Hormona luteinizante y actividad ovárica en respuesta a kisspeptina-10 y su asociación con IGF-1 y leptina en becerras pre-púberes

 

Luteinizing hormone and ovarian activity in response to kisspeptin-10 and its association with IGF-1 and leptin in prepubertal heifers

 

Rubén Santos Echeverría^a,b, René Carlos Calderón Robles^c, Héctor Raymundo Vera Ávila^d, Gerardo Perera-Marín^a, Jesús Alejandro Arreguín Arévalo^e, Terry M. Nett^e, Carlos Guillermo Gutiérrez Aguilar^a, Alejandro Villa-Godoy^a

 

^a Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México. Circuito Exterior S/N, Cubículo 2314, Ciudad Universitaria, 04510 Coyoacán, México, DF. Tel. 52 55 56 22 59 80. aavillagodoy@gmail.com. Correspondencia al último autor.

^b Campo Experimental Iguala, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Iguala, Guerrero, México.

^c Campo Experimental San Martinito, INIFAP. Tlahuapan, Puebla, México.

^d CENID Fisiología y Mejoramiento Animal, INIFAP. Ajuchitlán, Querétaro, México.

^e Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad Estatal de Colorado, Fort Collins, Colorado, USA.

 

Recibido el 24 de septiembre de 2013.
Aceptado el 26 de noviembre de 2013.

 

RESUMEN

Se evaluó el efecto de la kisspeptina-10 (Kiss-10), administrada repetidamente, sobre la liberación de LH y la actividad ovárica en becerras pre-púberes. Asimismo, se determinó la asociación de IGF-1 y leptina séricas con dichos efectos. Catorce (14) becerras Holstein o Suizo Pardo por Cebú (11.2±0.2 meses de edad; 187.4±6.3 kg de peso), se asignaron aleatoriamente para recibir cada dos horas, durante tres días una aplicación i.v. de Kiss-10 (Kisspeptina-10; 5 pg/kg de peso; n=7) o solución salina fisiológica (Testigo, n=7). Se colectó sangre cada 15 min de las 0-6, 24-30 y 72-78 h, y cada 2 h hasta las 84 h. Cada aplicación de Kiss-10 fue seguida de un incremento de LH, cuya magnitud (área bajo la curva) disminuyó (P<0.05) con el tiempo. La Kiss-10 indujo una oleada preovulatoria de LH y formación de cuerpo lúteo en 28.5 % de las becerras, mismas que presentaron las mayores (P<0.05) concentraciones séricas de IGF-1 y las menores (P<0.05) de leptina. Durante 63 días postratamiento no se detectaron cambios en las ondas foliculares atribuibles a Kiss-10 (P>0.05), y ninguna becerra manifestó actividad ovárica cíclica. Se concluye que la Kiss-10 administrada repetidamente a becerras pre-púberes es un estímulo suficiente para evocar incrementos consistentes de LH, para inducir la ovulación y actividad lútea en animales con concentraciones séricas elevadas de IGF-1 y bajas de leptina, pero no para inducir la ciclicidad estral.

Palabras clave: Becerras pre-púberes, Kisspeptina, IGF-1, Leptina, Hormona luteinizante.

 

ABSTRACT

We evaluated the effect of kisspeptin-10 (Kiss-10) administered repeatedly on the release of LH and ovarian activity in prepubertal heifers. We also assessed the association of serum IGF-1 and leptin with these effects. Fourteen Holstein or Brown Swiss by Zebu female calves (11.2 ± 0.2 mo old, 187.4 ± 6.3 kg) were randomly assigned to receive every 2 h for three days an i.v. application of Kiss-10 (Kisspeptin-10; 5 pg/kg of body weight, n= 7) or saline solution (control, n= 7). Blood was collected every 15 min for 0-6, 24-30 and 72-78 h, and every 2 h until 84 h. Each application of Kiss-10 was followed by an increase of LH whose magnitude (area under the curve) decreased (P<0.05) over time. Kiss-10 induced a preovulatory surge of LH and corpus luteum formation in 28.5 % of the calves. Ovulating calves had the highest (P<0.05) serum concentrations of 1Gf-1 and the lowest (P<0.05) leptin. During 63 post-treatment days, no changes were detected in follicular waves attributable to treatments (P>0.05) and heifers did not show cyclic ovarian activity. The conclusion is that Kiss-10 given repeatedly to prepubertal heifers is sufficient to evoke consistent increases of LH, to induce ovulation and luteal activity in animals with high IGF-1 and low leptin in peripheral blood but it is insufficient to establish regular estrous cyclicity.

Keywords: Prepubertal heifers, Kisspeptin, IGF-1, Leptin, Luteinizing hormone.

 

INTRODUCCIÓN

La pubertad representa una condición crítica en el desarrollo de los mamíferos y en la rentabilidad de las unidades de producción pecuaria⁽¹⁾. El inicio de este proceso reproductivo es precedido por un aumento en la frecuencia de pulsos de la hormona luteinizante (LH), en respuesta a un incremento en la secreción pulsátil de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH)⁽²⁾. La LH actúa en los ovarios estimulando el desarrollo terminal de los folículos y el incremento en la síntesis y secreción de estrógenos, los cuales a su vez son responsables de inducir el estro y la ovulación⁽²⁾. El cambio en el patrón de secreción pulsátil de la GnRH es el componente clave para iniciar la pubertad⁽³⁾. Este cambio a su vez se deriva de la modificación funcional del "pulsador biológico", el generador hipotalámico de pulsos de GnRH, cuya regulación neural y no neural es compleja y no ha sido dilucidada por completo⁽⁴⁾.

La kisspeptina o metastina es una familia de péptidos hipotalámicos (Kiss-54, -14, -13 y -10; denominados de acuerdo al número de aminoácidos que los componen), altamente conservada en mamíferos⁽⁵⁾, que está involucrada en la regulación de las neuronas de GnRH⁽⁶⁾. La administración de kisspeptina, ya sea en forma sistémica⁽⁷⁾ o central^(8,9,10), induce la liberación de GnRH e indirectamente de las gonadotropinas hipofisiarias^(8,11), por lo que podría tener aplicaciones potenciales para manipular la reproducción.

