Artículo

 

Identificación inicial de genes en Babesia bigemina mediante análisis de Etiquetas de Secuencia Expresadas en el estadio intraeritrocítico del parásito

 

Babesia bigemina: Initial gene identification by Expressed Sequence Tags (EST) analysis of the intraerythrocytic stage

 

José Javier Pérez de la Rosa^a-b, Patricia Vargas Ureostegui^a, J. Antonio Álvarez Martínez^a, Carmen Rojas Martínez^a, Victor Manuel González Zuñiga^c, Julio V. Figueroa Millán^a

 

^a Laboratorio de Babesia, Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria / INIFAP Km 11.5 Carretera Cuernavaca-Cuautla, Col. Progreso, Jiutepec, Morelos, C.P. 62550, MÉXICO. Tel +52 (777) 319-2850 ext 139. figueroa.julio@inifap.gob.mx. Correspondencia al último autor.

^b Dirección Actual: Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal / SENASICA, Km 11.5 Carretera Cuernavaca-Cuautla, Col. Progreso, Jiutepec, Morelos, C. P. 62550.

^c Centro de Ciencias Genómicas, UNAM Campus Morelos. Av. Universidad s/n, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos, C.P. 62210, México.

 

RESUMEN

En este estudio se realizó el análisis de Etiquetas de Secuencias Expresadas (EST) obtenidas a partir de 2208 clonas de Escherichia coli, con plásmidos recombinantes conteniendo insertos de cDNA de Babesia bigemina. Las secuencias se analizaron mediante búsqueda de homología en las bases de datos de genes. El análisis de homología en secuencia permitió identificar 470 clonas (agrupadas en 267 clusters) conteniendo EST con similitud de secuencia estadísticamente no significativa con algún gen de Babesia spp o de otro organismo Apicomplexa, sugiriendo la presencia de genes nuevos de B. bigemina; Se identificaron 21 clonas con EST correspondientes a 6 secuencias de genes previamente reportados para B. bigemina; además de 1285 clonas (conformando 159 clusters de genes distintos) de identidad significativa con proteínas hipotéticas o correspondientes a genes ya reportados en el genoma secuenciado de Babesia bovis; 32 clonas con EST homólogas a 16 genes distintos de Theileria spp; 51 clonas (26 genes distintos) con similitud en secuencia a genes de Plasmodium spp; 25 clonas con EST de moderada similitud con 13 genes distintos genes de Toxoplasma gondii; y 4 clonas con EST de mayor identidad con 4 genes diferentes de Cryptosporidium spp. Los resultados obtenidos permiten elaborar una base de datos sobre EST del estadio intraeritrocítico de Babesia bigemina, información básica esencial para la caracterización molecular del parásito, que permite llevar a cabo la identificación y regulación de nuevas regiones génicas codificadoras y, eventualmente el establecimiento de nuevas estrategias de control de la babesiosis bovina causada por B. bigemina.

Palabras clave: Babesia bigemina, Etiquetas de Secuencia Expresadas (EST).

 

ABSTRACT

In this study, Expressed Sequence Tags (EST) were obtained and analyzed from 2208 randomly selected clones containing plasmids with cDNA inserts derived from a Babesia bigemina library. The obtained sequences were extracted and subject to Blast homology search in the Genbank databases. Sequence homology analysis resulted in the identification of 470 clones (grouped in 267 distinct clusters) which contained EST with no significant sequence identity with Babesia sp genes or other Apicomplexan parasites. Presumably, these EST would correspond either to new, unreported B. bigemina transcribed genes present in the erythrocyte stages of the parasite, or to non-translated sequences of the putative genes. 21 clones were identified which contained EST corresponding to 6 genes coding for B. bigemina antigens already reported in the literature; 1285 clones (grouped in 159 clusters of distinct sequences) had significant sequence identity with genes coding for hypothetical proteins previously identified in the Babesia bovis genome. Moreover, 32 clones had EST corresponding to 16 different Theileria sp. genes; 51 clones (26 distinct sequences) showed EST with sequence similarity to genes of Plasmodium sp., 25 EST had low identity with 13 different Toxoplasma gondii genes; and 4 clones with EST for 4 different Cryptosporidium sp genes. The results obtained, in addition to EST analysis of a larger number of B. bigemina cDNA clones, will allow the characterization and, eventually, the manipulation of gene coding regions, essential for the establishment of improved control strategies for cattle babesiosis caused by B. bigemina.

Key words: Babesia bigemina, Expressed Sequence Tags (EST) analysis.

 

INTRODUCCIÓN

Babesia bigemina es un protozoario intraeritrocítico causante de la babesiosis bovina,  transmitida por garrapatas del género Boophilus⁽¹⁾  que afecta al ganado vacuno en regiones tropicales y subtropicales del mundo, con elevadas pérdidas económicas en la industria ganadera⁽²⁾. En México, los datos hasta 1980 mostraron que las pérdidas económicas por esta enfermedad ascendían a cerca de $ 3,000 millones de pesos⁽³⁾. Además, se ha referido que hasta un 75 % de los bovinos del hato nacional estimado en 32 millones de cabezas contabilizados en el 2009⁽⁴⁾, estaban en riesgo de contraer babesiosis por estar en zonas endémicas donde se localiza la garrapata vector. Con la finalidad de controlar la babesiosis bovina se han instrumentado diversas estrategias de control entre las que destacan: el empleo de fármacos, baños garrapaticidas, control biológico contra el vector, y el diseño de vacunas utilizando regiones inmunogénicas del parásito a fin de conferir resistencia a la enfermedad.

