Notas de investigación

 

Detección de Listeria monocytogenes, Salmonella y Yersinia enterocolitica en carne de res en puntos de venta en México

 

Detection of Listeria monocytogenes, Salmonella and Yersinia enterocolitica in beef at points of sale in Mexico

 

Maria Salud Rubio Lozano^a, José Fernando Martínez Bruno^a, Rigoberto Hernández Castro^a, Cynthia Bonilla Contreras^a, Rubén Danilo Méndez Medina^a, José Fernando Núñez Espinosa^a, Alejandro Echeverry^b, Mindy M. Brashears^b

 

^a Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Centro de Enseñanza Práctica, Investigación en Producción y Salud Animal. Av Cruz Blanca No. 486. Colonia San Miguel Topilejo, Delegación Tlalpan. 04500. México, DF. Tel.: +52-55-8480810; fax: +52-55-8480514; msalud@unam.mx. Correspondencia al primer autor.

^b Department of Animal and Food Sciences, Texas Tech University, USA.

Recibido el 21 de junio de 2011.
Aceptado el 15 de noviembre de 2011.

Resumen

El objetivo de este trabajo fue detectar la presencia de Listeria monocytogenes, Salmonella y Yersinia enterocolitica en carne de res, mexicana e importada, adquirida en supermercados en tres ciudades de México. Antes de analizar los productos cárnicos, se estimó el límite de detección usando métodos basados en reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tanto de cultivos bacterianos puros como de carne inoculada. Un total de 90 muestras, mitad mexicanas y mitad importadas, fueron recolectadas en este estudio. Un total de 27.78 % muestras analizadas por PCR fueron positivas a L. monocytogenes, 8.89 % a Salmonella y 28.89 % a Y. enterocolitica. Ninguna de las muestras importadas fue positiva a Salmonella. Las muestras mexicanas presentaron mayor índice de Listeria, Yersinia y Salmonella que las muestras de carne importada, lo que indica un posible riesgo de salud para los consumidores que adquieren este tipo de producto. Estos resultados enfatizan la necesidad de implementar de forma obligatoria programas de prevención y control, Procedimientos Operativos Estandarizados de Sanitización (POE's- SSOP's en inglés) y Análisis de Peligros y Puntos de Control Críticos (APPCC- HACCP en inglés) en la industria cárnica mexicana.

Palabras clave: Listeria, Salmonella, Yersinia, Carne de res, PCR, México.

 

Abstract

The objective of this project was to detect the presence of Listeria monocytogenes, Salmonella and Yersinia enterocolitica in Mexican and imported beef steaks purchased at supermarkets in three cities of Mexico. Prior to testing beef products, detection limits using PCR-based methods were conducted from both pure bacterial cultures as well as inoculated beef. A total of 90 samples, half of Mexican and half of imported origin, were collected in this study. Overall, a total of 27.78 % of samples tested via PCR were positive for L. monocytogenes, 8.89 % for Salmonella and 28.89 % for Y. enterocolitica, respectively. None of the imported samples tested positive for Salmonella. Mexican samples had a higher Listeria, Yersinia, and Salmonella presence than imported samples, indicating a possible health risk to consumers purchasing this type of product. These results emphasize the need to implement the mandatory use of preventive and control programs, Sanitation Standard Operating Procedures (SSOPs) and HACCP in the Mexican meat industry.

Key words: Listeria, Salmonella, Yersinia, Beef, PCR, Mexico.

 

En México existen muchas variantes en las condiciones sanitarias de la carne de res; estas condiciones son dependientes del desarrollo económico de la industria en las diversas regiones geográficas del país. La región norte de México, que incluye los estados de Chihuahua y Nuevo León, ha mostrado tener un gran desarrollo económico e industrial en comparación con los estados localizados en el centro y sur. Este desarrollo ha tenido como consecuencia un impacto en las condiciones higiénicas de los rastros y de los puntos de venta y por lo tanto, en la presencia y desarrollo de patógenos en la carne. En México, se ha informado con anterioridad de la presencia de bacterias como: Listeria, Salmonella, Yersinia y Staphylococcus, entre otros agentes causantes de enfermedades transmitidas por alimentos, en donde la carne y sus derivados actúan como vehículos potenciales para la transmisión de estos patógenos^(1,2,3,4).