En bovinos, la información disponible acerca de la participación de la kisspeptina en la activación puberal del eje reproductivo es limitada. En becerras pre-púberes, de las razas Holstein, Negra Japonesa y de las de cruzas de Holstein y Suizo por Cebú, la administración de un bolo i.v. de Kiss-10 (5 pg/kg de peso) indujo un incremento transitorio en la liberación de LH y de la hormona folículo estimulante (FSH)^(12-15). La respuesta a Kiss-10 a esta dosis y vía de administración aumenta con la edad en becerras de 4 a 11 meses⁽¹⁴⁾, lo cual permite sugerir que los animales adquieren una mayor sensibilidad a la kisspeptina a medida que se acercan a la pubertad. Asimismo, en becerras de 7 a 11 meses de edad, se demostró que la magnitud y duración de la respuesta de LH y FSH no aumenta al incrementar la dosis de Kiss-10 de 5 a 50 pg/kg de peso⁽¹⁵⁾. En los estudios previos también se observó^(14,15) que la mayor respuesta de LH y FSH a Kiss-10 coi nci de con u n a elevada concentración circulante del factor de crecimiento parecido a la insulina (IGF-1) y una concentración de leptina decreciente. Por lo tanto, es posible que la leptina esté involucrada en acciones pre-sensibilizadoras, mientras que el IGF-1 podría estar modulando los efectos de la Kiss-10 sobre el eje reproductivo de las becerras⁽¹⁴⁾.

En experimentos realizados para tratar de adelantar la pubertad, al administrar GnRH en becerras, imitando la liberación pulsátil de la GnRH endógena, se logró inducir la formación de cuerpo lúteo en 28 y 33 % de las becerras pero no la actividad cíclica ovulatoria^(16,17). Existen evidencias de que la Kiss-10 administrada en forma repetida induce la apertura vaginal en ratas pre-púberes^(9,10), así como la ovulación y formación de cuerpos lúteos en corderas próximas a la pubertad⁽¹⁸⁾, en una elevada proporción de animales (>60 %). Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue determinar los efectos de la Ki ss-10, administrada repetidamente, sobre la liberación de LH, la función lútea y el desarrollo folicular ovárico en becerras pre-púberes; asimismo se determinó la asociación de IGF-1 y leptina séricas con dichos efectos.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Todos los procedimientos empleados en este experimento fueron aprobados por el Subcomité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales en Experimentación (SICUAE) del programa de Posgrado en Ciencias de la Producción y de la Salud Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM. El estudio se realizó en un sitio experimental dependiente del INIFAP, ubicado en Hueytamalco, Pue. El sitio se encuentra a 19° 51' 03" N y 97° 12' 48" O, a 500 msnm. El clima es subtropical húmedo semicálido Af(c), con temperatura promedio anual de 20.8 °C⁽¹⁹⁾.

Tratamientos

Se usaron 14 becerras pre-púberes de 11 a 13 meses de edad y 187.4 ± 6.26 kg de peso (media ± eem), resultantes de la cruza de animales Suizo Pardo o Holstein por Cebú. Las becerras se agruparon por genotipo, edad y peso, y de acuerdo a estos criterios, se asignaron aleatoriamente para recibir Kiss-10 (Kisspeptina-10; 5 pg/kg de peso, i.v., cada dos horas durante tres días; n=7) o solución salina fisiológica (SSF; Testigo; n=7). En el presente estudio se aplicó Kiss-10 bovina⁽⁶⁾ cuya secuencia peptídica es YNWNSFGLRY-NH2, con >95 % de pureza (Proimmune, Oxford, UK). Tanto SSF como Kiss-10 fueron administrados a través de un catéter insertado en una de las venas yugulares, el cual a su vez se utilizó para obtener muestras de sangre de acuerdo al esquem a que se describe en la sección correspondiente. Antes de su aplicación, la Kiss-10 fue diluida en SSF (1:125). El volumen total aplicado por becerra en el grupo Kiss-10 se usó como referencia para establecer el volumen de SSF que se aplicó en las becerras de dicho grupo.

Manejo general

Las becerras se alojaron por pares en corrales de 4 x 6 m, con piso de cemento, área techada (4 x 3 m), comederos y bebederos. Para su adaptación al manejo y a la rutina de muestreo sanguíneo, las becerras se introdujeron a los corrales dos meses antes de la administración de tratamientos y durante este periodo se sometieron a sujeción con reata (2 h/día), cepillado de pelo y acostumbramiento a la presencia de personas. La alimentación consistió en forraje picado a libertad (heno de avena; 94.82 % MS, 8.13 % PC y 2.3 Mcal de EM/kg), 4 kg de alimento concentrado al día (94.49 % MS, 17.97 % PC y 2.5 Mcal de EM/kg), sales mineral es y agua a libertad. El periodo experimental concluyó 63 días después de finalizados los tratamientos.

Determinación de medidas corporales

El peso vivo de los animales se registró cada 14 días desde su llegada a los corrales de experimentación y hasta el final del estudio; a partir de estos registros se determinó la ganancia diaria promedio de peso (GDP) previa al inicio del periodo experimental. Un día antes de la aplicación de tratamientos, a cada becerra se le determinó la altura a la cruz, condición corporal (CC), grosor de la grasa dorsal y profundidad del músculo Longissimus dorsi. La altura a la cruz fue la distancia vertical entre el piso y la unión escapular. La CC fue calificada de manera independiente por tres personas⁽²⁰⁾ (escala de 1 a 5 puntos, 1=emaciado y 5=obeso) y el promedio de estas calificaciones se usó como variable de respuesta. El grosor de la grasa dorsal y la profundidad del músculo Longissimus dorsi (medidos entre la 12va y la 13va costilla) se determinaron mediante ultrasonografía⁽²¹⁾, utilizando para ello un aparato Kaixin 5000 y transductor lineal de 3.5 MHz (Xuzhou Kaixin Electronic Instruments Co., Xuzhou, Jiangsu, China).

Muestreo sanguíneo

Cada tercer día desde dos semanas antes de iniciar el estudio y hasta finalizarlo, se obtuvieron muestras de sangre por punción de la vena coxígea y colección en tubos "vacutainer". Las muestras se procesaron para obtención de suero (refrigeración por 3 h y posterior centrifugación a 1,500 xg por 15 min). El suero se congeló a -20 °C hasta determinar por radioinmunoanálisis (RIA) la concentración de progesterona (P4). La concentración de P4 se utilizó como indicador de actividad lútea (P4; valores ± 1 ng/ml) y confirmación del estado pre-puberal (P4; valores < 1 ng/ml) de las becerras.