La capacidad de los animales para recuperarse de una infección por Babesia y la efectividad de las vacunas vivas contra desafíos con aislados homólogos y heterólogos, demuestran que se puede alcanzar una inmunidad protectora en los animales en riesgo⁽⁵⁾. Los mecanismos de la respuesta inmune están dirigidos en mayor parte, contra antígenos parasitarios presentes en los merozoitos y los eritrocitos infectados, y se han identificado algunos antígenos de estos estadios mediante el uso de anticuerpos monoclonales^(6,7). Sin embargo, varios estudios han demostrado que cuando son utilizados como inmunógeno (en forma nativa o recombinante), estos componentes sub-unitarios inducen sólo una respuesta protectora parcial contra el desarrollo de la enfermedad^(8,9,10). Esto es debido, en gran parte, al reducido número de antígenos de los parásitos reconocidos y caracterizados hasta ahora, los cuales pudieran no ser los inmunógenos más adecuados.

A pesar de la aparente simplicidad para la propagación in vitro de Babesia bigemina⁽ⁿ\ y que el sistema ha permitido obtener poblaciones de reducida virulencia o atenuadas⁽¹²⁾, hasta la fecha no se han realizado estudios de genética clásica o molecular en estas poblaciones del parásito. Esto se debe, en gran medida, a que existe un vacío de información en cuanto al número de secuencias génicas del parásito apropiadas para caracterización y manipulación. Una búsqueda reciente realizada en la base de datos del banco de genes "Genbank" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), demostró que éste contenía información de 185 secuencias de B. bigemina, de las cuales 87 correspondieron a los genes del RNA ribosomal de diversos aislados, así como secuencias de 10 genes que codifican por proteínas de B. bigemina, resaltando la presencia de 56 secuencias codificantes de las proteínas asociadas a las roptrias (denominadas RAP-1) de distintos aislados geográficos de B. bigemina⁽¹³⁾.

Uno de los abordajes más frecuentes en las bases de datos de secuencias de DNA, ha sido el relacionado con la secuenciación de moléculas de cDNA para generar EST⁽¹⁴⁾. Aun cuando las secuencias son incompletas, se argumenta que la generación de EST provee un método muy poderoso para el descubrimiento de nuevos genes, así como para la producción de sondas a utilizarse en estudios de mapeo. Los algoritmos actualmente disponibles y usados para comparar secuencias génicas y su correspondiente secuencia de aminoácidos, tales como Blast (búsqueda de alineamiento local básico, por sus siglas en inglés, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) han permitido la identificación de un número significativo de secuencias homólogas, al comparar EST con secuencias completas disponibles en las bases de datos genómicos. Tales comparaciones han sido usadas, por ejemplo, para identificar secuencias presentes en diversos Phyla y que representan regiones de una proteína con estructuras y funciones altamente conservadas. Una área de estudio donde la secuenciación de EST probablemente tenga su mayor impacto, es en el descubrimiento de genes de organismos filogénicamente distantes. Tal es la situación de muchos de los organismos parasitarios, los cuales, a pesar de su importancia médica veterinaria, se encuentran un tanto rezagados en cuanto a la aplicación de la genética para resolución de problemas biológicos importantes. Se ha demostrado la factibilidad del análisis de EST para el descubrimiento de genes en organismos Apicomplexa tales como Toxoplasma gondii, Plasmodium falciparum, Eimeria tenella, Sarcocystis neurona, Neospora caninum, y más recientemente Babesia bovis^(15-18). Utilizando el programa Blast para realizar la anotación de secuencias mediante una comparación con las bases de datos existentes, 21, 20 y 32 % de las EST generadas para B. bovis, T. gondii y P. falciparum, respectivamente, pudieron identificarse como secuencias homólogas con genes conocidos en el genoma de las tres especies de parásitos Apicomplexa⁽¹⁸⁾.

La generación y análisis de EST proporcionan una opción para la identificación de un gran número de genes expresados de un organismo en los diferentes estadios de su ciclo de vida. Las estrategias basadas en EST han sido de utilidad en parasitología para el descubrimiento de genes que codifican proteínas de importancia biológica en los parásitos, incluyendo B. bovis^(17,18,19), lo que ha permitido el descubrimiento de nuevas drogas que afecten los mecanismos del ciclo de vida. Asimismo, han facilitado la identificación de varios antígenos que son candidatos para utilizarse como vacunas con resultados significativos a partir de EST. Basado en lo anterior, el objetivo de este trabajo es iniciar la generación de una base de datos que permita la búsqueda y conocimiento de nuevos genes expresados en el estadio intra-eritrocítico de B. bigemina, que permita el establecimiento de nuevas estrategias de control en la babesiosis bovina, basadas en el conocimiento de secuencias génicas expresadas por el parásito.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Crecimiento e infección de células hospederas Eschericha coli XL1-Blue

A partir de una genoteca de cDNA de Babesia bigemina construida en el bacteriófago λ ZAP⁽²⁰⁾, y con el objeto de obtener los fagémidos (en su forma de plásmido pBluescript) recombinantes insertados en el fago vector, se realizó una escisión masiva de las clonas recombinantes utilizando el fago auxiliar Exassist (Stratagene) y siguiendo la metodología descrita previamente⁽²¹⁾. Se utilizó una alícuota de la genoteca de cDNA, con un título de 1x10⁴ unidades formadoras de placa, para realizar la infección de las células hospederas E. coli XL1-Blue en presencia de fago auxiliar, y propiciar la liberación del fagémido contenido dentro de cada fago λ ZAP recombinante. Posterior a una incubación por 15 min a 37 °C para permitir la adhesión de los fagos a las células hospederas, se adicionó medio de cultivo LB líquido conteniendo Isopropil-1-thio-β-D-galactopiranosido (IPTG) para inducir la expresión del gene de la β-galactosidasa, y la molécula reportera 5-bromo-4-chloro-3-indolil-β-D-galactopiranosido (X-gal) como substrato cromogénico. La mezcla se sembró en placas de LB con ampicilina e incubó a 37 °C durante la noche.

