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Introducción
Barbados Blackbelly es una raza de ovinos de pelo (Ovis aries) desarrollada en latitudes tropicales y bien adaptada a esas condiciones climáticas. Las hembras son precoces y prolíficas, con una larga estación reproductiva1,2. Los estudios sobre el desarrollo sexual y capacidad reproductiva de los machos Blackbelly son escasos, pese a que esta información es importante para la evaluación, selección y uso de sementales jóvenes. El desarrollo testicular es importante, ya que la capacidad reproductiva y la fertilidad de los sementales dependen principalmente de una adecuada función testicular; sin embargo, la producción espermática debe completarse con la maduración celular, la cual se realiza durante el transporte de los espermatozoides por los epidídimos3; cualquier falla del desarrollo de los epidídimos o en su función puede conducir a problemas de fertilidad, como consecuencia de trastornos en la maduración, incluso con una producción espermática adecuada4. La maduración espermática es adquirida progresiva y simultáneamente, conforme los espermatozoides recorren la cabeza y el cuerpo del epidídimo5, mientras que la cola sirve principalmente como lugar de almacenamiento de los espermatozoides funcionalmente maduros, ya que proporciona el ambiente óptimo para mantener su viabilidad durante varios días4,5,6.
La importancia funcional de la regionalización anatómica del epidídimo ha sido reconocida7, ya que las diversas regiones anatómicas tienen diferentes patrones de expresión génica y proteica, acordes con las diferentes funciones en la maduración y almacenamiento de los espermatozoides7. Es de esperarse que estas diferencias funcionales en los adultos, también estén presentes en las características morfométricas de las regiones anatómicas en etapas inmaduras, lo que podría sugerir diferentes requerimientos y mecanismos estimulatorios durante su desarrollo. Información previa sugiere que existen tales diferencias8,9; sin embargo, en el primer estudio8 la única variable evaluada fue el epitelio del epidídimo, mientras que en el segundo9, los corderos utilizados eran de una edad tal, que muchos de los cambios importantes en el desarrollo gonadal seguramente ya habían ocurrido. Una descripción anatómica detallada sería útil para responder preguntas importantes, no resueltas en los estudios anteriores; por lo tanto, el presente es un estudio exploratorio, donde se utilizaron técnicas de morfometría cuantitativa para caracterizar el desarrollo de las regiones anatómicas del epidídimo, entre el nacimiento y las 21 semanas de edad, en corderos Barbados Blackbelly.
Material y métodos
Animales y diseño experimental
Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con “International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals” (disponible en: http://www.cioms.ch/images/stories/CIOMS/IGP2012.pdf). El estudio se realizó en el estado de Querétaro, México (20° 43’ N, 100° 15’ O). Se utilizaron 43 corderos de la raza Barbados Blackbelly nacidos en verano (julio a septiembre). Los corderos se alojaron en corrales al aire libre; antes del destete, a los corderos se les ofreció una dieta que contenía 14 % de proteína cruda (78 % de sorgo, 20 % de harina de canola y 2 % de minerales); después del destete a los 75 días de edad, se alimentaron con heno de alfalfa y el concentrado ya descrito, el agua siempre estuvo ad libitum. Los corderos se asignaron a ocho grupos experimentales; los corderos de cada grupo se castraron quirúrgicamente bajo anestesia local, al nacer (antes de 3 días de edad), o bien cuando tenían 3, 6, 9, 12, 15, 18 o 21 semanas de edad (n= 4 a 6 por grupo); dentro de cada grupo la diferencia de edad nunca fue mayor a 3 días. Todas las castraciones se realizaron durante septiembre a diciembre.
