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Análisis de PCR-RFLP del gen de leptina y su asociación con características de la leche en ganado nativo (Bos indicus) de Irán

 

PCR-RFLP analysis of leptin gene and its association with milk traits in native cattle of Iran (Bos indicus)

 

Mojtaba Rezaei^a, Seyed Ziaeddin Mirhosseini^a, Navid Ohavi Hossein-Zadeh^a

 

^a Department of Animal Science, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran, Tel) +989119661711, mojtaba.rezaee1@gmail.com. Correspondencia al primer autor.

 

Recibido el 19 de junio de 2014.
Aceptado el 28 de julio de 2014.

 

Resumen

Se utilizó una muestra ganadera experimental para la caracterización de los genes y las frecuencias genotípicas y evaluar la asociación entre los polimorfismos de longitud del fragmento de restricción BsaAI en el gen de leptina y las características lácteas. Se recolectaron muestras de sangre de 390 vacas proporcionadas por el censo ganadero de la provincia de Guilán en Irán. La extracción de ADN genómico se basó en el método modificado de precipitación salina. El fragmento de 522 bp que comprende la región parcial del exón 3 e intrón 2 del locus del gen de leptina se amplificó mediante PCR-RFLP e iniciadores específicos. La digestión del fragmento amplificado con la enzima de restricción BsaAI reveló dos alelos de A y B con frecuencias de 0.447 y 0.553, y tres genotipos de AA, AB, BB con frecuencias de 0.185, 0.526 y 0.289 en la población estudiada, respectivamente. El resultado del contenido de polimorfismo fue 0.372 y para heterocigosis 0.526. Los resultados demostraron que la población estudiada estaba en equilibrio Hardy-Weinberg. El análisis estadístico indicó que el polimorfismo LEP-BsaAI tiene un efecto significativo en la producción de leche, porcentaje de grasa y proteína de la leche (P<0.01). Animales portadores del genotipo heterocigoto (AB) produjeron 1.17 y 0.7 kg/d más leche que los animales homocigotos AA y BB, respectivamente. Los animales con el genotipo AA tuvieron mayor grasa (0.28 %) y porcentaje de proteína (0.17 %) que el genotipo AB. Tales resultados pueden utilizarse como criterios para facilitar la selección genética en los programas de cría animal.

Palabras clave: DNA, Polimorfismo, Producción de leche, RFLP.

 

Abstract

An experimental cattle population was screened for characterization of gene and genotypic frequencies, and association between BsaAI restriction fragment length polymorphisms in the leptin gene and milk traits. Blood samples were collected from 390 cows provided by census herds of Guilan province in Iran. The extraction of genomic DNA was based on modified Salting Out method. The 522 bp fragment comprising the partial intron 2 and exon 3 region of leptin gene locus was amplified using PCR-RFLP and specific primers. Digestion of amplified fragment with restriction enzyme BsaAI revealed two alleles of A and B with frequencies of 0.447 and 0.553 and three genotypes of AA, AB and BB with frequencies of 0.185, 0.526 and 0.289 in the studied population, respectively. Polymorphism information content was 0.372 and heterozygosity was 0.526. The chi-square test results showed that the studied population was in Hardy-Weinberg equilibrium. The impact of Leptin genotypes on milk traits was conducted based on a linear model of SAS software using least squares means methods. Statistical analyses indicated that the LEP-BsaAI polymorphism has a significant effect on milk yield, milk fat and protein percentage (P<0.01). Animals carrying the heterozygous genotype (AB) produced 1.17 and 0.7 kg/d more milk than the homozygous AA and BB animals, respectively. Animals with the AA genotype had higher fat (0.28 %) and protein (0.17 %) percentage than AB genotype. Such results may be used as a selection criterion to facilitate genetic selection in animal breeding programs.

Key words: DNA polymorphism, Local cattle, Milk yield, RFLP.

 

INTRODUCCIÓN

Variaciones a nivel de ADN contribuyen a la caracterización genética de las poblaciones ganaderas, y esto puede ayudar a identificar posibles eventos de hibridación y últimas tendencias evolutivas. En ganadería, tales variaciones en el ADN también pueden estar asociadas con, o ligadas a los rasgos económicos, que son gobernados por muchos genes, cada uno con un pequeño efecto⁽¹⁾. Esos genes principales suelen estar involucrados en la biología de un rasgo, y son los genes candidatos para identificar marcadores⁽²⁾. También existe la posibilidad de que genes mayores puedan estar relacionados con algunos loci de rasgos cuantitativos (QTL), contribuyendo a la mayor parte de la variación en los rasgos.