Adicionalmente y una hora antes de iniciar los tratamientos correspondientes, a cada becerra se le insertó un catéter estéril de plástico en una de las venas yugulares (Sonda Kortex calibre 5 FR y longitud 90 cm; Catálogo K-733; Trokar S.A de C.V). Para ello, la zona peri-yugular (5x5 cm ) fu e previ am en te rasu rada y anestesiada (lidocaína al 2 %, 2 mg/cm²). A través del catéter, se colectó sangre cada 15 min en los periodos: 0 a 6 h, 24 a 30 h, y 72 a 78 h de iniciados los tratamientos, así como cada 2 h entre muestreos intensivos, y al terminar estos hasta las 84 h. Las primeras muestras se obtuvieron inmediatamente antes de cada administración de Kiss-10 o SSF. El suero de estas muestras se obtuvo y almacenó como se indicó anteriormente.

Ultrasonografía de ovarios y detección de signos de estro

En cada becerra se obtuvieron imágenes ultrasonográficas de los ovarios el día previo al inicio de los tratamientos y, después de terminados estos cada tercer día hasta el día 63 (transductor intra-rectal de 7.5 MHz para equipo Kaixin 500). A partir de estos registros se identificó la presencia de cuerpo lúteo (CL) y se obtuvo el diámetro de los dos folículos de mayor tamaño, así como el número de folículos mayores a 5 mm⁽²²⁾.

Desde dos meses antes de iniciar el estudio y hasta su final, se llevó a cabo una supervisión para identificar a las becerras que presentaran conducta de estro (dos periodos de observación/ día en un corral comunal; 0700 a 0800 y 1900 a 2000 h).

Medición de hormonas

La LH se determinó mediante RIA en todas las muestras obtenidas entre las 0 y 84 h con relación a la aplicación de tratamientos. El RIA para LH fue en fase líquida de 120 h de incubación a 4° C, siguiendo el procedimiento descrito por Arrieta et al⁽²³⁾. La hormona USDA-bLH (AFP11743B) se utilizó como trazador incorporando Na¹²⁵I mediante el método del Iodo-gen y como curva patrón a dosis desde 0.01 hasta 10 ng por tubo. El primer anticuerpo generado en conejo correspondió a la hormona NIDDK-oLH-26 (anti-oLH-26) validado en bovinos por Perera-Marín et al⁽²⁴⁾ a una dilución final de 1:400,000. La separación de la fracción unida de la fracción libre se realizó con un segundo anticuerpo contra IgG de conejo generado en burro (dilución 1:80). En tres ensayos la cantidad mínima detectable fue 0.03 ng/ml y los coeficientes de variación (CV) intra-e inter-ensayo fueron 6.73 y 6.57 %, respectivamente. El IGF-1 y la leptina se determinaron en muestras obtenidas a las 0, 24, 48 y 72 h de iniciados los tratamientos. El IGF-1 se cuanti fi có mediante un ensayo inmunoabsorbente (IGF-1 ELISA®, ALPCO Diagnostics, Salem, NH); la sensibilidad del ensayo fue de 5.86 ng/ml y el CV intra-ensayo fue 0.57 %. La leptina se analizó mediante RIA con un estuche comercial multiespecies de fase líquida (XL-85K, Linco Research Inc, St. Charles, MO)⁽²⁵⁾, con una sensibilidad de 1.0 ng/ml y un CV intra-ensayo de 3.8 %. La progesterona se cuantificó mediante RIA con un estuche comercial de fase sólida (PROG-CTRIA®, Cisbio Bioassay, Sorgues, France) cuya sensibilidad fue de 0.15 ng/ml, con un CV intra-ensayo de 8.8 %.

Variables de respuesta

Se determinó el área bajo la curva (AUC) de cada incremento en las concentraciones séricas de LH provocado por la administración de Kiss-10 y, en paralelo, durante periodos similares del pulso endógeno de LH de mayor tamaño en becerras del grupo testigo. Se consideraron como incrementos de LH inducidos por la administración de Kiss-10 o pulsos endógenos en el grupo testigo, cuando al menos en dos muestras consecutivas la concentración de LH fue mayor al promedio más dos desviaciones estándar de las concentraciones de la hormona a las 0, 2 y 4 h de iniciados los tratamientos. El AUC se calculó como la suma de las concentraciones de LH consideradas como incrementos asociados a la administración de Kiss-10, o a un pulso endógeno en el grupo testigo. Para ambos grupos se determinó la frecuencia de incrementos de LH sérica, durante cada uno de los periodos de muestreo intensivo de 6 h (frecuencia=número de incrementos durante el periodo). A partir de las concentraciones de LH determinadas en las muestras colectadas cada dos horas (0 a 84 h), se identificó a las becerras que presentaron una oleada preovulatoria de LH (incremento de LH mayor a la media + 2 DE en dos o más muestras consecutivas). La presentación de ovu l aci on es se determinó mediante la identificación ultrasonográfica de CL, coincidente con un incremento de P4 (± 1 ng/ml). Con base en los registros ultrasonográficos de los ovarios se caracterizaron las ondas de desarrollo folicular durante el periodo experimental⁽²⁶⁾, estimando su número y duración.

Análisis estadístico

La comparación entre grupos experimentales de los valores al inicio del estudio para peso vivo, ganancia diaria promedio (GDP) de peso pre-tratamientos, altura a la cruz, CC, grosor de grasa dorsal, profundidad del músculo L. dorsi, total de folículos > 5 mm, diámetro del folículo mayor y del segundo en tamaño, concentraciones séricas de leptina e IGF-1, se realizó mediante la prueba "t" de Student. En el caso de variables de respuesta que se registraron en varias ocasiones durante el periodo experimental, la comparación fue mediante ANDEVA para un diseño de mediciones repetidas (concentraciones séricas de LH, leptina e IGF-1, AUC de incrementos de LH, duración de ondas foliculares y diámetros máximos de los folículos dominantes). A su vez, las respuestas binomiales se compararon por Ji cuadrada (presentación de oleada preovulatoria de LH y presentación de CL). Por otra parte, con el fin de determinar el grado de asociación entre variables corporales y de actividad ovárica y endocrina al inicio el periodo experimental, se realizó un análisis de correlación lineal múltiple. En todos los casos se utilizó el paquete estadístico SAS⁽²⁷⁾ con sus procedimientos para modelos lineales generales (PROC-GLM) o para análisis de frecuencias (PROC-FREQ) y, en su caso, la separación de medias por el procedimiento de medias de cuadrados mínimos (LSMEANS).