Recolección y procesamiento de los tejidos
A ambos epidídimos se les retiró todo el tejido adyacente y se pesaron por separado. El epidídimo izquierdo se dividió en sus tres anatómicas, cabeza, cuerpo y cola5. Cada región se pesó y se calculó el porcentaje que representaba cada una respecto al peso total del órgano; estos porcentajes se utilizaron para estimar el peso conjunto de ambos lados para cada región. Se obtuvieron muestras del epidídimo izquierdo, de las zonas 2 (cabeza), 5 (cuerpo) y 8/9 (cola), de acuerdo con Gatti et al5, y fueron fijadas y procesadas para histología10. Se tomaron tres a cuatro cortes (5 μm) de cada muestra, se montaron en portaobjetos recubiertos con gelatina y se dejaron secar durante toda la noche a 37 °C; los cortes se tiñeron con hematoxilina-eosina y se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se llevó a cabo el análisis.
Evaluación morfométrica de los cortes de epidídimo
De cada cordero se eligieron al azar uno o dos cortes de cada región del epidídimo para ser observados bajo un microscopio de campo claro (Axiostar Plus, Carl Zeiss, México DF); se obtuvieron imágenes digitales a 100x o 200x (dependiendo de la edad del cordero y la variable evaluada) con una cámara digital (Color View II, Soft Imaging System, Lakewood CO) acoplada al microscopio. Las imágenes fueron adquiridas y procesadas utilizando un software de análisis de imágenes (AnalySIS Opti Basic, Soft Imaging System). El porcentaje de parénquima epididimal compuesto por tejido tubular en cada región se determinó en las imágenes tomadas a 100x. Cada corte se dividió en cuadrantes, un campo de cada cuadrante se eligió al azar y se le colocó un cuadrado de dimensiones conocidas (945.5 x 945.5 μm); a continuación, todos los tubos dentro del cuadrado se delimitaron y el software calculó el área tubular total en el interior del cuadrado, la cual se utilizó para obtener el porcentaje de tejido tubular. Para obtener las variables del componente tubular del tejido epididimal, se trazó el contorno de 10 cortes tubulares redondos en cada región epididimal de cada cordero, incluyendo y sin incluir la capa muscular; además, se trazó el contorno de la luz tubular. El software de análisis calculó diferentes variables, tales como el diámetro, área y perímetro tubular. Además, estos datos se utilizaron para calcular el grosor y el área de la capa muscular, la altura y el área del epitelio, y el diámetro y el área de la luz tubular en todas las regiones del epidídimo en cada cordero.
Análisis estadístico
Los 10 valores de cada región del epidídimo de cada cordero se promediaron, de esta manera, para cada cordero se obtuvo un valor único para cada región del epidídimo para el análisis estadístico. Los datos se analizaron como un diseño completamente al azar con arreglo factorial, utilizando el procedimiento GLM de SAS (SAS Institute Inc., Cary NC, USA). La edad de los animales, la región anatómica y la interacción edad por región se incluyeron en el modelo; la opción PDIFF de SAS se utilizó para comparar las medias de mínimos cuadrados entre los grupos de edad y entre las regiones. Para cumplir con los supuestos del análisis de varianza, los datos porcentuales, expresados como proporciones (p), se transformaron al arco-seno de la raíz cuadrada de p; todas las demás variables se transformaron a logn. Después del análisis, los datos se retransformaron a los valores reales para los cuadros y figuras.
Resultados
Peso de los epidídimos
La siguiente descripción considera el peso de ambos epidídimos. Las diferencias entre edades para el peso de los epidídimos siempre fueron significativas (P<0.05), excepto 0 vs 3, y 18 vs 21 semanas. Al nacimiento, el peso de los epidídimos fue de 0.93 ± 0.07 g (Figura 1), durante las primeras 9 semanas aumentó 5.4 veces (5 ± 0.49 g); La mayor tasa de crecimiento se observó entre las semanas 9 y 18 (4.7 veces), hasta llegar a 25.6 ± 2.5 g en la semana 21. La interacción región x edad fue significativa (P<0.001); el peso de cada región del epidídimo siguió una tendencia similar (Figura 1), pero con algunas diferencias entre regiones. El cuerpo del epidídimo siempre fue más ligero que la cola (P<0.01), y más ligero que la cabeza de la semana 6 en adelante (P<0.01), de 0.14 ± 0.01 g al nacer a 4.6 ± 0.31 g en la semana 21. Al nacimiento, el peso de la cabeza (0.34 ± 0.03 g) y de la cola (0.44 ± 0.03 g) no fueron diferentes entre sí, al igual que en la semana 3. Entre las semana 6 y 12, el peso de la cola aumentó más rápido y fue mayor que la cabeza (P<0.01). Después de la semana 12, el peso de la cabeza aumentó, de tal manera que en las semana 15 a 21 no se detectaron diferencias entre las dos regiones (cabeza 10.7 ± 1.03 g; cola 10.3 ± 0.89 g en la semana 21).
