Artículos

 

Expresión génica relacionada con el ciclo celular, apoptosis, sinaptogénesis y diferenciación celular en la diferenciación sexual de la rata

 

Genetic expression associated to cell cycle, apoptosis, synaptogenesis and cell differentiation during sex differentiation in rats

 

Héctor Herrera Gutiérrezª Adolfo Rosado García^b, Marcela Vergara Onofreª Mauricio Salcedo Vargas^c, Angel Miliar García^d, Yvonne Heuze de Icazaª Ana María Rosales-Torresª

 

^a Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco. Calzada del Hueso # 1100 Col. Villa Quietud 04960 Delg. Coyoacán. México DF. Tel (52) 55 54837000 ext. 3082. anamaria@correo.xoc.uam.mx. Correspondencia al último autor.

^b Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa. México DF.

^c Hospital de Oncología. Centro Médico Nacional S XXI. IMSS, México, DF.

^d Escuela Superior de Medicina, IPN. México DF.

 

Recibido el 8 de marzo de 2012.
Aceptado el 14 junio de 2012.

 

Resumen

Existen diferencias anatómico-funcionales importantes entre los hipotálamos de las ratas machos y hembras, las cuales son reguladas por esteroides sexuales durante un periodo crítico del desarrollo hipotalámico, especialmente por el estradiol; por ejemplo, en la rata macho, el núcleo dimórfico sexual del área preóptica es seis veces más grande que en la hembra, y en el núcleo arqueado de la hembra son más abundantes las conexiones sinápticas que en los machos. En este estudio se investigaron algunas diferencias entre machos y hembras en la expresión de genes relacionados con la apoptosis, neurogénesis y sinaptogénesis en ratas de 4 h de nacidas, además se evaluó el efecto de la administración temprana de propionato de testosterona (PT) a hembras y tamoxifen (Tx) a machos, sobre el patrón de expresión del grupo de genes referidos, para lo cual se usó un análisis con microarreglos de DNA, combinado con qPCR; se encontraron diferencias en la expresión de los genes en hipotálamos de hembras y machos. En las hembras, hubo una mayor expresión de genes relacionados con la apoptosis: IL-24, Smpd3, Tpa, Pp4, Map3k1, Pge y Naca3; con la diferenciación celular, Neurod2, Zic1 y Epo y con la sinapsis y el control del ciclo celular; Syt7, Tgfbr1, Ptf1a y Cox2. También se muestra que la aplicación de Tx en los machos provocó un patrón de expresión génica similar al de las hembras testigo, mientras que el PT en las hembras no modificó la expresión de genes.

Palabras clave: Diferenciación sexual hipotalámica, Microarreglos, Expresión de genes, Apoptosis, Diferenciación celular.

 

Abstract

Important anatomical-functional differences are found between hypothalamus of male and female rats which appear and are regulated by sexual steroids during the critical hypothalamic development period. This is especially true of estradiol's involvement. In this study, several genetic differences between male and female rats were assessed. These differences are related to gene expression to apoptosis, neurogenesis and synaptogenesis in four-hour old rats. The effect of early administration of testosterone propionate (TP) to female rats, and tamoxifen (Tx) to male rats on the gene pattern expression was reviewed using dNa microarray analysis combined with qPRC. Gene expression differences were found in female and male hypothalamus. In female rats, there was greater gene expression related to apoptosis: IL-24, Smpd3, Tpa, Pp4, Map3k1, Pge and Naca3; to cell differentiation, Neurod2, Zicl and Epo; and to synapsis and the control of the cell cycle, Syt7, Tgfbr1, Ptf1a and Cox2. It was also shown that administration of Tx to male rats caused similar genetic expression to that of female rats, while TP given to female rats was not as effective in modifying gene expression. These results clearly show that in the absence of estradiol in female rats, genes favoring cell death are expressed which may explain size differences in certain hypothalamic areas in male and female rats. This may be due too to the fact that in male hypothalamus, certain areas are provided with greater estradiol alpha type receptors and therefore with manifest neuroprotection and other areas with beta receptors where apoptosis predominates.

Key words: Hypothalamic sexual differentiation, Microarrays, Gene expression, Apoptosis, Cell differentiation.