Los análisis microbiológicos convencionales son laboriosos debido al tiempo que se requiere para obtener resultados, ya que dependen de pruebas estándar para aislar y confirmar diversos patógenos en la carne. Sin embargo, debido a las características de la PCR (especificidad, sensibilidad, velocidad, límite de detección y selectividad) se ha incrementado el uso de esta tecnología para estandarización y validación como prueba de diagnóstico para detectar patógenos^(5,6,7). La detección oportuna y confiable de varios patógenos bacterianos en cualquier fase de la cadena cárnica, es un paso importante hacia su control, monitoreo y prevención.

El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia de Listeria monocytogenes, Salmonella y Yersinia enterocolitica mediante PCR en carne mexicana e importada vendida en supermercados en tres ciudades de México: Nuevo León (norte), Ciudad de México (centro) y Tabasco (sur), representando las principales regiones económicas del país.

Con el fin de validar los límites de detección de los métodos utilizados en este trabajo, se llevó a cabo un estudio inicial de inoculación de productos cárnicos.

Las cepas usadas en este trabajo fueron L. monocytogenes LNA 102/99 FDA1OMS, Salmonella Typhimurium A TIC 14579 y Y. enterocolitica ENCB-0752. Las cepas se conservaron y almacenaron a -80 °C en infusión cerebro corazón (BHI) y glicerol al 50%. Antes de cada prueba se determinó la viabilidad y la pureza. Una colonia representativa de cada una fue inoculada en agar selectivo que contiene polimixina-acriflavina-litio cloro-ceftazidima-esculina-manitol (PALCAM) para L. monocytogenes, agar bismuto sulfito (BSA) para Salmonella y agar cefsulodina-irgasán-novobiocina (CIN) para Y. enterocolitica, respectivamente.

Para validar los límites de detección de Salmonella y L. monocytogenes en este estudio, 25 g de carn e de res fu eron tom ados aleatoriamente y colocados en 225 ml de caldo lactosa. Para Y. enterocolitica se colocaron 10 g de carne en 90 ml de caldo de enriquecimiento sel ectivo para Yersinia (YSB). Todas las muestras fueron homogeneizadas por 3 min (dilución primaria) y finalmente inoculadas con cada uno de los microorganismos^(8,9). Cada dilución tuvo una fase de enriquecimiento de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana^(10,11). Al final del enriquecimiento, se hicieron diluciones decimales (hasta 10^-10) para determinar el límite mínimo de detección de UFC por PCR. Las diluciones se incubaron a 37 °C por 24 h y la relación correcta entre el número de UFCs y sus diluciones correspondientes se midió a 3.0 x 10⁷, 1.0 x 10⁶ y 1.8 x 10⁷ UFC/g para L. monocytogenes, Salmonella Typhimurium y Y. enterocolitica, respectivamente. El ADN se extrajo mediante el método previamente descrito por Millar et al⁽¹²⁾. Se usó el siguiente programa de amplificación: 1 paso a 94 °C/5 min, 35 ciclos de 60 seg a 94 °C (desnaturalización), 60 seg a 56 °C (alineación), 80 seg a 72 °C (extensión) y 8 min a 72 °C (extensión final).

Una colonia típica de cada microorganismo se incubó en 10 ml de caldo tripticasa soya (TSB) a 37 °C por 24 h. El ADN se extrajo por el método Silhavy⁽¹³⁾.

Los iniciadores Mar1 y Mar2, 5'-GGGCTTTATCCATAAAATA-3' y 5'-TTGGAAGAACCTTGATTA-3', que amplifican un fragmento de 453 bp del gen iap⁽¹⁴⁾, se usaron para L. monocytogenes. Para Salmonella Typhimurium se usaron los iniciadores 139 y 141 (5'-CAGTGGTGTCATATCATTGCC-3' y 5'-GTAAGAAGGTGCTTATACATC-3'), que generan un fragmento de 284 bp del gen invA^(6,15), y para la detección de Y. enterocolitica se usaron los iniciadores 5'CTATTGGTTATGCGCAAAGC-3' y 5'-TGCAAGTGGGTTGAATTGCA-3 ', que amplifican un fragmento de 354 bp del gen ail, exclusivos para serotipos patogénicos⁽¹⁶⁾.