Figura 1 Desarrollo del peso total y de cada región anatómica de ambos epidídimos, del nacimiento a 21 semanas de edad de corderos Barbados Blackbelly.
El diferente desarrollo de las regiones del epidídimo también fue evidente en el porcentaje que cada región aportó al peso total del órgano (interacción edad x región, P<0.001; Figura 2). La proporción aportada por la cabeza disminuyó entre el nacimiento (36.7 %) y la semana 9 (28 %, P<0.001), después aumentó hasta la semana 15 (P<0.05), sin más cambios a partir de entonces hasta la semana 21 (41.7 %). La cola siguió una tendencia opuesta, aumentó entre el nacimiento (47.8 %) y la semana 6 (58.5 %; P<0.001), con una disminución entre las semanas 9 y 15 (P<0.001), sin más cambios a partir de entonces hasta la semana 21 (40.3 %). La cola fue mayor que las otras regiones desde el nacimiento hasta la semana 12 (P<0.001), y no fue diferente de la cabeza en las semanas 15, 18 y 21; el cuerpo siempre aportó el menor porcentaje (P<0.001).
Características del tejido epididimal
Porcentaje de tejido tubular y diámetro tubular. La interacción edad por región fue significativa (P<0.05) para el porcentaje de tejido tubular; esta variable tuvo una tendencia creciente en las tres regiones del epidídimo hasta la semana 15 (Cuadro 1); después, no cambió (cabeza y cuerpo) o disminuyó (cola) hacia la semana 21. En general, el porcentaje de tejido tubular fue mayor en la cola y menor en la cabeza (P<0.05), a excepción de las semanas 3, 18 y 21, cuando no se detectaron diferencias entre las regiones; el cuerpo fue intermedio, pero no siempre fue diferente de las otras regiones. La tasa de incremento (porcentaje de cada edad, con relación a la semana 21) fue diferente entre las regiones (Figura 3a); en la semana 6, el cuerpo y la cola habían alcanzado, respectivamente, el 93 y el 88 % del valor final, mientras que la cabeza alcanzó sólo el 68 %, tal tendencia se mantuvo hasta la semana 15. Para el diámetro tubular, la interacción edad por región no fue significativa (P=0.13; Cuadro 1). Esta variable aumentó (P<0.05) hasta la semana 15 (cabeza y cuerpo) o 12 (cola), sin cambios a partir de entonces. El mayor diámetro siempre se observó en la cola, y el menor en la cabeza (P<0.05); el cuerpo no fue diferente de la cabeza, a excepción de las semanas 3 y 6, cuando todas las regiones fueron diferentes entre sí. En cuanto a la tasa de incremento (Figura 3b), en la semana 6, la cabeza, el cuerpo y la cola habían alcanzado, respectivamente, 38, 47 y 55 % de sus valores finales; diferencias similares se mantuvieron hasta la semana 12; a esa edad la cola había alcanzado el 92 %, mientras que porcentajes similares (90 %) no se alcanzaron en la cabeza y el cuerpo hasta las 18 semanas de edad.
Cuadro 1 Medias (± EE) del porcentaje de tejido tubular y del diámetro tubular promedio en las diferentes regiones anatómicas del epidídimo de corderos Barbados Blackbelly, del nacimiento a 21 semanas de edad.
Figura 3 Tasa de incremento relativo del porcentaje de tejido tubular (panel a), diámetro tubular (panel b), altura del epitelio (panel c) y área del epitelio (panel d) en corderos Barbados Blackbelly.