 

INTRODUCCIÓN

Las diferencias morfológicas, fisiológicas, bioquímicas y de comportamiento entre machos y hembras se denominan, en su conjunto, dimorfismo sexual; éste involucra cambios en algunos núcleos o circuitos cerebrales^(1,2,3). Por ejemplo, el tamaño del núcleo dimórfico sexual del área preóptica de la rata, es seis veces mayor en machos que en hembras⁽⁴⁾; el núcleo paraventricular es más grande en las ratas hembras que en las macho⁽⁵⁾. Hay un mayor desarrollo dendrítico del área preóptica en el macho⁽⁶⁾ que en la hembra y en éstas, además hay un menor número de sinapsis en las espinas dendríticas del área preóptica del hipotálamo⁽⁵⁾. En cuanto a la función bioquímica, las neuronas de los machos tienen una mayor expresión y actividad de aromatización en comparación con las hembras⁽⁷⁾. La expresión del sistema calcio calmodulina, es mayor en las ratas macho que en las hembras⁽⁸⁾. Phoenix et al⁽⁹⁾, propusieron que el estradiol puede actuar fundamentalmente en dos formas diferentes: primero en una etapa "organizacional" durante el periodo prenatal y postnatal temprano, y en una etapa "activacional" en la edad adulta. El efecto organizacional del estradiol conduce a la diferenciación sexual del hipotálamo y regula activamente los circuitos neuronales sexualmente dimórficos⁽³⁾.

Durante el desarrollo, el cerebro de los machos está expuesto a altos niveles de testosterona de origen testicular que incrementan al final de la gestación y aproximadamente a las 2 h de nacidos; en contraste, la circulación de testosterona es consistentemente baja en ratas hembras perinatales. En ratas recién nacidas, los niveles de estradiol son relativamente bajos, pero en el macho son elevados debido a la aromatización de testosterona en neuronas de la periferia. Las alfa-fetoproteínas circulantes en el feto, se unen de manera específica al estradiol y en el caso del cerebro de las hembras, éstas lo protegen del efecto masculinizante del estradiol⁽¹⁰⁾; de esta manera se asume que los altos niveles de estrógenos plasmáticos presentes en la rata recién nacida se encuentran secuestrados por su unión a estas proteínas fijadoras de estrógenos. Por el contrario, en el macho concentraciones bajas de testosterona, pueden ser capaces de provocar la androgenizaeión del hipotálamo^(11,12,13). Dörner and Hinnz⁽¹⁴⁾, encontraron que la presencia de testosterona durante el periodo crítico en el macho, la cual puede ser de origen gonadal en el macho intacto o por la administración exógena de propionato de testosterona (PT) a una hembra o macho castrado, provoca la masculinización permanente. La participación fundamental que tienen los estrógenos en el proceso de diferenciación sexual se ha comprobado por diversos autores con el uso de antiestrógenos como el tamoxifen^(15,16,17); éste interfiere para que el estradiol interaetúe con su receptor en el hipotálamo, además produce un efecto inhibitorio sobre aromatasa, que impide la transformación de los andrógenos testiculares a estrógenos⁽¹⁸⁾.

Las diferencias en el número de neuronas y conexiones sináptieas entre machos y hembras, pueden deberse a tres posibilidades: a la regulación de la sinaptogénesis, neurogénesis, o bien, a la participación del estradiol en la sobrevivencia, prevención o muerte neuronal^(3,19). Se ha propuesto que el efecto genómico del estradiol ocasiona en algunas áreas hipotalámicas diferencias sexuales en cuanto a los niveles de expresión de algunos genes^(3,19,20), que pueden modificar el desarrollo de núcleos hipotalámicos, por ejemplo el gen Otp puede alterar la neurogénesis; Otp y SF-1, la migración celular y los genes Brn2, Siml y Arnt2 median el proceso de muerte celular⁽¹⁹⁾.