 

RESULTADOS

Tres semanas después del inicio de la aplicación de los tratamientos, una becerra del grupo Kisspeptina-10 se retiró del estudio por haber padecido una enfermedad infecciosa, por lo que no existieron datos de este animal relacionados con las variables de respuesta asociadas a las ondas de desarrollo folicular pos-tratamiento; en los análisis de respuesta hormonal a Kiss-10 sí fue contabilizada.

Al inicio del estudio, las becerras en los dos grupos experimentales fueron homogéneas en cuanto a medidas corporales, estado ovárico y concentración sérica de leptina e IGF-1 (Cuadro 1; P>0.05). La GDP registrada en los dos meses previos a la administración de los tratamientos también fue similar entre grupos, con una media general de 0.79 ± 0.12 kg/día.

La administración repetida de Kiss-10 provocó incrementos sucesivos de LH (Figura 1-A). Con cada aplicación de Kiss-10, el AUC del incremento de LH disminuyó gradualmente en las primeras tres aplicaciones y después se mantuvo relativamente estable (Figura 1-B). Comparado con el AUC de los pulsos endógenos en el grupo testigo, el AUC del incremento de LH en respuesta a Kiss-10 fue 7.07, 4.95 y 3.20 veces mayor en las tres primeras aplicaciones del neuropéptido (P<0.01; Figura 1-B). A partir de las 26 h de iniciados los tratamientos, el AUC del incremento de LH provocado por la Kiss-10 fue similar en magnitud comparado con el AUC de los pulsos endógenos de LH en el grupo testigo (P>0.05; Figura 1-B).

El promedio del AUC durante el periodo de 0 a 6 h de iniciados los tratamientos (Cuadro 2) fue mayor para el grupo en que se administró Kiss-10 (P<0.05; AUC 9 veces mayor en Kisspeptina-10 vs testigo), pero no difirió entre grupos experimentales en los periodos de 24 a 30 h y de 72 a 78 h. A través de estos tres periodos el valor promedio de AUC presentó una disminución progresiva en el grupo Kisspeptina-10 (P<0.05). En contraste, esta variable presentó un incremento en el grupo testigo durante el periodo de 24 a 30 h con respecto al de 0 a 6 h; posteriormente el AUC de LH se mantuvo. Una vez retirados los tratamientos (periodo 72 a 78 h), el número y la amplitud de los pulsos de LH fue similar (P>0.05) entre grupos experimentales.

La Kiss-10 indujo una oleada preovulatoria de LH seguida de formación de un CL en 28.5 % de las becerras tratadas, mientras que en el grupo testigo ninguna becerra la presentó. La oleada preovulatoria inició 48 ± 5.65 h después de la primera aplicación de Kiss-10 y tuvo una duración de 8.0 ± 2.82 h. De acuerdo a los niveles séricos de P4, la actividad lútea (concentración ± 1 ng/ml) en dichas becerras inició seis días después de la primera aplicación de Ki ss-10 y los dos CL permanecieron funcionales durante 4 y 12 días; posteriormente las concentraciones de progesterona volvieron a ser inferiores a 1 ng/ml, lo cual se mantuvo hasta el final del estudio; es decir que después de ovular, las becerras volvieron a un estado similar al prepuberal.

Ninguna de las becerras en ambos grupos experimentales presentó signos conductuales de estro o actividad cíclica estral durante el periodo experimental. En los 63 días pos-tratamiento, el número y duración de las ondas de desarrollo folicular, así como el diámetro máximo de los folículos dominantes fue similar entre grupos experimentales (P>0.05; Figura 2). En este intervalo, la duración de las ondas de desarrollo folicular y el diámetro máximo del folículo dominante aumentaron a partir de la 6^a y 5^a onda en los grupos testigo y Kisspeptina-10, respectivamente (P<0.05).

La aplicación repetida de Kiss-10 no modificó (P>0.05) las concentraciones séricas de IGF-1 y leptina, pero las becerras que ovularon en respuesta a Kiss-10 presentaron concentraciones séri cas de IGF-1 mayores a las de sus compañeras de grupo (P<0.05; Figura 3-A), lo cual no ocurrió con las concentraciones séricas de leptina (Figura 3-B), las cuales no variaron durante el período de muestreo; por el contrario, las dos becerras que ovularon fueron de las que presentaron concentraciones de leptina más bajas (P<0.05).

Las concentraciones séricas de IGF-1 al inicio del periodo experimental se correlacionaron positivamente (P<0.05) con el peso corporal (r= 0.70), la condición corporal (r= 0.58) y la altura a la cruz de las becerras (r= 0.78). Por su parte, las concentraciones circulantes de leptina sólo se correlacionaron con la edad de las becerras (r= 0.62; P<0.05). Los valores al inicio del periodo experimental de grosor de grasa dorsal, profundidad del músculo L. dorsi y de variables relacionadas con poblaciones de folículos ováricos, no se correlacionaron con los de las concentraciones séricas de IGF-1 o de leptina (P>0.05); a su vez, las concentraciones séricas de estas hormonas no se correlacionaron entre sí (P>0.05).

 

DISCUSIÓN

En becerras pre-púberes, la Kiss-10 administrada en forma repetida provocó incrementos sucesivos de LH, mismos que disminuyeron en amplitud con el tiempo. De acuerdo con lo que se hipotetizó, la Kiss-10 aplicada repetidamente sería capaz de inducir la ovulación, sin embargo, en el presente estudio esto solo ocurrió en las becerras que presentaron elevadas concentraciones circulantes de IGF-1 y bajas concentraciones de leptina durante el período de muestreo. La Kiss-10 no indujo el establecimiento de actividad cíclica ovulatoria o estral, ni afectó el desarrollo folicular ovárico después del tratamiento, por lo que puede considerarse que su efecto fue transitorio.

La Kiss-10 administrada en un protocolo de aplicaciones repetidas provocó un aumento en la frecuencia y magnitud de incrementos de LH de manera similar a lo que ocurre durante la pubertad. Por lo anterior, es factible proponer a este neuropéptido como una herramienta potencial para la manipulación del eje reproductivo en becerras pre-púberes como se ha sugerido en ratas^(9,10) y borregas⁽¹⁸⁾.