Capa muscular del epidídimo. La interacción edad por región fue significativa (P<0.01) para ambas variables de la capa muscular. El grosor de la capa muscular en la cabeza no cambió entre el nacimiento y la semana 6 (Cuadro 2), aumentó 35 % en la semana 9 (P<0.05), posteriormente no cambió o tuvo una tendencia descendente hasta la semana 21. En la cola, el grosor de la capa muscular no cambió entre el nacimiento y la semana 6, aumentó 119 % en la semana 9 (P<0.05), sin cambios hacia la semana 15 y una tendencia descendente a partir de entonces (P<0.05). En el cuerpo del epidídimo no hubo cambios entre la semana 3 y 21. Al comparar el grosor de la capa muscular en la semana 0 vs 21, no se observaron diferencias en la cabeza y cuerpo, pero en la cola fue 48 % mayor en la semana 21 (P<0.05). El área de la capa muscular (Cuadro 2) aumentó hasta la semana 12 (cabeza y cuerpo) y 9 (cola), sin cambios significativos a partir de entonces; El área máxima observada en cada región, en comparación con el valor al nacimiento, fue 3.8, 3.8 y 5.5 veces, para cabeza (semana 18), cuerpo (semana 18) y cola (semana 15), respectivamente. Las comparaciones entre regiones fueron similares en ambas variables, los mayores valores se observaron en la cola (P<0.05), seguido por el cuerpo y la cabeza; sin embargo, las diferencias entre los dos últimos fueron significativas (P<0.05) solamente en las semanas 3 y 6.
Cuadro 2 Medias (± EE) del grosor y área de la capa muscular del tubo en las diferentes regiones anatómicas del epidídimo de corderos Barbados Blackbelly, del nacimiento a 21 semanas de edad.
Epitelio del epidídimo. La interacción edad por región fue significativa (P<0.001) para ambas variables de la capa epitelial. En la cabeza y cuerpo, la altura del epitelio no cambió entre el nacimiento y la semana 6, luego aumentó hasta la semana 12 (cabeza) o 15 (cuerpo), sin más cambios (Cuadro 3); en la cola, se observó una tendencia creciente desde el nacimiento hasta la semana 9, seguido de una disminución en la semana 12, sin más cambios hasta la semana 21. La comparación entre regiones tuvo dos fases diferentes, del nacimiento a la semana 9, el epitelio fue más alto en la cola y más bajo en la cabeza (P<0.05), pero de la semana 12 a la 21 la situación se invirtió, ya que los valores más bajos se observaron en la cola (P<0.05) y los mayores en la cabeza y cuerpo, sin diferencias entre estos dos. En cuanto a la tasa de incremento (Figura 3c), al nacer la cola tenía más del 45 % de su valor máximo, que se alcanzó en la semana 9; la cabeza y el cuerpo al nacer habían alcanzado, respectivamente, el 20 y 25 % del valor de la semana 21, y no rebasaron el 90 % hasta la semana 15. El área epitelial (Cuadro 3) no cambió entre el nacimiento y la semana 6 (cabeza y cuerpo) o 3 (cola), seguido de un incremento hasta la semana 15 en las tres regiones (P<0.05), sin más cambios posteriores (Cuadro 3). Entre el nacimiento y la semana 12, los mayores valores se observaron en la cola, con los menores valores en la cabeza (P<0.05); desde la semana 15 en adelante no se detectaron diferencias entre las regiones. La tasa de incremento fue siempre mayor en la cola (Figura 3d), hacia la semana 6 ya había alcanzado el 31 %, en comparación con el 5 y 8 % de la cabeza y el cuerpo, respectivamente; estas diferencias se mantuvieron hasta la semana 18.
Cuadro 3 Medias (± EE) de la altura y el área del epitelio tubular en las diferentes regiones anatómicas del epidídimo de corderos Barbados Blackbelly, del nacimiento a 21 semanas de edad.