El papel de los estrógenos es evidente como regulador de la intercomunicación neuronal, mediante su participación en dos tipos de procesos, en primera instancia la participación de los esteroides gonadales influyen en la determinación del número de neuronas que componen algunos núcleos dimórficos centrales, particularmente del Núcleo Dimórfico Sexual del Área Pre-Óptica (SDN-APO) de la rata macho adulta y el núcleo ventromedial en la hembra, las hormonas gonadales también participan en la organización del árbol dendrítico de algunas regiones neuronales. Estas hormonas además pueden estimular la neurogénesis o prolongar el periodo en el que ocurre, o bien pueden modular la migración de neuronas recientemente formadas a las regiones del área preóptica (APO) y promover la sobrevivencia durante este proceso, previniendo la muerte celular, y a su vez participar en la especificidad de las neuronas en términos de funcionalidad o identificación neuroquímica. Con el propósito de explicar diferencias en tamaño y funcionalidad del hipotálamo de machos y hembras, en este trabajo se propuso conocer la expresión de algunos genes relacionados con muerte celular, apoptosis, neurogénesis, diferenciación y sinaptogénesis en hipotálamos de ratas machos y hembras recién nacidas y, conocer si la manipulación hormonal en la primera hora del nacimiento en ambos sexos modifica los niveles de expresión de estos grupos de genes.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de muestra

Ratas gestantes de la cepa Wistar, se mantuvi eron en jaulas en un ambiente controlado (21° C de temperatura, 14 h de luz, 10 h de oscuridad), con agua y alimento ad libitum, hasta el parto. Se consideró como hora cero, el nacimiento de cada una de las crías de una camada. Las ratas recién nacidas, se distribuyeron al azar en los grupos experimentales de acuerdo al sexo. Se conformaron cuatro grupos; dos grupos de machos y dos de hembras con ocho animales cada uno. Una hora después del nacimiento, un grupo de hembras y uno de machos fueron tratados con 20 μl de aceite de girasol (grupos testigo), y los grupos restantes fueron los tratados; al grupo de ratas machos con el propósito de inducirles feminización, se le trató con 200 μg de tamoxifen (Tx), ya que se ha visto que, no solo actúa para impedir la aromatización de los andrógenos testiculares a estrógenos, sino también a la subsecuente interacción de estos estrógenos con el material nuclear⁽²⁰⁾, en 20 μl de aceite de girasol; y al grupo de hembras, para masculinizarlas se le trató con 30 μg de propionato de testosterona (PT) en 20 μl de aceite de girasol por vía subcutánea⁽²¹⁾. Las ratas de los cuatro grupos se decapitaron a las 3 h post-tratamiento, e inmediatamente se realizó la disección de los hipotálamos mediante una modificación del método de Vangala⁽²²⁾, utilizando los siguientes límites: anterior al quiasma óptico; posterior, los cuerpos mamilares, y lateralmente los surcos hipotalámicos de ambos lados. Los hipotálamos se almacenaron a -70 °C hasta el aislamiento del RNA. Se formaron pooles con los ocho hipotálamos de los animales de cada grupo y de ellos se extrajo el RNA total mediante la técnica de Chomczynski and Sacchi⁽²³⁾.

Microarreglos

Se obtuvo cDNA a partir de 0.5 μg de RNA total del pool de cada grupo, con el uso de un estuche comercial (Amersham RPN620 Cyscript). La identificación de la expresión de genes se realizó mediante el uso de microarreglos de cDNA 5k pan rat de MGW con 5,760 genes en laminillas de cristal. El marcaje y la hibridación del cDNA se realizó por competencia, de acuerdo a lo siguiente: a) en el microarreglo uno, se comparó la expresión de genes entre machos y hembras testigo, el cDNA de los machos se marcó con Cy5 y el de las hembras con Cy3; b) en el segundo microarreglo se compararon hembras testigo con hembras tratadas, en este caso se marcó con Cy5 el cDNA de las hembras testigo y con Cy3 a las hembras tratadas; c) en el tercer microarreglo, se compararon machos testigo con machos tratados, el cDNA de los machos testigo, se marcó con Cy5 y un escaner ScanArray 4000 Packard BioChips Technologies (Packard Co., Manning Road Billerica USA). La lectura del fluoróforo Cy3 se obtuvo a 532 nm y a 635 nm la de Cy5.

El análisis de las imágenes obtenidas de cada microarreglo, se realizó con el programa ARRAYPRO ANALIZER (Media Cybernetics, Inc. East-West Bethesda MD USA) que fue utilizado para realizar la normalización y el análisis de los datos. Se realizó una prueba de t-student para conocer la distribución de los logaritmos naturales de las proporciones de cada gen con respecto a 0, además se calculó el valor de la probabilidad (P<0,05) para determinar la significación estadística de la expresión diferencial de cada gen en cada tipo de matriz de ADN.