En el presente estudio, la magnitud del incremento de LH inducido por cada aplicación de Kiss-10 disminuyó gradualmente con el tiempo hasta llegar a equipararse con la magnitud de los incrementos de LH asociados a pulsos endógenos en el grupo testigo. Una disminución similar en la magnitud de incrementos de LH fue encontrada por McLeod et al⁽¹⁶⁾ después de utilizar un esquema de administración de GnRH similar al de Kiss-10 empleado en el presente trabajo en becerras pre-púberes. Los autores citados, observaron que l as becerras presentaron periodos alternados de mayor y menor respuesta a la GnRH exógena, atribuyendo este efecto a la modulación de la sensibilidad de la respuesta hipofisiaria a GnRH ejercida por esteroides ováricos y no a una desensibilización progresiva por efecto de la administración repetida de la neurohormona. El estímulo en la secreción de LH asociado con la administración de Kiss-10, representa un efecto indirecto mediado por la GnRH liberada a nivel hipotalámico en respuesta al neuropéptido⁽¹¹⁾. En este sentido, no se puede descartar como explicación de la disminución en la magnitud de la respuesta de LH ante aplicaciones repetidas de Kiss-10 a una posible desensibilización de las neuronas GnRH-érgicas, ya que se ha demostrado que estas neuronas pueden pasar por periodos refractarios al neuropéptido en ratones juveniles y pre-púberes⁽²⁸⁾, en los que se observó además que el porcentaje de neuronas de GnRH despolarizadas y la duración del periodo de despolarización en respuesta a Kiss-10, fueron menores en animales pre-púberes que en los de mayor edad.

Por otra parte, la disminución de los incrementos de LH inducidos por la administración intermitente de Kiss-10 puede ser consecuencia del incremento en la frecuencia de secreción de LH con respecto a la del periodo pre-tratamiento, de manera similar a lo que ocurre en el proestro en animales con actividad cíclica ovulatoria, cuyo estradiol disminuye en amplitud pero no en frecuencia de los pulsos de LH⁽²⁹⁾. Independientemente de lo anterior, en borregas adultas la administración i.v. de Kiss-10 en forma intermitente induce un incremento de GnRH y LH similar entre aplicaciones⁽⁷⁾, como lo ha sido también para LH en corderas cercanas a la pubertad^(18,30), cabras en diestro⁽³¹⁾ y ratas macho que han cursado por la pubertad⁽³²⁾. Los resultados citados y los del presente estudio, constituyen evidencias indirectas de una diferenciada sensibilidad a Kiss-10 a nivel de las neuronas GnRH entre animales pre y peri-puberales, fenómeno que fue confirmado para algunos roedores^(28,33) y monos Rhesus⁽³⁴⁾.

La Kiss-10 indujo una oleada preovulatoria de LH y la formación de un CL funcional en 28 % de las becerras. Un resultado similar se observó en becerras de 12 a 14 meses de edad tratadas con GnRH⁽¹⁷⁾ por la misma vía, frecuencia y duración del tratamiento que en el presente experimento. En becerras de menor edad, un tratamiento de GnRH similar al señalado indujo una oleada preovulatoria de LH en 75 % de los animales, de los cuales solo el 25 % formó un CL de corta duración⁽¹⁶⁾. Por tanto, se propone que la respuesta del hipotálamo a Kiss-10 y de la hipófisis a GnRH exógenas varía en función de la edad de los animales. En apoyo a lo mencionado, en borregas pre-púberes en etapas cercanas al inicio de la pubertad, la Kiss-10⁽¹⁸⁾ y la GnRH⁽³⁵⁾ administradas cada hora por 1 y 10 días respectivamente, indujeron una oleada de LH y la función lútea en más del 60 % de el l as. De igual manera, en ratas que aproximadamente se encontraban a ocho días del inicio de la pubertad, un tratamiento de Kiss-10 cada 12 h por seis días adelantó la apertura vaginal en 74 % de ellas⁽⁹⁾. Estos estudios ponen en evidencia la estrecha asociación que parece existir entre el grado de desarrollo corporal y la proporción de hembras que manifiestan una oleada preovulatoria de LH y la subsecuente función lútea, en respuesta a un tratamiento intermitente de Kiss-10 o GnRH.

En un estudio previo con becerras de 4, 7 y 11 meses de edad, se informó que las becerras de 11 meses en comparación de las de menor edad, presentaron la mayor respuesta de LH a un bolo i.v. de Kiss-10, lo cual coincidió con mayores concentraciones de IGF-1 y estradiol y las menores concentraciones de leptina⁽¹⁴⁾. En el presente estudio, las becerras que presentaron una oleada de LH y formación de CL en respuesta a Kiss-10 presentaron un comportamiento similar en cuanto a IGF-1 y leptina; por lo tanto, la IGF-1 y estradiol podrían modular positivamente los efectos de la kisspeptina en la actividad del eje gonadal, ya que, aparentemente, se requieren concentraciones endógenas relativamente elevadas de dichas hormonas como señal indicadora de desarrollo somático, mientras que los efectos señalizadores de la leptina, si es que se ejercen en becerras, pudieron haber ocurrido mediante incrementos en edades más tempranas, como fue documentado por nuestro grupo en un trabajo anterior⁽¹⁴⁾, donde se determinó que las becerras de 4 y 7 meses de edad tuvieron niveles circulantes de leptina mayores que las de 11 meses de edad; mientras que otros autores no encontraron una asociación consistente entre los niveles de leptina y el inicio de la pubertad en vaquillas^(36,37).