Se usó ADN de L. monocytogenes puro y S. Typhimurium a una concentración de 0.26 ng/μl, S. Typhimurium a 0.4 ng/μl y Y. enterocolitica a 0.4 ng/μl. Se realizaron diluciones dobles para determinar la cantidad mínima detectable de ADN genómico. Cuando se estableció el límite de detección de ADN puro, se determinó su equivalencia a un número de genomas⁽¹⁷⁾ y genomas 0.2, 0.4 y 0.16 para L. monocytogenes, Salmonella y Y. enterocolitica, respectivamente. La PCR se realizó con 1 ciclo de 94 °C/5 min, 30 ciclos a 94 °C/30 seg (desnaturalización), 30 seg a 56 °C (alineamiento), 30 seg a 72 °C (extensión) y 5 min a 72 °C (extensión final). En cuanto a L. monocytogenes, la temperatura en la fase de alineamiento fue de 50 °C. En todas las pruebas, los productos amplificados se evaluaron en un gel de agarosa al 2% usando el digesto Mspl de pBR322 como marcador de peso molecular. Para todos los experimentos, el agua estéril y el ADN genómico de cada organismo se usaron como controles negativos y positivos, respectivamente.

Se inoculó individualmente una colonia típica de cada microorganismo en 10 ml de caldo Luria-Bertani (LB) y se incubó a 37 °C/24 h. Después de la incubación, se tomaron 0.5 ml de cada cultivo y se crecieron en 9.5 ml de LB, repitiendo la incubación cada 4 h. Los niveles de concentración inicial fueron: 3.0 x 10⁷, 5.0 x 10⁶ y 2.0 x 10⁸ UFC/ml para L. monocytogenes, S. Typhimurium y Y. enterocolitica, respectivamente. Se prepararon diluciones decimales sucesivas (hasta 10^-10). Las condiciones para PCR fueron: 1 ciclo a 94 °C/5 min, 30 ciclos de 40 seg a 94 °C (desnaturalización), 45 seg a 56 °C (alineamiento), 60 seg a 72 °C (extensión) y 5 min a 72 °C (extensión final).

El presente estudio se llevó a cabo en tres ciudades de México: Monterrey (norte: estado de Nuevo León), Villahermosa (sur: estado de Tabasco), y Ciudad de México (centro: Distrito Federal). Para este estudio se obtuvieron 90 muestras de carne de res (25 0 g) de supermercados asociados con la Asociación Nacional de Tiendas y Autoservicio y Departamentales (ANTAD)⁽¹⁾ y de Wal-Mart de México S.A de C.V. Un total de 30 muestras de carne procedentes del norte, 20 del centro y 40 del sur. De éstas, 50 % fueron nacionales (producido en México) y 50 fueron importadas. Las muestras de carne se colectaron 12 h antes del procesamiento y se mantuvieron a 4 °C hasta que se realizó la prueba microbiana.

La extracción del ADN bacteriano de muestras de carne de res obtenidas de vendedores y supermercados se llevó a cabo como se describió anteriormente. Las condiciones de la PCR fueron similares a las mencionadas previamente para cada microorganismo.

El Cuadro 1 presenta el porcentaje de muestras de carne positivo a patógenos por ciudad. La prueba de PCR demostró la presencia de ADN de L. monocytogenes, S. Typhimurium y Y. enterocolitica en carne de supermercados de los estados de Nuevo León, Tabasco y Ciudad de México. El porcentaje total de ocurrencia de estos patógenos en las muestras de carne fue 27.78 % para L. monocytogenes, 8.89 % para Salmonella y 28.89 % para Y. enterocolitica.