Los resultados de este estudio, representan los datos de dos determinaciones independientes, cabe señalar que en ningún caso, las diferencias entre los resultados fueron mayores a 10-15 %, por lo que se presentan los promedios. El criterio que se aplicó para evaluar la expresión de un gen, se hizo con respecto a lo siguiente: cuando el logaritmo base 2 del cociente de los valores de la fluorescencia que existe entre la densidad problema y la basal fue mayor a 1.2, se consideró expresado a la alta, y a la baja cuando el valor fue menor a -1.2 unidades. Los incrementos o disminuciones en la expresión de los genes se realizó comparando los coeficientes de fluorescencia entre hembras testigo (HT): machos testigo (MT), hembra testigo (HT): hembras tratadas con PT (HPT): machos testigo (MT) y machos tratados con Tx (MTx).

Validación de la expresión mediante q-PCR y Universal Probe Library

Para validar o corroborar la confiabilidad de los resultados de expresión génica obtenidos de los microarreglos, se calculó la expresión cuantitativa de los genes Map3k1, Smpd3, Naca3 por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR), los genes se eligieron con base en los cambios importantes que mostraron en los microarreglos y porque representan procesos de muerte, supervivencia y control del ciclo celular respectivamente. Se verificó la pureza e integridad del RNA por electroforesis, se sintetizó cDNA a partir de 1 ug de RNA total empleando hexámeros al azar con un estuche comercial (Transcriptor cDNA synthesis kit de Roche, Germany). La q-PCR se realizó en un equipo Roche LightCycler 1.5 utilizando diseños específicos para los genes mencionados y como gen de referencia β-actina, empleando el sistema de sondas universales tipo TaqMan (Roche, Universal Probe Library Rat set, cat. 04683650001), mismo que emplea un diseño de iniciadores para PCR en combinación con una sonda corta de 8-9 nucleótidos de RNA, marcada con el fluorocromo reportero FAM y apagada con DHQ. La reacción se realizó de acuerdo a las indicaciones del fabricante: 1 ul de cDNA, iniciadores 200 nM, sonda 100 nM y 1X de mezcla maestra del estuche comercial de amplificación LightCycler TaqMan Master (cat. 04535286001). La secuencia de iniciadores y sonda para cada gen se presenta en el Cuadro 1. El programa de amplificación fue el recomendado por la casa comercial que diseñó la sonda y los iniciadores, el cual consistió en: 10 min a 95 °C de activación y 40 ciclos de PCR seguido por 95° por 10 seg, 60° en 30 seg y por último 72° durante 1 seg, la linealidad y la eficiencia de la amplificación se evaluó para todos los genes. El análisis de cuantificación relativa (ΔΔ Ct) de la expresión génica de los genes seleccionados para la validación, se realizó empleando el software LightCycler 4.0. Los resultados se presentan como el cambio en el número de veces que un RNAm se expresa en una muestra con respecto al calibrador o gen constitutivo, en este caso β-actina.

 

RESULTADOS

La comparación entre los resultados obtenidos del análisis de cuantificación relativa por qPCR de los tres genes seleccionados y los obtenidos por microarreglos indican que existe una correspondencia mayor al 90 % (Cuadro 2), lo cual le da certidumbre a la expresión génica de todos los genes analizados en los microarreglos.