La leptina es una hormona peptídica de 16 kDa que se sintetiza principalmente en el tejido adiposo y afecta diversos procesos en el cuerpo. Está íntimamente involucrada en el crecimiento y metabolismo de los animales, desempeña un papel importante en la regulación del consumo de alimento, metabolismo de energía, crecimiento, producción de leche y reproducción del ganado^(3,4). Por lo tanto, el gen de leptina es un candidato potencial para estudios de QTL. En Bos indicus el gen de leptina (LEP) está situado en el cromosoma somático 4 (número de adhesión: Y11369). Este gen fue completamente secuenciado y consta de tres exones y dos intrones, de los cuales sólo dos exones se traducen en proteina⁽⁵⁾.

En el ganado lechero, los genes asociados al desarrollo, crecimiento y función de la glándula mamaria son genes candidatos para características de producción de leche. En consecuencia, el gen también puede afectar a rasgos tales como consumo de alimento⁽⁶⁾, producción y composición de leche^(7,8,9,10), producción de carne en canal y calidad cárnica^(11,12,13) y comportamiento reproductivo^(14,15), que son importantes para la cría de ganado. Puesto que la leptina puede desempeñar un papel importante en los procesos que ocurren durante la lactancia en vacas lecheras, la utilización de este gen como un candidato o un marcador genético en programas de selección para características de producción en el ganado nativo, podría ser una opción prometedora. Los objetivos de este estudio fueron la caracterización del gen y las frecuencias genotípicas, y evaluar la asociación entre BsaAI-RFLP en el gen de leptina con rendimiento de características de la leche de ganado criollo en Guilán, Irán.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Se recolectaron muestras de sangre de la vena yugular de 390 vacas nativas Bos indicus escogidas al azar de cuatro regiones (Fouman= 162, Rasht= 98, Astaneh= 85 y Lahijan= 45) pertenecientes a los hatos de la provincia de Guilán en Irán, utilizando tubos vacutainer con anticoagulante EDTA. Las muestras se transportaron inmediatamente al laboratorio en un congelador y almacenadas a -20 °C para su posterior extracción de ADN. El ADN genómico se extrajo de leucocitos sanguíneos mediante la optimización del método modificado de precipitación salina⁽¹⁶⁾. Se evaluó la calidad y cantidad de muestras extraídas por electroforesis en gel de agarosa al 0.8% y el método de espectrofotometría, que confirmaron la concentración adecuada y la pureza de las muestras de ADN para la reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Un fragmento de 522 bp compuesto parcialmente por intrón 2 y el exón 3 del gen leptina se amplificó por PCR usando iniciadores específicos (Cuadro 1), según lo sugerido por Lien et al⁽¹⁷⁾ quienes describieron por primera vez la sustitución de la guanina (G) por adenina (A) en el intrón 2 del gen de leptina de ganado Noruego. Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen final de 25 μl con una concentración final de 50-100 ng de ADN genómico, 1x amortiguador PCR, 10 pmol de cada iniciador, 100 μΜ dNTP Mix, 1.5 mM MgCl₂, 1 unidad taq de ADN polimerasa y ddH2O. El perfil térmico del proceso consistió en un paso de desnaturalización inicial por 3 min a 94 °C, seguido de 35 ciclos (desnaturalización a 94 °C por 30 seg, iniciador recalentado a 62 °C durante 35 seg y extensión a 72 °C por 1 min) y una extensión final a 72 °C durante 10 min. Los productos de PCR se separaron y se reconocieron por electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % teñido con bromuro de etidio. Los genotipos del gen de leptina se determinaron mediante la técnica de PCR-RFLP. El estudio del polimorfismo del gen de leptina y la digestión de los productos de PCR se realizaron con la enzima de restricción BsaAI (Ppu21I) que identifica secuencias 5' AC"!GT 3'. Fragmentos amplificados fueron digeridos por la enzima BsaAI a 30 °C durante 3 h con la siguiente mezcla reactiva: 8 μl del producto de PCR, 3 μl del amortiguador de digestión 10X, 5 U (0.5 μl) enzima de restricción y 8 μl de agua desionizada. Los productos de digestión se separaron por electroforesis horizontal (70 voltios, 110 min) en gel de agarosa al 3 %, teñido con bromuro de etidio, y el tamaño de los fragmentos digeridos se reconoció por marcadores pBR322/BsuRI de ADN; los genotipos se determinaron basados en la diferencia de tamaño de los fragmentos en el gel.