Selección de clonas y purificación de plásmidos para secuenciación

Las placas de LB agar conteniendo clonas con plásmidos recombinantes (colonias de color blanco) fueron colectadas con palillos estériles y depositadas en placas de 96 pozos elongados y conteniendo 1 ml de medio líquido LB e incubaron a 37 °C durante la noche con agitación y en presencia de ampicilina. Se purificaron los plásmidos recombinantes contenidos en cada una de las clonas cultivadas mediante un protocolo de lisis alcalina y utilizando un sistema comercial (SV Plasmid DNA Purification kit, Promega Co., Madison USA). El DNA plasmídico purificado fue cuantificado mediante técnicas espectrofotométricas de rutina⁽²²⁾.

Reacción de secuenciación

Los plásmidos obtenidos fueron utilizados como molde para el método de secuenciación en ciclo con terminación de didesoxinucleótidos fluoromarcados (Applied Biosystems, Foster City, CA USA), usando T7 como oligonucleótido iniciador. Posterior a la purificación de didesoxinucleótidos no incorporados se procedió a realizar la electroforesis capilar en un secuenciador automático (3130 XL Applied Biosystems Sequencing Analyzer).

Análisis de las secuencias

Las secuencias obtenidas fueron inicial e individualmente procesadas para evaluar su calidad mediante la aplicación Phred del software Sequencing Analysis versión 5.2 (Applied Biosystems), para posteriormente ser extraídas y analizadas mediante una búsqueda de homologías en secuencias con las bases de datos existentes en el National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) para identificación de contaminación con secuencias de vector (vecscreen); secuencias del genoma de bovino (Bos taurus); y para encontrar identidades o similitudes con secuencias nucleotídicas (megablast) y con secuencias de proteínas (blastx), utilizando la aplicación blast⁽²³⁾.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Con el propósito de obtener un número suficiente de clonas para analizar las secuencias de los insertos de cDNA de B. bigemina contenidos en los plásmidos pBluescript, se realizó una escisión masiva de fagos recombinantes contenidos en la genoteca de cDNA disponible, mediante el esquema de selección de colonias recombinantesIno recombinantes en células hospederas E. coli XL-1 Blue infectadas con el fago λ ZAP (portador de pBluescript), y sembradas en medio selectivo adicionado de IPTG y X-gal. El análisis de escrutinio reveló la presencia de una colonia blanca (recombinante) por cada 6 colonias azules (no recombinantes). El análisis por PCR con iniciadores T3 y T7 de 100 colonias recombinantes seleccionadas al azar, reveló la presencia de insertos de cDNA con tamaños dentro de un intervalo de 250 a >3000 pb, indicando la heterogeneidad en tamaño de los transcritos copiados a cDNA (no mostrado). Sin embargo, y para efectos de este estudio, sólo se utilizaron las lecturas de secuencia derivadas de un solo pase de secuenciación con T7 como iniciador, una característica que define a una EST⁽¹⁴⁾.

En total, se procesaron 2,208 clonas para secuenciación de sus plásmidos y generar la base de datos de EST. El análisis de homología en secuencias obtenidas mediante las aplicaciones Megablast y Blastx mostró un grupo de 320 clonas que fue descartado debido a que contenían secuencias correspondientes al fagémido vector (pBluescript), a la célula hospedera E. coli (cepa XL-1 Blue), o no proporcionaron suficiente cantidad de plásmido para obtener secuencias de calidad. Un segundo grupo comprendiendo 470 clonas (agrupadas en 267 clusters de genes distintos) contenían EST con tamaño promedio de 395 pb (intervalo de 57 a 1205 pb) con similitud de secuencia estadísticamente no significativa (e ≤ 1x10^-3) con algún gen de Babesia spp o de otro Apicomplexa (Theileria, Plasmodium, Toxoplasma, Cryptosporidium, etc.) y las cuales, presumiblemente, corresponderían a nuevos genes, aún no reportados, para B. bigemina. Un tercer grupo de 1,418 clonas (agrupadas en 224 clusters de genes distintos) contenían EST con tamaño promedio de 450 pb (intervalo de 95 a 1,239 pb) con similitud de secuencia estadísticamente significativa (e ≥ 1x10^-3) con genes de organismos Apicomplexa. Se destaca la identificación de 21 clonas que resultaron con EST correspondientes a 6 secuencias de genes previamente reportados para B. bigemina; un gran grupo de 1,285 clonas (conformando 159 clusters de genes distintos) tuvieron una mayor y significativa identidad con proteínas hipotéticas o correspondientes a genes ya reportados en el genoma secuenciado de Babesia bovis (24). Se identificaron, además, 32 clonas con EST correspondientes a 16 distintos genes de Theileria spp., 51 clonas (correspondientes a 26 genes distintos) con mayor similitud en secuencia a genes de Plasmodium spp.; un grupo de 25 clonas con EST de moderada identidad con 13 distintos genes de Toxoplasma gondii; y un grupo de 4 clonas con EST de mayor identidad con 4 genes diferentes de Cryptosporidium spp (Cuadro 1).