Los genes asociados a los procesos de muerte, supervivencia y control del ciclo celular que de acuerdo a los criterios establecidos se expresaron a la alta y a la baja en hipotálamos de los grupos de ratas estudiados se presentan en el Cuadro 3. La comparación entre los grupos MC y HC indica que el grupo HC presenta una expresión a la alta en 24 genes, de los cuales 10 (IL-24, No13, Ptgs2, Smpd3, Map3k1, Pge, Tpa, Pp4, Naca3 y Bcl2l) están involucrados en la muerte celular por apoptosis; cuatro relacionados con diferenciación celular; (Ptf1a, Neurod2, Zic1, Epo), dos con sinaptogénesis (Neurod2 y Syt7) y seis eon proliferación celular (Nri3, Strn3, Odcl, Cox2, Tgfbrl y Epo), así como cuatro genes más con actividades diversas (Pf4, Vegfb, Rgn, Ss100a6), cabe señalar que Neurod2 participan en la diferenciación y sinaptogénesis, y Epo en proliferación y diferenciación. La comparación entre los grupos MT y MTx, permite observar que el tratamiento a ratas macho con Tx provocó la expresión al alta de 17 genes (IL-24, No13, Smpd3, Map3k1, Pge, Tpa, Pp4, Naca3, Ptf1a, Syt7, Nrli3, Strn3, Epo, Pf4, Vegfb, Rgn, S100a6), los cuales cabe señalar que también fueron expresados a la alta en las hembras testigo. En el grupo MTx, además se expresaron a la alta tres genes relacionados con proliferación y diferenciación celular (Neurod1, Cspg4 y Nos3), lo cual no ocurrió en el grupo HC. Según los resultados de la comparación entre el grupo HT y HPT, indican que a diferencia del efecto del tratamiento con Tx que presentaron los machos, en las hembras el tratamiento con PT, no se modificó de forma significativa la expresión de la gran mayoría de los genes de interés en este trabajo, de manera que con excepción del gen Vegfb, que regula la angiogénesis, no hubo más diferencias entre estos grupos.

 

DISCUSIÓN

Los resultados de este trabajo señalan diferencias importantes entre el hipotálamo de hembras y machos en la rata. Los hipotálamos de las hembras sin tratamiento comparados con los machos en la misma condición tuvieron una mayor expresión de genes relacionados con la muerte celular, proliferación, sinaptogénesis y diferenciación celular (24 genes expresados a la alta). Adicionalmente se demuestra que el hipotálamo de las ratas, especialmente el de los machos, responde a muy temprana edad (una hora de nacidas) al tratamiento hormonal El hipotálamo de los machos tratados con Tx, en términos de expresión de los genes estudiados en este trabajo, se acercó mucho al número de genes expresados a la alta (17 de 24 genes) en el hipotálamo de las hembras testigo. Mientras tanto, las hembra tratadas en comparación con las testigo, sólo expresaron a la alta un gen, Vegfb.

En este trabajo se demostró por primera vez la expresión de 10 genes relacionados con la apoptosis en las hembras testigo, cuatro de los cuales (II-24, No13, Smpd3 y Naca3) participan en la señalización del inicio del proceso de la apoptosis^(24,25,26), lo cual da fundamento a los hallazgos encontrados sobre muerte celular que pueden ser la explicación al menor volumen en algunas áreas o núcleos hipotalámicos que otros autores han reportado en las hembras^(19,27,28). Es importante señalar que hasta ahora sólo se había reportado la presencia de apoptosis en las células hipotalámicas en tiempos muy tardíos de la diferenciación sexual del hipotálamo (de 25 h a 6 días después del nacimiento)^(27,28), mientras que en este trabajo se demuestra la expresión de genes relacionados con la señalización de la apoptosis en una etapa muy temprana del nacimiento (4 h post nacimiento).