Luz tubular del epidídimo. La interacción edad por región no fue significativa (P³0.25) para ambas variables de la luz tubular, pero sí el efecto de la región (P<0.001). El diámetro y el área de la luz no aumentaron o aumentaron muy poco en las tres regiones hasta la semana 6; a partir de entonces, aumentaron constantemente hasta la semana 15 (cabeza y cuerpo) o 12 (cola), sin más cambios (Cuadro 4). El mayor aumento relativo se observó entre las semanas 9 y 12 (0.5 a 1.2 veces en el diámetro de la luz, y 1.3 a 5.2 veces en el área de la luz), con el mayor aumento en la cola; ambas variables fueron mayores en la cola en todas las edades (P<0.05), sin diferencias entre cabeza y cuerpo. El máximo diámetro de la luz observado en cada región (cabeza, cuerpo y cola, respectivamente) correspondió a un aumento de 3.7, 3.5 y 5.2 veces, en comparación con la semana 0. Del mismo modo, el aumento en el área de la luz representó 21.8, 21.2 y 24.9 veces, en comparación con la semana 0, para la cabeza, cuerpo y cola, respectivamente. Los espermatozoides aparecieron por primera vez en la luz tubular de las tres regiones del epidídimo en la semana 18 (flechas en las Figuras 1 y 2), lo cual indica que a esa edad los corderos ya habían alcanzado o estaban muy cerca de alcanzar la pubertad.
Discusión
El crecimiento de los epidídimos siguió una tendencia paralela al desarrollo de los testículos, de acuerdo a lo publicado para corderos Blackbelly10; el mayor crecimiento relativo de los epidídimos se observó entre las 9 y 18 semanas de edad, lo que coincide con la mayor tasa de crecimiento testicular en esta raza10,11. Durante esa fase de desarrollo, el aumento absoluto del tejido intersticial en los testículos se asocia con aumento en el número de células de Leydig y con el desarrollo de su capacidad esteroidogénica12; esto, a su vez, conduce a un aumento en las concentraciones plasmáticas de testosterona10,13 y por lo tanto a una mayor estimulación de lo epidídimos, ya que el desarrollo y la función de estos órganos depende del aporte adecuado de andrógenos14,15.
El componente funcional del epidídimo es el tejido tubular, ya que todos los cambios relacionados con la maduración y almacenamiento de los espermatozoides durante su tránsito por el epidídimo se llevan a cabo en el compartimiento luminal, dentro de un microambiente altamente especializado, consecuencia de la actividad epitelial4,5. Para lograr esta tarea, el epitelio debe estar estructurado de tal manera que pueda prevenir y regular la entrada de sustancias a la luz, además de tener la capacidad de sintetizar, secretar y absorber componentes, permitiendo que los espermatozoides entren en contacto con el entorno adecuado y en el momento exacto16. Por lo tanto, es razonable considerar las variables relacionadas con el tejido tubular y la capa epitelial como las más convenientes para evaluar el desarrollo epididimal a nivel microscópico; tales variables se han utilizado para evaluar la función del epidídimo en varios modelos experimentales15,17,18.
A nivel macroscópico (peso y contribución relativa al peso total del órgano), el desarrollo de las diversas regiones anatómicas de los epidídimos siguieron una tendencia diferente entre ellos; la cola del epidídimo comenzó a desarrollarse a una edad muy temprana (semana 6), mientras que el mayor desarrollo de la cabeza y el cuerpo inició en la semana 12. Los hallazgos en el presente estudio, tanto en el macroscópico como en el microscópico, sugieren que el desarrollo posnatal de los epidídimos va en dirección de la cola hacia la cabeza, lo cual coincide con lo publicado para otras especies, tales como bovinos19, cabras17 y ratas16. En los ovinos existe cierta discrepancia en este asunto; mientras que algunos autores observaron una tendencia similar a la encontrada en el presente estudio8, otros9 reportaron que el proceso de maduración avanzó en dirección de la cabeza a la cola. Es muy probable que la edad de los animales experimentales utilizados en los diferentes estudios explique la variación de los resultados observados. En el estudio de Bielli9, los corderos eran mayores (90 a 180 días de edad, es decir, 12.9 a 25.7 semanas), en comparación con los corderos del estudio de Nilnophakoon8 (1 a 18 semanas) y el presente (nacimiento a 21 semanas). Este hecho determina diferencias importantes en el estado de madurez fisiológica de los corderos al inicio de los estudios, ya que entre el nacimiento y 12 semanas de edad se producen cambios anatómicos y fisiológicos muy importantes en los testículos y epidídimos10,13.