En el Anexo 1 se resumen los genes identificados en orden alfabético, derivados del análisis de homología de secuencias utilizando el algoritmo Blastx y en el que se incluye información relacionada con: EST representativa de secuencia en el cluster o secuencia única; longitud de la EST; valor del resultado "S" (del inglés, Score) de alineamiento; valor esperado "E" (del inglés, Expected), que representa la significancia estadística del alineamiento; Porcentaje de identidad de secuencia; Identificación (anotación) del gene homólogo; y número de acceso para dicho gen en el banco de genes. La última columna indica el número de clonas cuya EST es idéntica o muy similar entre ellas, y que permite identificar un clúster de secuencias únicas o "hermanas" del gen identificado por homología. La herramienta Blast encuentra regiones de similitud local entre secuencias; de esta manera se comparan secuencias nucleotídicas o de proteínas y se calcula la significancia estadística de las similitudes o identidades de secuencia, lo cual puede ser utilizado para inferir relaciones funcionales y evolutivas entre secuencias, así como para ayudar a identificar los miembros de familias de genes.

En general, entre más elevado sea el valor "S", el alineamiento de secuencias es de mejor calidad, y entre más bajo sea el valor esperado "E", la identidad de secuencia es más significativa, reflejando una probabilidad estadística elevada de que la EST analizada sea la correspondiente a un gen homólogo presente en otra especie u organismo. Vale la pena destacar que se presenta únicamente la información relativa a la mayor identidad en secuencia identificada para cada cluster o gen único. No obstante, cada cluster o gen único analizado presenta homología, aun cuando presente menor significancia, con secuencias génicas correspondientes a los organismos Cryptosporidium spp., Plasmodium spp., Theileria spp., y Toxoplasma spp., confirmando la conservación de secuencias entre genes homólogos (propiamente denominados como ortólogos) de los organismos pertenecientes al Phylum Apicomplexa.

Se destaca que de los 224 clústeres o grupos de EST que pudieron ser identificadas mediante el análisis Blast como genes ortólogos presentes en el estadio intraeritrocítico de Babesia bigemina, 105 de ellas representan secuencias correspondientes a genes hipotéticos, es decir secuencias que contienen un marco abierto de lectura y por lo tanto se les asigna un locus con su correspondiente número de acceso en el banco de genes, pero que no se ha comprobado, experimental ni funcionalmente, que efectivamente sean regiones de genes que codifican para una supuesta proteína.

De éstas, la mayoría (67 secuencias) corresponden a genes hipotéticos identificados en Babesia bovis, mientras que las 38 EST restantes corresponden a genes hipotéticos de Plasmodium spp (18 EST), Toxoplasma gondii (10 EST), Theileria spp (8 EST) y Cryptosporidium spp (2 EST), especies pertenecientes al Phylum Apicomplexa, y por lo tanto se permite apreciar la conservación de genes entre organismos similares. Por otro lado, y a diferencia con un proyecto de secuenciación del genoma de un organismo, una colección de EST obtenida por secuenciación de forma aleatoria provee información funcional importante con respecto al nivel de expresión de un gen en particular⁽¹⁸⁾, ya que se ha demostrado que el número de EST presentes en un clúster corresponde proporcionalmente a los niveles de transcripción para un gen en particular, tales como los obtenidos mediante técnicas de hibridación de ácidos nucléicos en formato de micro-arreglos. Así, se resalta la elevada representatividad (redundancia) de EST cuyas secuencias en B. bigemina tienen mayor identidad con genes que codifican para proteínas identificadas en el genoma de B. bovis⁽²⁴⁾, como BBOV__III002570 (hipotética); BBOV_III004000 (hipotética); BBOV_IV003330 (subunidad 2 del factor 3 de inicio de la traducción); BBOV_I004210 (proteína de cuerpo esférico-3); BBOV_II002630 (hipotética); BBOV_I002450 (hipotética); BBOV_IV006360 (proteína asociada a senectud); BBOV_III000550 (proteína ribosomal L15 de la unidad 60S); BBOV_III010780 (hipotética); BBOV_ III010250 (factor 4A de inicio de la traducción); BBOV_ IV003220 (hidrolasa de la superfamilia HAD); BBOV_III006650 (hipotética); BBOV_II005360 (hipotética); BBOV_III006700 (hipotética); BBOV_IV007250 (tubulina, cadena gamma); conformando grupos de 113, 95, 88, 77, 67, 55, 41, 34, 33, 29, 22, 22, 21, 20 y 20 EST redundantes por clúster, respectivamente.

El cluster de mayor abundancia encontrado (113 EST, 6% del total de EST analizadas) e identificado como grupo con secuencias predichas homólogas a la proteína hipotética BBOV_III002570, fue resultado de la mayor similitud arrojada por el análisis BLASTX. Sin embargo, estas mismas EST tuvieron un segundo encuentro de elevada significancia estadística [S = 111, E=1x10^-5, identidad = 24I56 (42 %), y similitud=35I56 (62 %)], con el antígeno de Babesia bigemina denominado Bbg 1.1 y para el cual, también se identificaron más específicamente 12 EST con elevada identidad al antígeno denominado Bbg 1.1 (y con menor similitud a Bbg 1.2) de B. bigemina.