En el estudio que aquí se informa, todas las becerras presentaron una liberación pulsátil de LH de características similares en respuesta a la administración intermitente de Kiss-10 durante las primeras 30 h de tratamiento. Por tanto, la oleada de LH y la subsecuente función lútea observada en algunas becerras tratadas con Kiss-10 podrían explicarse, en parte, por un mayor estímulo a la actividad esteroidogénica inducida por las gonadotropinas hipofisiarias, en sinergia con un elevado nivel sanguíneo de IGF-1⁽³⁸⁾, retroalimentando con ello positivamente al componente hipotálamo-hipófisis. Es pertinente mencionar que las borregas y ratas con signos de pubertad en respuesta a la administración repetida de Kiss-10^(9,10,18), cursaron también por intervalos de aumentos en las concentraciones sanguíneas de estradiol. Así mismo, en otro estudio se puntualizó que la Kiss-10 administrada en forma continua a borregas adultas, indujo una oleada de LH sólo en aquéllas que respondieron al tratamiento con una elevación de estradiol⁽³⁹⁾. Estos resultados son sugerentes de que en asociación con el desarrollo somático, el cual podría ser evidenciado indirectamente por IGF-1, la Kiss-10 evoca una respuesta ovulatoria a través de la promoción de una mayor actividad esteroidogénica inducida por la actividad GnRH/ LH. En el presente estudio no se cuantificó el estradiol circulante, pero considerando la información existente en la literatura no se puede ignorar la posible interacción entre IGF1 y estradiol en el inicio de la pubertad.

Por otro lado, a nivel del sistema nervioso central, el IGF-1 y el estradiol interactúan en múltiples procesos de maduración neural^(38,40), entre los que destacan: plasticidad sináptica en las neuronas GnRH⁽⁴¹⁾, expresión de kisspeptinaen el núcleo anteroventral periventricular⁽⁴²⁾ y secreción de GnRH y LH^(43,44); procesos que tienen lugar en regiones hipotalámicas en cargadas de regular la liberación de LH en forma de oleada⁽⁴²⁾ al menos en roedores, lo cual podría ser un condicionamiento neural en preparación al eventual inicio de la pubertad. En un estudio efectuado en vaquillas productoras de carne con diferente tasa de crecimiento, se puso de manifiesto el incremento de IGF-1 en sangre durante el desarrollo somático precedente al inicio de la pubertad⁽⁴⁵⁾. En el presente trabajo, el IGF-1 se asoció positivamente con variables relacionadas con el crecimiento corporal, proporcionando apoyo al concepto de que el IGF-1 es la señal de origen somático que inicia eventos de maduración neuroendocrina conducentes a la pubertad, incluyendo acciones directas o indirectas en la regulación de la secreción de la kisspeptina hipotalámica o los efectos de la Kiss-10 en la secreción de GnRH/ LH. Otras evidencias a favor de dicho concepto se refieren a que el IGF-1 administrado a monas Rhesus durante la adolescencia, disminuye la sensibilidad de la LH a la retroalimentación negativa de los estrógenos⁽⁴⁶⁾. Por otro lado, también en monas Rhesus en fase puberal se demostró que el estradiol es indispensable para evocar un aumento de GnRH en respuesta a Kiss-10⁽⁴⁷⁾. Por tanto, el IGF-1 y estradiol parecen promover a nivel central una mayor sensibilidad del hipotálamo a la kisspeptina, con lo cual se podría inducir un cambio de retroalimentación negativo a positivo del estradiol en la secreción de LH, y consecuentemente la ovulación.

Con relación a leptina, se ha reportado en vaquillas que los niveles de ésta aumentan en las semanas próximas a la pubertad⁽⁴⁸⁾, sin embargo, se ha determinado que sus efectos son permisivos mas no inductivos para el inicio de la misma, pues la leptina exógena no fue suficiente estímulo para aumentar la LH y adelantar la pubertad en vaquillas^(49,50). Además, en ratas con niveles suprimidos de leptina mediante restricción alimenticia^(9,10) o mediante la aplicación de anticuerpo contra leptina⁽⁹⁾, la Kiss-10 indujo un mayor incremento de LH comparado con los testigos que mostraron niveles normales de leptina. Por otro lado, la supresión de leptina por restricciones de la dieta, indujo la pubertad en 60 % de las ratas tratadas con Kiss-10 en comparación de las ratas con niveles normales de leptina (0 %)⁽¹⁰⁾. Lo anterior, nos permite proponer que antes del inicio de la pubertad la leptina alcanza una concentración umbral que posteriormente declina antes de la primera ovulación; en seguida el IGF-1 aumenta en sangre y se mantiene elevado, señalizando positivamente al hipotálamo, quien responde con un aumento en la frecuencia pulsátil de kisspeptina y de GnRH, ocasionando aumentos sincrónicos de las gonadotropinas hipofisiarias, lo que a su vez evocaría el aumento de actividad folicular, un incremento del estradiol circulante, la presentación de la oleada preovulatoria de LH y con el l o el desencadenamiento de la pubertad.

En términos prácticos, el tratamiento de Kiss-10 fue transitorio y sin repercusión posterior, ya que luego de retirar el tratamiento tanto la secreción de LH como el desarrollo de las ondas foliculares fueron similares a los del grupo testigo. En ambos grupos experimentales, el desarrollo folicular postratamiento siguió un comportamiento característico de las vaquillas en crecimiento, es decir hubo un aumento asociado con la edad^(51,52).

 

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

Se concluye que la Kiss-10 administrada repetidamente a becerras pre-púberes es un estímulo suficiente para evocar incrementos consistentes de LH, para inducir la ovulación y actividad lútea en animales con concentraciones séricas elevadas de IGF-1 y bajas de leptina, pero no para inducir la ciclicidad estral. Una implicación es que factores diferentes a los aquí evaluados, que están presentes o ausentes en la becerra pre-púber, determinan los efectos de la kisspeptina en la respuesta ovulatoria y subsecuente actividad ovárica cíclica.

 

AGRADECIMIENTOS

Esta información es parte del proyecto de investigación del programa de estudios de Doctorado del primer autor (FMVZ-UNAM). Se agradece a la UNAM, CONACyT e INIFAP por los apoyos económicos proporcionados al primer autor para el desarrollo de sus actividades académicas y de investigación. Se agradece a la MVZ Clara Murcia Mejía, por la cuantificación de hormonas.