En este estudio se utilizaron registros diarios de 390 vacas con diferentes días de lactación en el hato del censo recogido y verificado por la organización agrícola de Guilán. En el Cuadro 2 se presenta el resumen estadístico de las características de la leche en la población estudiada.

Las frecuencias de alelos y genotipos dentro de las poblaciones y la prueba de Ji cuadrada (X²) se realizaron utilizando Pop Gene V. 1.32⁽¹⁸⁾. En el modelo lineal general (GLM) se utilizó el procedimiento de SAS 9.1⁽¹⁹⁾ para probar las asociaciones entre diferentes genotipos y componentes de la leche; la diferencia entre las medias de cuadrados mínimos de las características estudiadas para los genotipos del gen de leptina se compararon usando el método de Tukey-Kramer. El siguiente modelo estadístico se utilizó para evaluar la asociación entre genotipos de leptina y los componentes lácteos:

Donde: Y_ijklmno es el valor observado de los componentes lácteos (producción de leche, porcentajes de grasa y proteína); μ es la media general de la población para los diferentes parámetros; G_i es el efecto fijo del genotipo leptina (i= 1, 2 and 3); Rj es el efecto fijo de región (j= 1, 2 and 3); Pk es el efecto fijo de paridad (k= 1, 2, ... and 7); YC_l es el efecto fijo de año de parto (l= 2006-2012); SC_m es el efecto fijo para época de parto (m= 1, 2 ,3 y 4); b_1n es el coeficiente de regresión lineal de componentes lácteos sobre edad al parto; Age_n es el efecto de covarianza lineal de la edad al parto (o= 30-140 meses); es el promedio de edad al parto de la población; y e_ijklmno es el efecto aleatorio residual.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La extracción de ADN de la sangre en todas las muestras se completó exitosamente. Los resultados de electroforesis mostraron que la calidad del ADN extraído fue apropiada para PCR. La electroforesis de los productos PCR en gel de agarosa al 1.5 % demostró que los iniciadores diseñados actuaron bien y produjeron fragmentos específicos para el gen leptina de 522 bp de longitud. La digestión del fragmento de 522 bp del locus del gen leptina con la enzima de restricción BsaAI causó dos patrones de digestión, incluyendo el patrón A, un fragmento intacto de 522 bp (sin sitio de corte de la enzima) y un patrón B que exhibió fragmentos de 441 y 81 bp. Los resultados del presente estudio en la digestión de la enzima y longitud del fragmento observado concuerdan con los del ganado Noruego⁽¹⁷⁾ y el Indio Bos indicus y Bos tauruá²⁰). La Figura 1 muestra la separación de fragmentos 522, 441 y 81 bp y el patrón de restricción de tres genotipos AA, AB y BB sobre la digestión del locus leptina usando la enzima de restricción BsaAI.

En el Cuadro 3 se presentan las frecuencias genotípicas y alélicas para el polimorfismo BsaAI-RFLP del gen leptina. Los resultados indicaron que la frecuencia del alelo B (0.553) fue la más alta en las cuatro regiones, mientras que la más grande y la más baja frecuencia genotípica fueron para AB (0.526) y AA (0.185).

La prueba de X² (2.77<5.99) confirmó el equilibrio de Hardy-Weinberg en las poblaciones estudiadas para el locus de leptina. Esto significa que existen características de una población en equilibrio como la falta de selección, migración, mutación y derivación genética. Las posibles razones pueden ser debidas a los apareamientos aleatorios y a la falta de intercambio genético con otras poblaciones.

En el Cuadro 4 se muestran los efectos de los genotipos para el gen de leptina sobre las características de la leche. La comparación de medias de cuadrados mínimos de diferentes genotipos de características de la leche mostraron diferencias significativas entre los genotipos (P<0.01). Según los resultados actuales, una vaca con genotipo AB se asoció con mayor producción de leche y menos porcentaje de grasa y proteína en comparación a las vacas de otros genotipos. Las razones pueden ser debidas a la correlación negativa entre la producción de leche, y porcentajes de grasa y proteína en el ganado. De hecho, estos rasgos son sensibles a la selección, y la selección para aumentar la producción de leche disminuirá el porcentaje de grasa de la leche⁽²¹⁾. Además, el genotipo AB resultó en mayor producción de leche con 1.17 y 0.7 kg/d de los genotipos AA y BB, respectivamente, mientras que el genotipo AA tenía más porcentaje de grasa y proteína que los otros genotipos (Cuadro 4; P<0.01). Por otra parte, no hubo ninguna diferencia significativa entre genotipos AB y BB para el porcentaje de grasa y entre los genotipos AA y BB para el porcentaje de proteína (P>0.05).