En Monterrey, ninguna de las muestras importadas resultó positiva para alguno de los patógenos; sin embargo, 26.7, 3.3 y 6.7 % de las muestras de carne mexicana resultó positiva p ara Listeria, Salmonella y Yersinia, respectivamente. En aquellas muestras obtenidas en la Ciudad de México, la presencia de Listeria fue mayor en muestras importadas (n=8; 17.5 %) que en aquellas de origen mexicano (n=4; 10 %). Por otro lado, en la Ciudad de México, no se detectó Salmonella en muestras importadas, mientras que 2.5 % de las muestras mexicanas resultaron positivas a este patógeno. Se detectó Yersinia en 12.5 % (n=5) de las muestras importadas y en 27.5 % (n=11) de las muestras de origen mexicano. La mayor presencia de Listeria se detectó en muestras mexicanas de Tabasco, con 25 % (n=5). En Tabasco, ninguna de las muestras importadas resultó positiva a Salmonella, pero 30 % de las muestras mexicanas fueron positivas a este patógeno. En contraste, de las muestras obtenidas en Tabasco, 30 % de las importadas fueron positivas a Yersinia, mientras que únicamente 10 % de las mexicanas resultaron positivas.

En el caso de L. monocytogenes, el porcentaje total de detección fue similar al encontrado por Manzano et al⁽¹⁴⁾ en muestras comerciales italianas, en donde los autores detectaron al patógeno en 25 % de la carne molida⁽¹⁴⁾. Sin embargo, Pen g y Shelef⁽¹⁸⁾ sol am en te encontraron 15 % de la carne molida, procedente de supermercados de Estados Unidos de América, contaminada con este microorganismo. En el presente estudio, se encontró un porcentaje menor de L. monocytogenes que el 35 % informado por González et aX¹⁹⁾ en cortes New York vendidos en Nuevo León, México. Fratámico⁽²⁰⁾ y Peng⁽¹⁸⁾ detectaron la presencia de 6.5 y 10.0 % de Salmonella, respectivamente, en carne molida vendida en supermercados de Estados Unidos de América, encontrando en total 8.89 % de muestras positivas a este patógeno. Ríos et al⁽²¹⁾ informaron de 10.0 % de contaminación por Salmonella en cortes New York vendidos en el estado de Nuevo León, México, un poco más alta que el porcentaje de muestras positivas encontradas en este estudio en el mismo Estado.

La detección de Y. enterocolitica por medio de PCR en carne de res no ha sido comúnmente reportada en la mayoría de los estudios, porque generalmente se había enfocado a productos de cerdo⁽²²⁾. Sin embargo, Vishnubhatla et al⁽²³⁾ encontraron este agente patógeno en 31 % de las muestras de carne molida. En Finlandia⁽²⁴⁾ detectaron 25 % de contaminación con Y. enterocolitica en carne molida. En el presente estudio se obtuvieron resultados similares a los publicados por Fredriksson et al⁽²⁴⁾, al sumar un total de 28.89 % de muestras positivas a Y. enterocolitca. En Tabasco, se encontró el porcentaje más alto de los tres patógenos al ser comparados con otras ciudades. L. monocytogenes se encontró más frecuentemente en el norte, comparado con las otras dos enterobacterias. La Ciudad de México mostró tener el porcentaje más bajo de muestras positivas a Salmonella, pero el porcentaje más alto para Y. enterocolitica.

Como se puede observar en estos resultados, la carne importada fue la menos contaminada en comparación con la de origen mexicano, indicando que el uso obligatorio de HACCP, como requisito de United States Department of Agriculture-Food Safety and Inspection Service (USDA-FSIS), es efectivo para la disminución de la contaminación por patógenos en la canal bovina^(25,26). En México, en contraste con Estados Unidos de América, el uso de programas pre-requeridos e implementación del sistema HACCP para reducir cargas patógenas en la canal bovina, no es obligatorio y solamente es usado por algunos rastros como iniciativa propia. El porcentaje de contaminación por L. monocytogenes y Y. enterocolitica fue más alto que el de Salmonella, posiblemente debido a las condiciones bajo las cuales los patógenos mencionados sobreviven, crecen y se desarrollan ^(27,28). En el caso de L. monocytogenes, ésta penetra a la carne al ser manipulada o al entrar en contacto con maquinaria, herramienta o superficies de trabajo contaminadas^{(29,30,31,32)}. La detección de L. monocytogenes, Salmonella y Yersinia enterocolitica en bistecs vendidos en tiendas de menudeo y supermercados, indica el riesgo potencial para la salud de los consumidores. Estos resultados también señalan la necesidad de implementación obligatoria de programas preventivos como SSOPs y HACCP en la industria cárnica de México.