 

LITERATURA CITADA

1. Patterson DJ, Perry RC, Kiracofe GH, Bellows RA, Staigmiller RB, Corah LR. Management considerations in heifer development and puberty. J Anim Sci 1992;70:4018-4035.         [ Links ]

2. Williams GL, Amstalden M. Understanding postpartum anestrus and puberty in the beef. Proc Appl Reprod Strategies in Beef Cattle 2010. San Antonio, TX. [on line] http://www.appliedreprostrategies.com/2010/January/pdfs/Gary_Williams.pdf. Accesed May, 2013.         [ Links ]

3. Ebling JP. The neuroendocrine timing of puberty. Reproduction 2005;129(6):675-683.         [ Links ]

4. Moenter SM, DeFazio AR, Pitts GR, Nunemaker CS. Mechanisms underlying episodic gonadotropin-releasing hormone secretion. Front Neuroendocrinol 2003;24(2):79-97.         [ Links ]

5. Roa J, Aguilar E, Dieguez C, Pinilla L, Tena-Sempere M. New frontiers in Kisspeptin/GPR54 physiology as fundamental gatekeepers of reproductive function. Front Neuroendocrinol 2008;29:48-69.         [ Links ]

6. Oakley AE, Clifton DK, Steiner RA. Kisspeptin signaling in the brain. Endocr Rev 2009;30:713-743.         [ Links ]

7. Caraty A, Smith JT, Lomet D, Said SB, Morrissey A, Cognie J, et al. Kisspeptin synchronizes preovulatory surges in cyclical ewes and causes ovulation in seasonally acyclic ewes. Endocrinology 2007;148:5258-5267.         [ Links ]

8. Messager S, Chatzidaki EE, Ma D, Hendrick AG, Zahn D, Dixon J, Thresher RR, et al. Kisspeptin directly stimulates gonadotropin-releasing hormone release via G proteincoupled receptor 54. PNAS 2005;102:1761-1766.         [ Links ]

9. Navarro VM, Fernández-Fernández R, Castellano JM, Roa J, Mayen A, Barreiro ML, et al. Advanced vaginal opening and precocious activation of the reproductive axis by KiSS-1 peptide, the endogenous ligand of GPR54. J Physiol 2004;561:379-386.         [ Links ]

10. Castellano J, Navarro V, Fernandez-Fernandez R, Nogueiras R, Tovar S, Roa J, et al. Changes in hypothalamic KiSS-1 system and restoration of pubertal activation of the reproductive axis by kisspeptin in undernutrition. Endocrinology 2005;146:3917-3925.         [ Links ]

11. Arreguin-Arevalo JA, Lents CA, Farmieri TA, Nett TM, Clay CM. KiSS-1 peptide induces release of LH by a direct effect on the hypothalamus of ovariectomized ewes. Anim Reprod Sci 2007;10:265-275.         [ Links ]

12. Kadokawa H, Matsui M, Hayashi K, Matsunaga N, Kawashima C, Shimizu T, et al. Peripheral administration of kisspeptin-10 increases plasma concentrations of GH as well as LH in prepubertal Holstein heifers. J Endocrinol 2008;196:331-334.         [ Links ]

13. Ezzat-Ahmed A, Saito H, Sawada T, Yaegashi T, Yamashita T, Hirata T-I, et al. Characteristics of the stimulatory effect of kisspeptin-10 on the secretion of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and growth hormone in prepubertal male and female cattle. J Reprod Dev 2009;55:650-654.         [ Links ]

14. Alamilla RM. Respuesta de LH, FSH y GH a una aplicación de kisspeptina en becerras prepúberes de diferentes edades y su asociación con las concentraciones circulantes de leptina, IGF-1 y estradiol [tesis maestría]. México, DF: Universidad Nacional Autónoma de México; 2013.         [ Links ]

15. Santos ER, Calderón RRC, Rosete FVJ, Arreguín AJA, Vera AHR, Gutiérrez ACG, et al. Efecto de dos dosis de kisspeptina-10 (Kiss-10) en la liberación de LH y FSH y su asociación con la composición corporal y leptina sérica en becerras prepúberes [resumen]. Reunión Nacional de Investigación Pecuaria. 2011:113.         [ Links ]

16. McLeod BJ, Peters AR, Haresign W, Lamming GE. Plasma LH and FSH responses and ovarian activity in prepubertal heifers treated with repeated injections of low doses of GnRH for 72 h. J Reprod Fert 1985:74:589-595.         [ Links ]

17. Skaggs CL, Able BV, Stevenson JS. Pulsatile or continuous infusion of luteinizing hormone-releasing hormone and hormonal concentrations in prepubertal beef heifers. J Anim Sci 1986;62:1034-1048.         [ Links ]

18. Redmond RS, Macedo GG, Velez IC, Caraty A, Williams GL, Amstalden M. Kisspeptin activates the hypothalamic-adenohypophyseal- gonadal axis in prepubertal ewe lambs. Reproduction 2011;141:541-548.         [ Links ]

19. García E. Modificaciones al Sistema de Clasificación climática de Koopen. 4th ed., Instituto de Geografía, UNAM, México, 194; 1988.         [ Links ]

20. Wildman EE, Jones GM, Wagner PE, Bowman RL, Troutt HF, Lesch TN. A dairy cow body condition scoring system and its relationship to selected production characteristics. JDS 1982;65:495-501.         [ Links ]

21. Williams AR. Ultrasound applications in beef cattle carcass research & management. J Anim Sci 2002;80(Suppl 2):183-188.         [ Links ]

22. Calderón RRC, Villa-Godoy A, Lagunes LJ, Fajersson P. Desarrollo folicular en vaquillas cebú y suizo pardo peripúberes en condiciones tropicales. Téc Pecu Méx 2000;38:163-175.         [ Links ]

23. Arrieta E, Porras A, González-Padilla E, Murcia C, Rojas S, Perera-Marín G. Ovine serum and pituitary isoforms of luteinising hormone during the luteal phase. Reprod Fert Dev 2006;18:485-495.         [ Links ]

24. Perera-Marín G, Murcia C, Rojas S, Hernández-Cerón J, González-Padilla E. Pattern of circulating luteinizing hormone isoforms during the estrous and luteal phases in Holstein heifers. Anim Reprod Sci 2005;86:53-69.         [ Links ]

25. Delavaud C, Ferlay A, Faulconnier Y, Bocquier F, Kann G, Chilliard Y. Plasma leptin concentration in adult cattle: effects of breed, adiposity, feeding level, and meal intake. J Anim Sci 2002;80:1317-1328.         [ Links ]

26. Pierson RA, Ginther JO. Ultrasonography of the bovine ovary. Theriogenology 1984;21(3):495-504.         [ Links ]

27. SAS. Statistical Analysis System Institute Inc, Cary, NC, USA. 2002.         [ Links ]

28. Han SK, Gottsch ML, Lee KJ, Popa SM, Smith JT, Jakawich SK, et al. Activation of gonadotropin-releasing hormone neurons by kisspeptin as a neuroendocrine switch for the onset of puberty. J Neurosci 2005;25:11349-11356.         [ Links ]