Los antígenos Bbg1.1 y Bbg1.2 aparentemente se encuentran en cantidades mucho más elevadas en el estadio intraeritrocítico de B. bigemina, como pudo evidenciarse por análisis de homología de secuencias, encontrándose hasta 125 EST (considerando las 113 EST identificadas como BBOV_ I0002470). Sin embargo, esto se tendrá que demostrar de forma experimental en estudios posteriores. El antígeno de B. bigemina Bbg 1.1 (una proteína de ~34 KDa) ha sido clonado y caracterizado en trabajos previos⁽²⁵⁾, partiendo del tamizado de una genoteca de cDNA con antisuero policlonal de bovino preparado contra antígenos de Babesia bigemina separados por cromatografía. La secuenciación de DNA de dos clonas representativas permitió la identificación de marcos abiertos de lecturas, codificando polipéptidos que describen la región carboxi-terminal de dos diferentes antígenos, Bbg 1.1 y Bbg 1.2. Ambos polipéptidos contienen un motivo central en tándem de repetidos flanqueados por una región carboxi-terminal altamente conservada, pero las secuencias rio arriba de los repetidos no tienen elevada homología. Ensayos de hibridación y análisis mediante enzimas de restricción de clones de cDNA indicaron que estas proteínas antigénicas pertenecen a una familia de por lo menos nueve genes relacionados, pero no idénticos, conformando una familia de antígenos que son parte de la superficie del merozoito y que participan en la respuesta inmunológica, además de intervenir en la evasión de la respuesta inmune. Por ello, es probable que las EST expresadas en elevados niveles e identificadas en este estudio correspondan a por lo menos dos de los genes descritos para la familia de antígenos presentes en la superficie del merozoito. Por lo tanto, derivado de su naturaleza altamente antigénica y dada su abundante expresión en el estadio intraeritrocítico de B. bigemina, el antígeno Bbg 1.1 (y eventualmente la familia correspondiente) resulta candidato ideal para caracterizar molecular e inmunológicamente en términos de su conservación, a nivel secuencia de nucleótidos y epítopes predictivos, en diferentes aislados de B. bigemina de distinto origen geográfico en México y ser considerado como candidato a evaluarse en estudios de inmunoprotección.

El segundo cluster expresado más abundantemente e identificado en este trabajo como BBOV_III004000 (95 EST, 5 % del total de EST analizadas), presenta también encuentros de elevada identidad de secuencia [S=724, E=1x5^-76, Identidad=133I213 (62 %), Similitud = 165I213 (77 %)], con una proteína altamente conservada en Theileria parva (XP 763039.1) y otros parásitos Apicomplexa (Theileria annulata, Cryptosporidium parvum, Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii, etc). La proteína de 281 aminoácidos ha sido anotada como una metil-transferasa dependiente de S-adenosil-metionina (AdoMet-MTasa), una clase de enzimas clasificadas con base en la especificidad de su substrato (pequeñas moléculas, lípidos ácidos nucleicos, etc.) que transfiere grupos metilo de un compuesto a otro e involucrada en un gran número de procesos celulares (biosíntesis, transducción de señales, reparación de proteínas, regulación de la cromatina y silenciamiento de genes).

El tercer cluster más abundante (88 EST, 4.6 % del total de EST analizadas), es el representado por la proteína anotada como subunidad 2 del factor 3 de inicio de la traducción (TIF3s2), una proteína de 340 aminoácidos de longitud [BBOV_IV003330: S = 428, E=1x7^-41, Identidad=79I90 (87 %)]. De forma similar a la anterior, la proteína se encuentra altamente conservada en parásitos Apicomplexa e involucrada en la biosíntesis de proteínas a partir de moléculas de mRNA. Estas subunidades son necesarias en la fase de inicio de la traducción, al promover la unión del complejo ternario del factor de iniciación 2 a la subunidad 40S ribosomal. La proteína TIF3s2 presenta además una región que contiene un dominio WD40. Dicho dominio se encuentra en un gran número de proteínas que realizan una amplia variedad de funciones que incluyen la transducción de señales, procesamiento de pre-RNA y el ensamblaje del citoesqueleto.

El cuarto cluster más abundante (77 EST, 4.0 % del total de EST analizadas) es el identificado como homólogo en B. bigemina de la proteína de cuerpo esférico 3 de B. bovis [BBOV_ I004210: S=700, E=1x7^-71, Identidad = 128I291 (43 %)]. A diferencia de los dos clusters anteriores, pero similar al primer cluster, ésta parece ser una proteína específica en especies de Babesia, ya que el análisis Blast no arrojó encuentro de significancia estadística con secuencias de otro organismo Apicomplexa. Denominadas como SBP en B. bovis, se expresan en los cuerpos esféricos de los merozoitos, organelos localizados en la región apical de los parásitos intra-eritrocíticos. Se ha reportado que las SBPs participan en la unión del merozoito durante la invasión al eritrocito, y causa modificación de la membrana del eritrocito infectado. Se han descrito tres moléculas cuya localización celular radica en los cuerpos esféricos: SBP-1 con un peso molecular relativo de 87 KDa, aparentemente implicada en el proceso de infección al eritrocito al actuar sobre la vacuola parasitófora (26); SBP-2 y SBP-3, de 225 KDa y 135 KDa, respectivamente, que están implicadas en el proceso de invasión al insertarse sobre la membrana de los glóbulos rojos^(27,28). Estas proteínas están codificadas cada una por un gen unicopia, y son altamente conservadas entre cepas o aislados de B. bovis. La función y capacidad protectora de estas proteínas como antígeno vacunal aún no se ha determinado. Las EST identificadas en este estudio mostraron un porcentaje de identidad de ≥66 % con la Proteína de Cuerpo Esférico 3 (SBP3) reportada para Babesia bovis. Esta proteína de 135 KDa tiene una región antigénica determinante o epítope conservado en cepas de Babesia bovis de Texas, México y Australia. La proteína probablemente se encuentra implicada en la supervivencia intracelular, crecimiento y desarrollo de Babesia bovis. El gen que codifica para la proteína SBP3 ha sido ya identificado y secuenciado mediante tamizado de una genoteca de cDNA de B. bovis con anticuerpos monoclonales⁽²⁷⁾. Dado que en este estudio se reporta por primera vez la abundante transcripción del gen ortólogo presente en B. bigemina, el antígeno codificado debería ser considerado para investigar y estudiar su funcionalidad antigénica, con la finalidad de evaluar los mecanismos de inmunidad desarrollados en el hospedero bovino, ya que aparentemente este tipo de antígenos están involucrados en el proceso de unión e invasión de los merozoitos a los eritrocitos del bovino, por lo que se consideran candidatos viables a ser estudiados más detalladamente en Babesia bigemina.