 

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se realizó gracias al financiamiento del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN206401) de la Universidad Nacional Autónoma de México.

 

LITERATURA CITADA

1. ANTAD. Asociación Nacional de Tiendas de Autoservicio y Departamentales [en línea]. http://~.antad.org.mx lCasociados.html. 2002. Consultado 15 Sep, 2008.         [ Links ]

2. Castaneda, PE, Diaz AE, Hernandez AL, Jaramillo ACJ. Identification and typing of Yersinia enterocolitica biotypes and serotypes isolated. Rev laude Publica 2001;(35):380- 384.         [ Links ]

3. Estrada GT, Lopez Sc, Zamarripa AB, Thompson MR, Gutierrez CL, Mancera MA, Escobar GA. Prevalence of Escherichia coli and Salmonella spp. in street-vended food of open markets (tianguis) and general hygienic and trading practices in Mexico City. Epidemiol Infect 2004;(132):1181-1184.         [ Links ]

4. Rivera BM, Shackelford lD, Arthur TM, Westmoreland KE, Bellinger G, Rossman M, Reagan JO, Koohmaraie M. Prevalence of Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, and Salmonella in two geographically distant commercial beef processing plants in the United States. J Food Prot 2004;(67):295-302.         [ Links ]

5. Li Y, Mustapha A. Development of a polymerase chain reaction assay to detect enteric bacteria in ground beef. Food Microbiol 2004;(21):369-375        [ Links ]

6. Malorny B, Tassios PT, Radstrom P, Cook N, Wagner M, Hoorfar J. Standardization of diagnostic PCR for the detection of foodborne pathogens. Int J Food Microbiol 2003;(83):39-48.         [ Links ]

7. Olsen JE. DNA-based methods for detection of food-borne bacterial pathogens. Food Res Int 2000;(33):257-266.         [ Links ]

8. Gasanov U, Hughes D, Hansbro PM. Methods for the isolation and identification of Listeria spp. and Listeria monocytogenes: a review. FEMS Microbiol Rev 2005;(29):851-875.         [ Links ]

9. Lantz PG, Knutsson R, Blixt Y, Al Soud WA, Borch E, Radstrom P. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in enrichment media and pork by a multiplex PCR: a study of sample preparation and PCR-inhibitory components. Int J Food Microbiol 1998;(45):93-105.         [ Links ]

10. NOM-114-SSA1-1994 Norma Oficial Mexicana Bienes y Servicios. Método para la determinación de Salmonella en alimentos. Mexico, SSA (Ed.). 1994.         [ Links ]

11. NOM-143-SSA1-1995. Norma Oficial Mexicana Bienes y Servicios. Método de prueba microbiológico para alimentos. Determinación de Listeria monocytogenes. Mexico, SSA (Ed.). 1995.         [ Links ]

12. Millar BC, Jiru X, Moore JE, Earle JA. A simple and sensitive method to extract bacterial, yeast and fungal DNA from blood culture material. J Microbiol Methods 2000;(42):139-147.         [ Links ]

13. Silhavy TJ, Berman, ML, Enquist LW. Experiments with gene fusions. NY, USA. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1984.         [ Links ]

14. Marisa M, Luca C, Pierino F, Carlo C, Giuseppe C. A simple and fast PCR protocol to detect Listeria monocytogenes from meat. J Sci Food Agr 1997;(74):25-30.         [ Links ]

15. Rahn K, De Grandis SA, Clarke RC, McEwen SA, Galan JE, Ginocchio C, Curtiss R, Gyles CL. Amplification of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella. Mol Cell Probes 1992;(6):271-279.         [ Links ]