Los resultados del estudio fueron acordes con los informes más publicados sobre los efectos de genotipos de la leptina en características productivas. Consistente con los resultados del presente estudio, se demostraron tendencias y asociaciones positivas entre diferentes polimorfismos del gen leptina y la producción y composición de leche, balance energético, consumo de alimento y fertilidad en novillas Holstein; las novillas con el genotipo Sau3AI-AB produjeron 1.32 kg/día más leche, y consumieron 0.73 kg/día más alimento en comparación con el genotipo Sau3AI-AA. Además, estas novillas con genotipo AB tuvieron mejor fertilidad que el genotipo AA⁽⁶⁾. Así mismo se informó de los efectos positivos del genotipo TT versus genotipo CC en el exón 2 del gen leptina con mayor producción diaria de leche (1.5 kg/día), especialmente en el inicio de la lactancia (2.44 kg/día). En contraste, Buchanan et al⁽⁸⁾ no encontraron ningún efecto significativo sobre los porcentajes de proteína o grasa de leche en todo el periodo de la lactación⁽⁸⁾. En una revisión en vacas Holstein de Irán se informó diferencia significativa entre genotipos Sau3AI-AB y Sau3AI-AA para características de producción de leche a 305 días y comportamiento reproductivo (P<0.05); y también se demostró que el alelo RFLP B puede producir más leche a 305 días, con una tendencia a mejorar el comportamiento reproductivo⁽²²⁾.

Adicionalmente, el polimorfismo de HphI en el exón 3 tuvo efecto significativo sobre la producción leche y la proteína⁽⁹⁾. El polimorfismo en el exón 3 del gen leptina se examinó en vacas Holstein y se expresó que consideraba el polimorfismo significativamente asociado con la producción de leche; por lo tanto, se indicó que la mayor y la menor producción de leche se relacionaron con el genotipo GG (BB en este estudio) y genotipo AA, respectivamente⁽²³⁾. Se encontró que el polimorfismo Lep-Sau3AI en el intrón 2 se asocia con la grasa de la leche; en la población evaluada, los animales con genotipo AA tuvieron menor producción de grasa de leche que el genotipo AB⁽¹⁰⁾. Variación en la región exónica de un gen puede conducir a cambios en los aminoácidos que alteran la proteína expresada, y aunque la variación intrónica no cambia la secuencia de aminoácidos de la proteína, puede jugar un papel significativo en la manipulación genética o la unión de proteínas reguladoras durante la transcripción, que puede estar relacionada con ventajas económicas.

 

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

Ciertas asociaciones significativas encontradas en este estudio pueden apoyar el desarrollo de programas que usan información molecular en los loci del gen leptina para la evaluación genética de animales para producción de leche. Los resultados de investigaciones más recientes sugieren que la ventaja de rendimiento de leche en vacas de genotipo AB podría representar una importante ventaja económica para los productores lecheros. Puede ser debido al acoplamiento genético entre genes de leptina y los genes que se asocian con rasgos de producción. Parecería que la evaluación de varios polimorfismos de genes candidato al mismo tiempo sobre las características funcionales puede demostrar una mejor comprensión del impacto de estos genes.

 

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado financieramente por la Universidad de Guilán, Irán.

 

LITERATURA CITADA

1. Gelderman H. Investigations on inheritance of quantitative characters in animals by gene markers. Methods Theor Appl Gen 1997;46:319-330.         [ Links ]

2. Sadeghi M, Moradi Shahr Babak M, Rahimi G, Nejati Javaremi A. Effect of leptin gene polymorphism on the breeding value of milk production traits in Iranian Holstein. Inter J Anim Bios 2008;2(7):999-1002.         [ Links ]

3. Ramsay TG, Cranwell PD. A review - Leptin: A regulator of feed intake and physiology in swine. Proc Seventh Biennial Conf Australasian Pig Sci Assoc (APSA), Adelaide, Australia. 1999:157-170.         [ Links ]

4. Block SS, Butler WR, Ehrhardt RA, Bell AW, van Amburgh ME, Boisclair YR. Decreased concentration of plasma leptin in periparturient dairy cows is caused by negative energy balance. J Endocrinol 2001;171:339-348.         [ Links ]

5. Stone RT, Kappes SM, Beattie CW. The bovine homolog of the obese gene maps to chromosome 4. Mamm Genome 1996;(7):399-400.         [ Links ]

6. Liefers SC, Te Pas MF, Veerkamp RF, Van der Lende T. Associations between leptin gene polymorphisms and production, live weight, energy balance, feed intake and fertility in Holstein heifers. J Dairy Sci 2002;85(6):1633-1638.         [ Links ]