De los subsecuentes clusters con abundante representación de EST en B. bigemina (proteínas hipotéticas BBOV_II002630; BBOV_I002450; BBOV_III010780; BBOV_III006650; BBOV_II005360; BBOV_III006700; BBOV_III006200 y BBOV_IV000390) no se encontró similitud estadísticamente significativa con secuencias de otros parásitos Apicomplexa, a partir de la cual se pudiera inferir una función o estructura molecular. La búsqueda de analogía por dominio o con secuencias de otros organismos procariontes o eucariontes pudiera dar mayor luz sobre la posible estructuraIfunción del grupo de proteínas identificadas como hipotéticas.

Dentro del grupo de EST de B. bigemina presentes en moderada abundancia resaltan: BBOV_ IV006360 (41 EST), anotada como una supuesta proteína asociada a senectud, también conservada en Cryptosporidium parvum, Plasmodium yoelli y Toxoplasma gondii, pero aún no caracterizada funcionalmente; BBOV_III000550 con 34 EST (proteína ribosomal L15 de la unidad 60S); BBOV_III010250 de 29 EST (factor 4A de inicio de la traducción, proteína dependiente de ATP involucrada en el desdoblamiento de RNA necesario en una variedad de procesos celulares que incluyen la eliminación de intrones, biogénesis ribosomal y degradación de RNA); BBOV_IV003220 de 22 EST (una hidrolasa de la superfamilia HAD, participa en la desintoxicación de xenobióticos o productos generados por el metabolismo); BBOV_ IV007250 con 20 EST (tubulina, cadena gamma, proteína estructural fundamental en la conformación del citoesqueleto); BBOV_ IV011580 de 18 EST (Helicasa, con la capacidad de deshebrar los duplexes de ácidos nucléicos con una polaridad direccional y utilizando la energía libre de la hidrólisis de nucleótido trifosfatos para impulsar su trasladación lo largo del DNA, deshebrando la doble hélice durante el proceso); BBOV_II006040 de 16 EST, una proteína nucleolar denominada NOP5, implicada en biogénesis ribosomal (traducción y estructura ribosomal); XP 001612931.1 de 15 EST, una proteína precursora de la sintetasa III de Plasmodium vivax (enzima que inicia la elongación de ácidos grasos); BBOV_II005900 de 14 EST, factor MCM2, una nucleósido trifosfato hidrolasa involucrada en una variedad de procesos incluyendo la replicación de DNA; BBOV_II001650 de 13 EST, proteína ribosomal S3 de la subunidad 40S (S3 forma parte de la región delantera de la subunidad ribosomal 40S e interactúa con el mRNA); BBOV_ IV003810 con 13 EST, una adenosina quinasa (asociada con la regulación de los niveles de adenosina extracellular y la preservación de los niveles intracelulares de adenilato. Participa además, en la fosforilación durante el metabolismo de las purinas en B. bovis en la vía alterna); gb|AF053002.1 de 13 EST, un gene correspondiente al apocitocromo b (que forman parte del complejo enzimático implicado en la cadena respiratoria mitocondrial); BBOV_ III011660 y BBOV_ II005480, proteínas hipotéticas de B. bovis; gb|AAA27790.1 con 12 EST, el antígeno Bbg 1.1 de B. bigemina; BBOV_III002090 de 12 EST, la proteína ribosomal S30 de la subunidad 40S; BBOV_III008720 de 12 EST, una proteína membranal de B. bovis; y BBOV_ III005740 de 12 EST, una proteína que contiene un dominio de enzima quinasa.