Es ampliamente conocido que el estradiol participa de manera muy importante en el establecimiento del dimorfismo sexual^(11,12), en el macho, los estrógenos, producto de la aromatización de la testosterona que producen sus gónadas, son necesarios para masculinizar y desfeminizar los circuitos cerebrales que regulan el comportamiento y la secreción gonadotrófica típicas de su sexo, lo cual en la hembra, es evitado porque maneja niveles mucho más bajos de testosterona que el macho, y los estrógenos presentes en el feto hembra se unen con alta afinidad a la alfa-feto proteína evitando su llegada al sistema nervioso central (SNC)⁽²⁹⁾. El estradiol, participa en la diferenciación, proliferación y prevención de la muerte celular en el SNC⁽³⁰⁾; esta diferencia funcional del estradiol se debe básicamente a que puede interactuar con dos tipos de receptores en las células hipotalámicas: los receptores α (ERα) y los receptores β (ERα) y aunque ambos presentan la misma afinidad por los estrógenos, la respuesta que produce cada uno es diferente⁽³¹⁾, La unión de estradiol a ERα o al heterodímero ERα-ERβ ejercen un efecto neuroprotector, mientras que la interacción con el receptor ERβ, sin la presencia de ERα potencializa la apoptosis⁽³²⁾. Los receptores alfa y beta están distribuidos en el hipotálamo y otras áreas dimórficas del cerebro, de manera que durante la etapa sensible al estradiol, la presencia de ERa en áreas como el SDN-APO reduce la apoptosis provocando un mayor tamaño de esta área en machos que en hembras y, puede verse favorecida la apoptosis en áreas como el núcleo dimórfico anteroventral periventricular (AvPVN), por eso, es más pequeña esta área en los machos⁽³³⁾. También se ha visto que dentro de los aspectos no genómicos del estradiol durante la diferenciación sexual del hipotálamo está el papel que juega el sistema de Ca²+/calmodulina el cual media procesos inflamatorios, metabólicos, apoptóticos, además de regular el movimiento intracelular y el crecimiento de células nerviosas; asimismo interactúa con un amplio rango de enzimas y componentes del citoesqueleto disparando respuestas bioquímicas altamente específicas que se ejercen a través de las proteínas. Adicionalmente el complejo Ca⁺²/calmodulina activa una serie de cinasas que en última instancia fosforilan factores de transcripción, que regulan la expresión génica. La enzima fosfodiesterasa de AMPc es regulada por este complejo, lo que significa un nexo de unión entre la actuación de dos segundos mensajeros, el calcio y el AMPc, además participa en la producción de GMPc. Existe información que confiere al sistema Ca⁺²/ calmoulina en hipotálamo un papel importante en la diferenciación sexual; en la rata macho los niveles de este complejo son mayores que en la hembra, así como mayor nivel de expresión de la proteína en machos en la región derecha, presentando entonces una simetría funcional durante este periodo^(9,21,34).

Nuestros resultados indican que cuando se aplica Tx a machos de una hora de nacidos y sacrificados 3 h después, el patrón de expresión génica es muy similar al de las hembras testigo, lo cual indica que el tratamiento feminiza el hipotálamo del macho y resalta la importancia del estradiol en el proceso de diferenciación sexual del hipotálamo. Sin embargo la expresión génica de las hembras tratadas con PT dejó claro que esta hormona aplicada una hora después del nacimiento, no cambia de manera sustancial la expresión de genes de las hembras sacrificadas tres horas después, estos resultados difieren al menos en lo que otros autores han reportado del efecto de este tratamiento evaluado en la vida adulta, por ejemplo: Phoenix et al⁽⁹⁾ y Barraclough⁽¹⁵⁾ señalaron que la administración de 1.25 mg PT a hembras durante la etapa fetal y los primeros días después del nacimiento, provocan anovulación, estro persistente y características masculinas en la edad adulta. Sin embargo otros estudios han reportado cambios en la expresión de mRNA del gen c-fos a las 2 h después del tratamiento con PT a ratas hembras⁽³⁵⁾. En otros trabajos, se ha demostrado que el tratamiento a hembras con testosterona puede inducir un desarrollo estereotípico de macho, pero sólo cuando la hormona es administrada en altas dosis y en periodos largos de exposición, adicionalmente se ha reportado que existen cambios negativos cualitativos y cuantitativos en la conducta de las hembras tratadas con PT^(36,37).

Nosotros proponemos que las hembras tratadas con PT, no mostraron cambios importantes en la expresión génica, debido a que el hipotálamo de la hembra es menos eficiente que el del macho para aromatizar la testosterona. Se conoce que los andrógenos son los inductores de la aromatasa en el hipotálamo, por lo que la diferencia en la actividad de la aromatasa en las hembras puede ser debida a la menor cantidad de andrógenos circulantes que éstas manejan. Se ha demostrado que la presencia de RNAm de la aromatasa durante los primeros dos días de vida son mayores en el macho que en la hembra en varios núcleos dimórficos hipotalámicos y esta diferencia sólo disminuye alrededor del día 15 de vida^(38,39).También se ha reportado que el nivel de estradiol en machos es mayor que en hembras a las 2 h de nacidos y que la administración de PT a hembras no tiene ningún efecto en los niveles de estradiol en el hipotálamo debido a que la concentración de aromatasa en el hipotálamo de hembras es muy bajo comparado con el de machos^(40,41).