La función del epidídimo no depende únicamente de la estimulación endocrina recibida por la testosterona sanguínea; aún más importante podría ser el llamado sistema lumicrino7,15, dado por la testosterona y otros factores15,16. La testosterona, unida a la proteína ligadora de andrógenos (ABP), llega a los epidídimos vía los conductos eferentes, donde se convierte en dihidrotestosterona20. Adicionalmente, varios factores de crecimiento contenidos en el fluido tubular tienen efectos importantes sobre la función del epidídimo15,16,21; estos factores se producen en las células de Sertoli, dentro de los túbulos seminíferos22 y son transportados a los epidídimos a través del sistema de conductos. Posteriormente, la composición del fluido sufre modificaciones conforme viaja por el epidídimo5,16. Tal regulación lumicrina es posible sólo después de que aparece la luz de los túbulos seminíferos, como resultado del aumento de la secreción de líquido por las células de Sertoli, cuando inician el proceso de maduración para adquirir la capacidad funcional como células adultas22. En corderos Blackbelly la luz de los túbulos seminíferos aparece después de las 9 semanas de edad, y hacia la semana 12 ya está presente en el 80 % de los túbulos evaluados10. Este hallazgo coincide con la etapa de mayor aumento en el peso de los epidídimos, y con el mayor aumento de la altura del epitelio en la cabeza y el cuerpo, observado en el presente estudio, lo cual concuerda con hallazgos anteriores en ovinos8 y caprinos23.
La cola del epidídimo comenzó a desarrollarse antes del acelerado crecimiento de los testículos10. En ese momento todavía no existe una contribución del fluido tubular a través del sistema de conductos, debido a que la luz de los túbulos seminíferos no se ha formado todavía10. Tales hallazgos sugieren que el desarrollo inicial de la cola del epidídimo podría no depender de la presencia de testosterona u otros factores procedentes del sistema tubular testicular. Evidencias adicionales que apoyan esta posibilidad se han presentado en estudios con machos cabríos adultos, cuyos conductos eferentes fueron ligados23; en estos animales fue evidente la falta de dependencia morfológica y funcional de la cola del epidídimo hacia las secreciones procedentes de los testículos, a través del sistema de conductos extra testiculares23. Cuando la cola del epidídimo comenzó a desarrollarse, la concentración plasmática de testosterona debió haber sido muy baja10,13; por lo tanto, el desarrollo inicial de la cola puede no depender de concentraciones altas de testosterona, o bien, depender de otros esteroides predominantes diferentes a la testosterona, como la androstenediona, cuyas concentraciones circulantes son mayores a esa edad24,25,26. También existe la posibilidad de que el umbral de respuesta de la cola del epidídimo a la testosterona y a otros andrógenos circulantes sea menor a esa edad.
Conclusiones e implicaciones
En conclusión, los datos del presente estudio indican que el desarrollo del epidídimo en ovinos es regionalizado, en dirección de la cola a la cabeza, es decir, la cola comenzó a desarrollarse antes que las otras regiones anatómicas. Es probable que el desarrollo de la cola del epidídimo debió haber comenzado antes del aumento de las concentraciones de testosterona en el plasma sanguíneo, y antes de la aparición de la luz de los túbulos seminíferos; en contraste, el desarrollo de la cabeza y el cuerpo debió coincidir en tiempo, con el aumento de la capacidad esteroidogénica de los testículos y con la secreción de los fluidos tubulares. Estos hallazgos sugieren que las diversas regiones anatómicas del epidídimo tienen diferentes requisitos de estimulación endocrina y lumicrina para su desarrollo normal.