Otras EST identificadas con relevancia antigénica en B. bigemina

Se identificó una EST cuya secuencia mostró una elevada homología con el denominado Antígeno 1 de la Membrana Apical (AMA-1). Originalmente reportado como antígeno encontrado en la fase asexual del estadio intraeritrocítico de Plasmodium falciparum, AMA-1 es una proteína de micronema que se secreta a la superficie del merozoito de Plasmodium spp y taquizoito de Toxoplasma gondii. Más tarde, fue identificado el gen ortólogo en un aislado israelita de B. bovis⁽²⁹⁾, posteriormente se identificó y anotó la presencia del antígeno AMA-1 en el genoma secuenciado del aislado Texas de B. bovis⁽²⁴⁾ y más tarde fue secuenciado el gen a partir de cinco aislados de B. bovis con diferente origen geográfico en Brasil⁽³⁰⁾, demostrando su elevada conservación. Más recientemente, la secuencia correspondiente al gen AMA-1 de B. bigemina (Aislados argentino e italianos) fueron agregadas en el banco de genes^(31,32). Experimentos de inmunofluorescencia con anticuerpos anti péptidos de AMA-1 demostraron que el antígeno fue localizado en la mitad apical del merozoito de B. bovis. Sin embargo, experimentos de inmunoelectrotransferencia y marcado metabólico del parásito mostraron que el antígeno AMA-1 de B. bovis de 82 KDa se encuentra presente en muy pequeñas cantidades en el merozoito⁽²⁹⁾. Es probable que exista un bajo nivel de expresión de transcritos del ortólogo AMA-1 de B. bigemina, como se puede evidenciar por el escaso número de EST identificadas en este estudio. No obstante, el nivel de expresión de los transcritos no está directa y necesariamente relacionado con la cantidad de producto traducido. Por ejemplo, en genes que codifican para enzimas metabólicas los transcritos son ampliamente encontrados en los genomas, mientras que la concentración de enzima en un extracto proteico es baja, pero con una actividad enzimática elevada. Se desconoce si AMA-1 de Babesia spp pertenece a alguna familia particular de enzimas.

Se identificó una EST cuya identidad correspondió con el antígeno p200 de 200 KDa. Una proteína inmunodominante conservada en aislados de B. bigemina de diferente origen geográfico, África y México⁽³³⁾. Se propone que este antígeno participa en la elucidación de una respuesta inmune, y se especula que existe como una proteína estructural del citoesqueleto. Aparentemente, el transcrito de esta proteína se encuentra en bajos niveles en B. bigemina, dado que sólo se presentó una EST en el análisis realizado.

Se identificó una EST con elevada homología al antígeno de B. bigemina denominado Proteína Asociada a la Roptria-1 (RAP-1). Estudios previamente realizados reportan que RAP-1 induce una respuesta inmune protectora en bovinos⁽³⁴⁾. Sin embargo, se han identificado variantes de RAP-1, con polimorfismo de secuencia en las regiones amino-terminal y carboxi-terminal, lo que sugiere que la variación en las regiones con dimorfismo en secuencia de RAP-1 son inmunológicamente significativas, ya que anticuerpos dirigidos a epítopes presentes en una variante amino-terminal no reconocen el antígeno en una segunda variante; y células T CD4+ que reconocen epítopes en una variante carboxi-terminal no reaccionan en forma cruzada con una segunda variante carboxi-terminal. Un análisis del locus RAP-1 en el genoma de B. bigemina demostró que los genes rap-1 se encuentran distribuidos como repetidos en tándem, pero con diferente número de copias del gen y arreglos dependiendo de la cepa o aislado analizado. Eventos de conversión génica y desigual recombinación contribuyen a la generación de nuevas variantes rap-1⁽¹³⁾.

Una EST con homología para con un antígeno anónimo de B. bovis fue identificada. La molécula aparentemente es una proteína de membrana, descrita como homóloga a la proteína BBOV_III008720 encontrada en el genoma de B. bovis. En este estudio el análisis Blast mostró la presencia de 12 EST con una identidad de 42 % en secuencia aminoacídica. Se requiere de mayor experimentación con este antígeno para determinar su importancia biológica.

Se encontró una EST con homología a un nuevo antígeno encontrado en Babesia sp. WA1 (de origen humano en el estado de Washington, EE.UU.) y cuya función biológica se describe como desconocida hasta ahora. Sólo se establece que corresponde a una supuesta proteína de membrana tipo II, conteniendo un dominio del factor von Willebrand tipo A.

Importante destacar en este análisis, el hecho de identificar 4 clonas con EST de B. bigemina con similitud a los antígenos de la familia de antígenos variables de la superficie del eritrocito (VESA) de B. bovis, implicados en el mecanismo de escape inmune, y que garantiza su análisis experimental en posteriores estudios. Las EST identifican secuencias de genes ves que comprenden una gran familia en el genoma de B. bovis⁽²⁴⁾. VESA 1 es una proteína heterodimérica de 300 KDa compuesta de VESA 1 alfa y VESA 1 beta^{(35 36,37)}. Las proteínas son sintetizadas por el merozoito de B. bovis y exportada posteriormente a la superficie del eritrocito⁽³⁵⁾. VESA 1 sufre una rápida variación antigénica, la cual está implicada en la evasión de la respuesta inmune y cito-adhesión; ambos factores parecen jugar un papel vital en la persistencia del parásito y su patogénesis. VESA 1 muestra una homología funcional con la proteína PfEMP1, codificado por la familia de genes var en P. falciparum⁽³⁶⁾. De hecho, en este estudio se identificaron 3 EST adicionales que tuvieron encuentro, si bien no estadísticamente significativo, con proteínas tipo var presentes en la superficie del eritrocito infectado con P. falciparum. Se sabe que VESA-1 está implicada en el proceso de cito-adherencia de eritrocitos infectados con B. bovis, que ocasiona un secuestro de eritrocitos en los capilares del cerebro y como consecuencia un desarrollo de la enfermedad mucho más grave. Si bien en casos de infección por B. bigemina no se ha demostrado secuestro de eritrocitos durante el proceso de la enfermedad, se puede especular que la función de las proteínas ortólogas a VESA- 1 presentes en B. bigemina juegan un papel importante en la variación antigénica del parásito una vez que infectan al eritrocito. Alternativamente, antígenos similares a VESA-1 de B. bigemina pudieran participar en la agregación Iaglutinación de eritrocitos infectados, mediada por anticuerpos, proceso el cual se ha demostrado in vitro en ensayos con eritrocitos infectados con B. bigemina y suero de bovino inmune conteniendo anticuerpos que reconocen antígenos expuestos en la superficie del eritrocito infectado con B. bigemina⁽³⁸⁾. Si los antígenos identificados en la superficie de eritrocitos infectados con B. bigemina corresponden a los antígenos VESA de B. bovis, requiere todavía ser demostrado experimentalmente.