16. Fenwick SG, Murray A. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by polymerase chain reaction. Lancet 1991;(337):496-497.         [ Links ]

17. Sambrook J. Molecular Cloning: A laboratory manual. 3rd ed., NY, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.         [ Links ]

18. Peng H, Shelef LA. Automated simultaneous detection of low levels of listeriae and salmonellae in foods. Int J Food Microbiol 2001;(63):225-233.         [ Links ]

19. Gonzalez K, Martinez VI, Mata TV, Espinosa MA, Alvarez OG, Morales LA. Detección molecular de Listeria monocytogenes en carne de res. Congreso Nacional de Microbiología. Rev Fac Salud Pub Nut. [en línea]. http://www.respyn.uanl.mx/especiales/ee-5-2004/cartel_deteccionJuany/02.htm.         [ Links ]

20. Fratamico P.M. Comparison of culture, polymerase chain reaction (PCR), TaqMan Salmonella, and Transia Card Salmonella assays for detection of Salmonella spp. in naturally-contaminated ground chicken, ground turkey, and ground beef. Mol Cell Probes 2003;(17):215-221.         [ Links ]

21. Ríos LJM, Martínez VI, Mata TVL, Espinoza MA, Alvarez OG, Morales LA. Uso de la prueba molecular de PCR para la detección de Salmonella spp. en carne de bovino. Congreso de Inocuidad Alimentaria. Rev Fac Salud Púb Nut. [en línea]. http://www.respyn.uanl.mx/especiales/ee-5-2004/cartel_deteccion_juany/01.htm.         [ Links ]

22. Thisted LS, Danielsson TML. Identification and characterization of pathogenic Yersinia enterocolitica isolates by PCR and pulsed-field gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol 2005;(71):3674-3681.         [ Links ]

23. Vishnubhatla A, Oberst RD, Fung DY, Wonglumsom W, Hays MP, Nagaraja TG. Evaluation of a 5'-nuclease (TaqMan) assay for the detection of virulent strains of Yersinia enterocolitica in raw meat and tofu samples. J Food Prot 2001;(64):355-360.         [ Links ]

24. Fredriksson AM, Hielm S, Korkeala H. High prevalence of yadA-positive Yersinia enterocolitica in pig tongues and minced meat at the retail level in Finland. J Food Prot 1999;(62):123-127.         [ Links ]

25. Bacon RT, Belk KE, Sofos JN, Clayton RP, Reagan, JO, Smith, GC. Microbial populations on animal hides and beef carcasses at different stages of slaughter in plants employing multiple-sequential interventions for decontamination. J Food Prot 2000;(63):1080-1086.         [ Links ]

26. United States Department of Agriculture, F.S.I.S. Pathogen reduction: hazard analysis and critical control point (HACCP) systems, final rule. Regist F. editor. 1996;(61):38805-38989.         [ Links ]

27. Chmielewski RAN, Frank JF. Biofilm formation and control in food processing facilities. Compr Rev Food Sci Food lafety 2003;(2):22-32.         [ Links ]

28. Farber JM, Peterkin PI. Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. Microbiol Rev 1991;(55):476-511.         [ Links ]

29. Allan JT, Yan Z, Kornacki JL. Surface material, temperature, and soil effects on the survival of selected foodborne pathogens in the presence of condensate. J Food Prot 2004;(67):2666-2670.         [ Links ]

30. Holah JT, Taylor JH, Dawson DJ, Hall KE. Biocide use in the food industry and the disinfectant resistance of persistent strains of Listeria monocytogenes and Escherichia coli. Symp Ser Soc Appl Microbiol 2002;111S-120S.         [ Links ]

31. Kerr KG, Birkenhead D, Seale K, Major J, Hawkey PM. Prevalence of Listeria spp on the hands of food workers. J Food Prot 1993;(56):525-527.         [ Links ]

32. Somers EB, Wong AC. Efficacy of two cleaning and sanitizing combinations on Listeria monocytogenes biofilms formed at low temperature on a variety of materials in the presence of ready-to-eat meat residue. J Food Prot 2004;(67):2218-2229.         [ Links ]

 

NOTA

Financial support by: PAPIIT IN206401.