29. Goodman RL, Karsch FJ. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology 1980;107:1286-1290.         [ Links ]

30. Wang J, Sun L, Zhang T, Zhou H, Lou Y. Effect of peripheral administration of kisspeptin-10 on dynamic LH secretion in prepubertal ewes. AJAS 2012;25;785-788.         [ Links ]

31. Hashizume T, Saito H, Sawada T, Yaegashi T, Ezzat AA, Sawai K, et al. Characteristics of stimulation of gonadotropin secretion by kisspeptin-10 in female goats. Anim Reprod Sci 2010:118:37-41.         [ Links ]

32. Tovar S, Vázquez MJ, Navarro VM, Fernández-Fernández R, Castellano JM, Vigo E et al. Effects of single or repeated intravenous administration of kisspeptin upon dynamic LH secretion in conscious male rats. Endocrinology 2006;147:2696-2704.         [ Links ]

33. Navarro VM, Castellano JM, Fernández-Fernández R, Barreiro ML, Roa J, Sanchez-Criado JE, et al. Developmental and hormonally regulated messenger ribonucleic acid expression of KiSS-1 and its putative receptor, GPR54, in rat hypothalamus and potent luteinizing hormone-releasing activity of KiSS-1 peptide. Endocrinology 2004;145:4565-4574.         [ Links ]

34. Shahab M, Mastronardi C, Seminara SB, Crowley WF, Ojeda SR, Plan TM. Increased hypothalamic GPR54 signaling: a potential mechanism for initiation of puberty in primates. PNAS 2005;102:2129-2134.         [ Links ]

35. Pirl KG, Adams TE. Induction of precocious puberty in ewe lambs by pulsatile administration of GnRH. J Reprod Fert 1987;80:355-359.         [ Links ]

36. Zulu VCh, Nakao T, Sawamuka Y. Insulin-growth like factor I as a possible hormonal mediator nutritional regulation of reproduction in cattle. J Vet Med Sci 2002;64(8):657-665.         [ Links ]

37. Block SS, Smith JM, Ehrhardt RA, Diaz MC, Rhoads RP, Van Amburgh ME Boisclair YR. Nutritional and developmental regulation of plasm leptin in dairy cattle. J Dairy Sci 2003;86:3206-3214.         [ Links ]

38. Chelikani PK, Ambrose DJ, Keisler DH, Kennelly JJ. Effects of dietary energy and protein density on plasma concentration of leptin and metabolic hormones in dairy heifers. J Dairy Sci 2009;92:1430-1441.         [ Links ]

39. Sébert ME, Lomet D, Ben Saïd S, Monget P, Briant C, Scaramuzzi RJ, et al. Insights into the mechanism by which kisspeptin stimulates a preovulatory LH surge and ovulation in seasonally acyclic ewes: Potential role of estradiol. Dom Anim Endo 2010;38:289-298.         [ Links ]

40. Mendez, P, Azcoitia I, Garcia-Segura LM. Interdependence of oestrogen and insulin-like growth factor-I in the brain: potential for analysing neuroprotective mechanisms. J Endocrinol 2005;185:11-17.         [ Links ]

41. DiVall SA, Williams TR, Carver SE, Koch L, Brüning JC, Kahn R, et al. Divergent roles of growth factors in the GnRH regulation of puberty in mice. JCI 2010;120:2900-2909.         [ Links ]

42. Hiney JK, Srivastava VK, Pine MD, Dees WL. Insulin-like growth factor-I activates KiSS-1 gene expression in the brain of the prepubertal female rat. Endocrinology 2009;150:376-384.         [ Links ]

43. Hiney JK, Srivastava V, Nyberg CL, Ojeda SR, Dees WL. Insulin-like growth factor-I of peripheral origin acts centrally to accelerate the initiation of female puberty. Endocrinology 1996;137:3717-3727.         [ Links ]

44. Hiney JK, Srivastava V, Dearth RK, Dees WL. Influence of estradiol on insulin-like growth factor-1-induced luteinizing hormone secretion. Bra Res 2004:1013:91-97.         [ Links ]

45. Yelich JV, Wettemann RP, Marston TT, Spicer LJ. Luteinizing hormone, growth hormone, insulin-like growth factor-I, insulin and metabolites before puberty in heifers fed to gain at two rates. Dom Anim Endocrinol 1996;13:325-338.         [ Links ]

46. Wilson ME. IGF-I administration advances the decrease in hypersensitivity to oestradiol negative feedback inhibition of serum LH in adolescent female rhesus monkeys. J Endocrinol 1995;145(1):121-130.         [ Links ]

47. Guerriero KA, Keen KL, Millar RP, Terasawa E. Developmental changes in GnRH release in response to kisspeptin agonist and antagonist in female rhesus monkeys (Macaca mulatta): implication to the mechanism of puberty. Endocrinology 2012;153:825-836.         [ Links ]

48. Garcia MR, Amstalden M, Williams SW, Stanko RL, Morrison CD, Keisler DH, Nizielski SE, Williams GL. Serum leptin and its adipose gene expression during pubertal development, the estrous cycle, and different seasons in cattle. J Anim Sci 2002;80:2158-2167.         [ Links ]

49. Maciel MN, Zieba DA, Amstalden M, Keisler DH, Neves JP, Williams GL. Chronic administration of recombinant ovine leptin in growing beef heifers: Effects on secretion of LH, metabolic hormones, and timing of puberty. J Anim Sci 2004;82:2930-2936.         [ Links ]

50. Zieba DA, Amstalden M, Morton S, Maciel MN, Keisler DH, Williams GL. Regulatory roles of leptin at the hypothalamic-hypophyseal axis before and after sexual maturation in cattle. BOR 2004;71:804-812.         [ Links ]

51. Rawlings NC, Evans ACO, Honaramooz A, Bartlewski PM. Antral follicle growth and endocrine changes in prepubertal cattle, sheep and goats. Anim Reprod Sci 2003;78:259- 270.         [ Links ]

52. Nogueira GP. Puberty in south american bos indicus (Zebu) cattle. Anim Reprod Sci 2004;82-83:361-372.         [ Links ]