En general, la cantidad de EST obtenidas y analizadas en este estudio y clasificadas como de importancia fisiológica o inmunológica para el parásito y el desarrollo de la enfermedad es baja (491 genes únicos), ya que sólo representa el 14 % de los aproximadamente 3,500 genes presentes en el genoma de B. bovis, un parásito filogenéticamente similar⁽²⁴⁾. Esto puede ser resultado directo de la baja cantidad de fagémidos recombinantes obtenidos en la escisión de la genoteca en λZAP, existiendo la posibilidad de que un elevado porcentaje de los cDNAs contenidos en la genoteca se haya perdido durante el proceso de obtención de los plásmidos pBluescript, además de que la genoteca construida no fue normalizada exprofeso.

No obstante, las regiones génicas identificadas en Babesia bigemina durante el análisis de EST desarrollado en este trabajo podrá dar la pauta para realizar investigación conducente a la caracterización de las proteínas expresadas consideradas como importantes, funcionalmente, en la maquinaria molecular del parásito. Por ejemplo, las involucradas en el metabolismo o en los mecanismos de señalización que desarrolla el parásito al momento de invadir los glóbulos rojos, permitiría vislumbrar el desarrollo de ensayos de bloqueo de estas proteínas con nuevas drogas quimioterapéuticas (o drogas ya existentes, pero aún no probadas en B. bigemina). Sin embargo, será importante estudiar y caracterizar detalladamente las proteínas específicas de B. bigemina para determinar las diferencias estructurales existentes entre proteínas del parásito y la contraparte del hospedador bovino, con el objeto de no afectar las funciones fisiológicas del hospedero bovino.

Otro tipo de investigaciones implicaría el estudio de proteínas que se expresan en el parásito conteniendo regiones conservadas entre distintos aislados, y que tengan la capacidad de generar una respuesta inmune protectora por parte del bovino contra B. bigemina. Es probable que partiendo de estas regiones génicas conservadas se puedan construir proteínas hibridas (multiepitópicas, multivalentes) para generar un tipo de vacuna recombinante de nueva generación para coadyuvar en el control de este parásito.

 

CONCLUSIONES

La generación de bancos de datos con EST de un microorganismo es una herramienta poderosa para la identificación y selección de regiones candidatas que permiten establecer estrategias de control y regulación genética. Asimismo, permiten descubrir nuevos genes cuya importancia biológica para el parásito es tal, que eventualmente pueden servir como blancos para el desarrollo de nuevos y más efectivos agentes quimioterapéuticos, o para el desarrollo de vacunas de nueva generación. En este trabajo se identificaron 267 secuencias de B. bigemina que no mostraron similitud alguna con B. bovis ni con ningún otro parásito del Phylum Apicomplexa. Presumiblemente, estas secuencias corresponden a genes nuevos sin identificación de función asignada por similitud y aún no reportados para B. bigemina. Sin embargo, pudieran corresponder también, a secuencias de regiones no traducidas de genes que el análisis Blast no permite identificar, dado que este algoritmo realiza la búsqueda de identidad de secuencia en función de la traducción conceptual de la secuencia blanco, y la compara con la secuencia de aminoácidos depositadas en los bancos de datos.

Asimismo, es importante destacar que aun cuando el análisis fue realizado a relativamente baja escala, el hecho de identificar EST en B. bigemina con similitud a los antígenos de la familia VESA de B. bovis supuestamente implicados en el mecanismo de escape inmune, es una contribución que garantiza su análisis experimental en posteriores estudios. Otras secuencias identificadas que codifican para proteínas de importancia son las encontradas con una elevada homología con Proteínas de Cuerpo Esférico, denominadas como SBP en B. bovis, que se expresan en los cuerpos esféricos de los merozoitos, organelos localizados en la región apical de los parásitos intra-eritrocíticos. Dada su importancia en el proceso de invasión y la carencia de información con respecto a los homólogos correspondientes a B. bigemina, las identificadas en este estudio garantizan su inclusión en estudios de caracterización posterior.

De forma similar, los antígenos identificados como Bbg 1.1 y Bbg1.2 merecen ser revisitados en términos de su caracterización inmunobiológica molecular. Si estudios futuros muestran que se encuentran altamente conservados en aislados mexicanos de B. bigemina, resultaría particularmente interesante evaluar su potencial inmunogénico e inmunoprotector. Los resultados obtenidos en este trabajo, aunado al análisis de un mayor número de EST de B. bigemina, permitirán la caracterización y manipulación de regiones génicas codificadoras del estadio intra-eritrocítico, esenciales para el establecimiento de nuevas estrategias de control de la babesiosis bovina.

 

AGRADECIMIENTOS

Estudio financiado por el Fondo Sectorial SEP-CONACYT, a través del Proyecto No. 2004-C01-47739. Los autores agradecen a los revisores anónimos las observaciones y sugerencias proporcionadas para mejora del manuscrito.

 

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