 y la concentración de la muestra, lo que confirma una calidad y cantidad superiores de ADN extraído con el método modificado respecto de las muestras realizadas con los métodos de Hossain et al10 y Birren et al12. Por su parte, la ausencia de diferencia estadística (P=0.0705) en el rango 260/230 evidencia la limpieza total de ARN de las muestras en los tres métodos de extracción de ADN. Dichos resultados son respaldados por los análisis con electroforesis de las muestras de ADN extraídas con los tres métodos (Figura 1).
Cuadro 1 Medias de mínimos cuadrados (±error estándar) para calidad y cantidad de ADN obtenidas con tres métodos de extracción de ADN de semen
† Birren et al, 1997; ¶ Hossain et al, 1997; § Developed in present study.
abc Least squares means with different letters in the same column are different (P<0.05).
Phenol-chloroform (lanes 1 to 4); guanidinium thiocyanate (lanes 5 to 8); and modified guanidinium thiocyanate (lanes 9 to 12). "M" lanes are 1 kb molecular weight markers.
Figura 1 Electroforesis en gel de agarosa al 1% de muestras de semen de bovino preparados con tres métodos de extracción de ADN
Las muestras obtenidas con el método de fenol cloroformo mostraron una mala calidad al analizarlas con el nano-espectrofotómetro, presentando valores de 1.47 ± 0.11 y -0.41 ± 0.41 en los rangos 260/280 y 260/230, así como una menor concentración. La electroforesis mostró ausencia de ADN, debido posiblemente a una degradación y pérdida por lavado total durante el desarrollo del protocolo. Al respecto, Hossain et al10 y Manuja et al1 observaron alta o total degradación del ADN en las muestras obtenidas con el método de fenol cloroformo12, aun cuando las calidades obtenidas por espectrofotometría fueron mayores a 1.8 para el rango 260/280, siendo una posible razón de esto la presencia de ARN y restos de proteínas de bajo peso molecular en las muestras analizadas por ambos autores.
Por otra parte, las muestras extraídas con el método de tiocianato de guanidina tuvieron mejor calidad y mayor concentración que las muestras extraídas con el método de fenol cloroformo. Sin embargo, los resultados de electroforesis mostraron una ligera degradación del ADN de las muestras y una considerable presencia de proteína en la fracción superior del gel (Figura 1, carriles 5 a 8). Hossain et al10 también observaron de ligera a nula degradación del ADN con presencia de proteína en las muestras obtenidas, debido en parte al requerimiento de separación del ADN por tracción de la proteína presente en la muestra, propiciando de esta forma una purificación incompleta de los ácidos nucleicos.
Por último, el método propuesto en este estudio produjo muestras con calidad y cantidad altamente deseables y confiables. Tanto en los resultados del nano-espectrofotómetro como en la electroforesis, la calidad en los rangos 260/ 230 y 260/280 fueron entre 1.8 y 2.2 (Cuadro 1), y poca o nula degradación del ADN aparente en la electroforesis, con ausencia de proteínas y otros factores contaminantes en las muestras, considerando que las muestras tuvieron óptimas condiciones para usarse en análisis genómicos (Figura 1, carriles 9 a 12).
La extracción de ADN con los métodos propuestos por Birren et al12 y Hossain et al10 se realizó para comparar la eficiencia de extracción de ADN de muestras de semen congelado de bovino con la metodología propuesta en este estudio. El método propuesto, adicionó un segundo lavado a las muestras con solución buffer fosfato, ya que aunque el volumen del eyaculado de la mayoría de las especies de interés zootécnico es mayor que el del humano, y la densidad es de 0.2 a 30 veces mayor6, el segundo lavado permitió incrementar la pureza del ADN extraído. Además, los eyaculados de toro, cerdo y caballo, presentan una concentración de 1.7 a 3.4 veces mayor de Cl, K, y Ca, que la del humano, y de no retirarse de las muestras de semen estos iones pueden generar resultados erróneos durante los análisis genómicos, pudiendo inclusive inhibir la amplificación de ADN por PCR7,9.
En la metodología planteada se llevaron a cabo dos lavados con solventes orgánicos, seguidos de centrifugaciones de alta velocidad, aun cuando Sambrook et al14 documentaron la dificultad de aislamiento de ADN no degradado por métodos que involucren solventes orgánicos. Además de retirar por completo la proteína presente en las muestras no degradada en pasos previos, este método permitió conservar la integridad del ADN al consolidarlo en un pellet que evita el daño químico al separarlo por completo del solvente orgánico y demás compuestos propios del eyaculado o el diluyente utilizado para conservar el semen. La inclusión del lavado fuerte (fenol:cloroformo:alcohol isoamílico) en el método, retiró las proteínas de alto peso molecular y agentes quelantes residuales presentes en las muestras; en el mismo sentido, el posterior lavado débil (cloroformo:alcohol isoamílico) retiró las proteínas de bajo peso molecular y agentes quelantes restantes después del primer lavado7,9.
Debido a que algunas muestras analizadas con el método propuesto por Hossain et al10 conservaron material de ARN, se agregó una incubación con ARNasa, asegurando de esta manera la obtención de ADN genómico puro, evitando valores imprecisos al medir las concentraciones por medio del nano-espectrofotómetro, que puedan conducir a un cálculo erróneo al momento de elaborar diluciones de las muestras de ADN para la amplificación de ADN mediante PCR7.
Finalmente, el 3 M acetato de sodio incluido en la incubación del ADN con isoprapanol a -20° C, hizo más eficiente la precipitación del ADN de la muestra, ya que aumentó el poder iónico de la solución retirando los restos de solventes orgánicos y de medicamentos provenientes del diluyente, en el caso de las muestras de semen congelado8. Las posteriores centrifugaciones, decantaciones y lavado con etanol 70% retiraron por completo los remanentes del acetato de sodio y del sarkosyl proveniente de la solución de lisis.
Conclusiones e implicaciones
El método modificado de extracción de ADN a partir de semen congelado descrito en este estudio permite obtener muestras de ADN libres de degradación, de mayor pureza y menor o nula presencia de proteínas. Además, es sencillo, barato, y la calidad y cantidad de las muestras es apropiada para la realización de análisis genómicos de ADN, como SNPs y microsatélites en mamíferos.