Como se dijo, además de la neuroprotección, al estradiol se le han atribuido efectos en el crecimiento y diferenciación neuronal^(42,43), sin embargo nuestros resultados, no apoyan esta idea, ya que en los hipotálamos de las hembras se expresaron a la alta los genes Neurod2, Zic1, Syt7, Epo y Tgf1a, cuya función está relacionada con diferenciación y sinaptogénesis. Adicionalmente cuando se comparó la expresión de genes entre hipotálamos de machos control y tratados con Tx, no se vieron diferencias en la expresión de los genes Neurod2, Zic1 y Tgf1a, lo cual apoya que los estrógenos no son los responsables directos de la expresión de genes que están ligados a la diferenciación neuronal como otros lo indican⁽⁴⁴⁾.

Nosotros proponemos una ruta en la cual se involucran a algunos de los genes detectados en este trabajo y que puede ayudar a explicar las diferencias anatomo funcionales en el hipotálamo de machos y hembras: la sobreexpresión del gen II24 (Mda-7), ejerce su participación con la inducción de la apoptosis mediando la expresión y función de la familia Gadd (growth arrest and DNA damage), a su vez esta familia tiene efectos sobre la disminución en la función y expresión de bcl-2^(26,45) y en el aumento de las esfigomielinas como la sphingomyelin phosphodiesterase 3 (Smpd3) la cual media la activación de las ceramidasas y la activación del sistema Fas-Fas ligand^(24,25,32) y con ello se desencadena la cascada de eventos que llevan al bloqueo del ciclo celular (PI3K, PKA) y lleva a la apoptosis de las neuronas tal como otros lo mencionan^(46). Además, la expresión de genes que regulan los niveles de calcio en la célula como el gen Naca están involucrados en el proceso de muerte al aumentar los niveles de calcio, los cuales tienen una importante participación durante la apoptosis; por ejemplo, se conoce ampliamente la necesidad del calcio para activar a las endonucleasas que rompen el DNA y provocan la clásica imagen de escalera cuando éste se hace correr a través de un gel de agarosa⁽⁴⁷⁾, o bien se aumentan los niveles de expresión de los genes TPA y PP4 que también pueden modular la muerte, al activar a Bad que es una proteína proapoptótica, además de inhibir a algunos factores de crecimiento como NGF⁽⁴⁸⁾.

 

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

En conclusión, se observó que el hipotálamo de la rata de 4 h de nacida presenta diferencias sexuales importantes en cuanto a la expresión de genes que participan en la apoptosis, el ciclo celular y la diferenciación celular. Los resultados además sugieren que el establecimiento organizacional del cerebro de la hembra es un proceso activo, dado el número de genes expresados a la alta en la hembra control y el efecto que tiene el Tx en el aumento de los niveles de expresión de genes y que estos aumentos involucren un cambio activo que feminiza al macho. Cabe mencionar que se ha propuesto que el cerebro es bipotencial y que depende del tipo de estímulo para desarrollar patrones de las primeras cuatro horas del nacimiento, las ratas tienen un hipotálamo más sensible a los cambios hormonales, especialmente en los machos dado que la inhibición de la acción del estradiol por la aplicación de Tx, les ocasionó la feminización hipotalámica. Por el contrario el hipotálamo de la hembra, no modificó de forma sustancial su expresión génica cuando se le aplicó una fuente de estradiol como es el PT. En el caso de las hembras, se ha establecido que la ausencia o concentraciones bajas de estradiol son necesarias para feminizar al hipotálamo de ratas, por lo que los requerimientos de estrógenos en el macho con respecto a la hembra son mas de carácter cuantitativo que cualitativo, además es conveniente ir más allá en identificar la acción proactiva del estradiol sobre las estructuras hipotalámicas, así como el papel de los receptores p predominante en las hembras, y su permanencia postparto.

 

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se llevó a cabo gracias a los recursos proporcionados por el Ministerio de Educación Pública para el cuerpo académico de "Aplicación de la biología molecular en el estudio de la reproducción animal". Los autores también desean agradecer al MSc. Fausto Sánchez por su ayuda en la realización de la q-PCR (Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco) y a la Unidad de Microarreglos del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM para el análisis de los microarreglos.

 

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