7. Silva LF, VandeHaar MJ, Weber Nielsen MS, Smith GW. Evidence for a local effect of leptin in bovine mammary gland. J Dairy Sci 2002;85:3277-3286.         [ Links ]

8. Buchanan FC, Van Kessel AG, Waldner C, Christensen DA, Laarveld B, Schmutz SM. Hot topic: An association between a leptin single nucleotide polymorphism and milk and protein yield. J Dairy Sci 2003;86(10):3164-3166.         [ Links ]

9. Madeja Z, Adamowicz T, Chmurzynska A, Jankowski T, Melonek J, Switonski M, Strabel T. Short communication: effect of leptin gene polymorphisms on breeding value for milk production traits. J Dairy Sci 2004;87:3925-3927.         [ Links ]

10. Javanmard A, Khaledi K, Asadzadeh N, Solimanifarjam AR. Detection of polymorphisms in the bovine leptin (Lep) gene: Association of single nucleotide polymorphism with breeding value of milk traits in Iranian Holstein cattle. J Mol Genet 2010;2:10-14.         [ Links ]

11. Buchanan FC, Fitzsimmons CJ, Van Kessel AG, Thue TD, Winkelman-Sim C, Schmutz SM. Association of a missense mutation in the bovine leptin gene with carcass fat content and leptin mRNA levels. Genet Sel Evol 2002;34:105-116.         [ Links ]

12. Kononoff PJ, Deobald HM, Stewart EL, Laycock AD, Marquess FL. The effect of a leptin single nucleotide polymorphism on quality grade, yield grade and carcass weight of beef cattle. J Anim Sci 2005;83:927-932.         [ Links ]

13. Schenkel FS, Miller SP, Ye X, Moore SS, Nkrumah JD, Li C, Yu J, Mandell IB, Wilton JW, Williams JL. Association of single nucleotide polymorphisms in the leptin gene with carcass and meat quality traits of beef cattle. J Anim Sci 2005;83:2009-2020.         [ Links ]

14. Liefers SC, Veerkamp RF, Te pas MF, Chilliard Y, Van der lende T. Genetics and physiology of leptin in periparturient dairy cows. Domest Anim Endocrin 2005;29:227-238.         [ Links ]

15. Nkrumah JD, Li C, Yu J, Hansen C, Keisler DH, Moore SS. Polymorphisms in the bovine leptin promoter associated with serum leptin concentration, growth, feed intake, feeding behavior and measures of carcass merit. J Anim Sci 2005;83(1):20-28.         [ Links ]

16. Javanrouh A, Banabazi MH, Esmaeilkhanian S, Amirinia C, Seyedabadi HR, Emrani H. Optimization on salting out method for DNA extraction from animal and poultry blood cells. 57th Ann Meet European Assoc Anim Prod. September 17-20, 2006; Antalya, Turkey; 2006;101.         [ Links ]

17. Lien S, Sundvold H, Klungland H, Vage DI. Two novel polymorphisms in the bovine obesity gene (OBS). Anim Genet 1997;28:45.         [ Links ]

18. Yeh F, Yang R, Boyle T, Ye Z, Mao JX. Pop Gene, the user-friendly computer freeware for the analysis of genetic variation among and within populations using co-dominant and dominant markers. Molecular Biology and Biotechnology Center, University of Alberta. 2000.         [ Links ]

19. SAS. 2004. SAS user's guide: Statistics (Version 9.1 Ed.). SAS Inst. Inc., Cary, N.C. USA.         [ Links ]

20. Choudhary V, Kumar P, Bhattacharya TK, Bhushan B, Sharma A. DNA polymorphism of leptin gene in Bos indicus and Bos taurus cattle. Genet Mol Biol 2005;28(4):740-742.         [ Links ]

21. Bourdon RM. Understanding Animal Breeding. 2nd ed. New Jersey, USA: Prentice-Hall PTR; 2000.         [ Links ]

22. Heravi Moussavi AR, Ahouei M, Nassiry M, Javadmanesh A. Association of leptin polymorphism with production, reproduction and plasma glucose level in Iranian Holstein cows. Asian Austral J Anim 2006;627-631.         [ Links ]

23. Nazari M, Rostamzadeh J, Rashidi A, Azizi O, Karimi Kurdistani Z. Evaluation of leptin gene polymorphism and its association with milk traits in Holstein cows [abstract]. Iranian Congr Anim Sci. Esfahan Industrial University, Iran. 2012.         [ Links ]