Revisiones

 

Nuevos enfoques para el control de Rhipicephalus (Boophilus) microplus

 

Novel Approaches for control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus

 

Kevin B. Temeyer^a, Andrew C. Chen^a, Ronald B. Davey^b, Felix D. Guerrero^a, J.M. Howell^a, Diane M. Kammlah^a, Andrew Y. Li^a, Kimberley H. Lohmeyer^a, Pia U. Olafson^a, Adalberto A. Perez de Leon^a, Pamela L. Phillips^a, Joe M. Pound^a, and J.B. Welch^a

 

^a U.S. Livestock Insects Research Laboratory, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 2700 Fredericksburg Road, Kerrville, Texas 78028 U.S.A. Telephone: 1-830-792-0330. kevin.temeyer@ars.usda.gov. Correspondencia al primer autor.

^b Cattle Fever Tick Research Laboratory, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Moore Air Base, Bldg 6419, Edinburg, Texas U.S.A.78541.

 

RESUMEN

Esta revisión describe avances científicos enfocados al control de garrapatas de fiebre bovina (GFB), Rhipicephalus (Boophilus) microplus y R. (B.) annulatus. Evidencia epidemiológica indica que brotes de GFB en los EE.UU. han alcanzado niveles alarmantes debido al aumento de la población del venado cola blanca (VCB) y otras especies de ungulados salvajes que son hospedadores alternativos. Investigaciones avanzadas incluyen estudios sobre: inmunología en el VCB, genética molecular de GFB, resistencia a los acaricidas, e interacciones del sistema hospedador-parásito-garrapata. La utilidad del baño garrapaticida con organofosforados (OP) en los EE.UU. depende de la inhibición de la acetilcolinesterasa (AChE). Tres cADNs que codifican acetilcolinesterasas (AChE, EC 3.1.1.7) en R. (B.) microplus se expresaron en un sistema de baculovirus y mostraron valores de Km para acetiltiocolina de aproximadamente 5, 50, y 90 /tM para rBmAChEl, rBmAChE2, y rBmAChE3, respectivamente. Los rBmAChEs prefirieron acetiltiocolina sobre butiriltiocolina como substrato, y se inhibieron con eserina, paraoxón, y el inhibidor específico de AChE, BW284C51, asi confirmando su identidad bioquímica como AChE. La expresión de mutaciones específicas en cepas resistentes a OP disminuyerón la susceptibilidad de rBmAChEl y rBmAChE3 a inhibición con OP. Resultados por qRT-PCR indicaron que BmAChEs son expresados en singanglion. Múltiples transcripciones observadas en GFB para los BmAChEs sugiere el empalme alternativo o duplicación génetica. Resultados por qRT-PCR con ADN genómico respaldo la hipótesis de duplicación génetica. Moléculas largas de dsARN específicas para rBmAChEs fueron introducidas en hembras adultas ayunadas por microinyección y la silenciación de genes monitoreada por qRT-PCR y efectos fenotípicos. Los roles específicos para los rBmAChEs quedan por dilucidarse.

Palabras clave: Acetilcolinesterasa, Organofosforados, Resistencia acaricidas.

 

ABSTRACT

We review recent progress for control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus and R. (B.) annulatus. Outbreak infestations in the U.S. have reached alarming levels, due to increased populations of deer and other ungulates serving as alternative hosts. GIS mapping of infestations and deer habitat aids in utilizing methods and equipment designed for acaricide treatment of wild ungulates. Investigations include deer immunology, tick molecular genetics, acaricide resistance, and host-parasite interactions with deer or cattle, ticks, and pathogens. Acaricide resistance is widespread in Mexico and U.S. dipping vats depend on organophosphate (OP) inhibition of acetylcholinesterase (AChE). Three cDNAs putatively encoding acetylcholinesterases (AChE, E.C. 3.1.1.7) in R. (B.) microplus were expressed in the baculovirus system and exhibited K_m values for acetylthiocholine of approx. 5, 50, or 90 / M, for rBmAChE1, rBmAChE2, and rBmAChE3, respectively. The rBmAChEs exhibited substrate preference for acetylthiocholine over butyrylthiocholine, and inhibition by eserine, paraoxon, and the AChE-specific inhibitor, BW284C51, confirming biochemical identification as AChEs. Expression of specific mutations from OP-resistant strains exhibited decreased sensitivity of rBmAChE1 and rBmAChE3 to OP inhibition. Each of the BmAChEs was expressed in synganglion as indicated by qRT-PCR. Multiple transcripts from individual ticks for each of the BmAChEs suggested alternative splicing or gene duplication. Quantitative real time PCR with genomic DNA supported the gene duplication hypothesis. Long dsRNA specific for BmAChEl, BmAChE2, and BmAChE3 was introduced by microinjection of unfed adult females and subsequent gene silencing was monitored by qRT-PCR and phenotypic effects. Specific physiological roles for BmAChE1, BmAChE2, and BmAChE3 remain to be elucidated.

Key words: Acetylcholinesterase, Organophosphate, Acaricide resistance.

 

INTRODUCCION

Las garrapatas del ganado Rhipicephalus (Boophilus) microplus y R. (B.) annulatus, fueron introducidas al nuevo mundo con el ganado y  caballos a principios del siglo XVI. Estas  garrapatas se establecieron a lo largo del sur de Estados Unidos y California, pero recibieron poca atención hasta que el ganado transportado del estado de Texas los llevó hasta cruzar la línea de congelación en donde el ganado residente nunca había estado expuesto a las enfermedades transmitidas por garrapatas como la anaplasmosis y babesiasis. La mortalidad en el ganado residente en las áreas recién ocupadas por el ganado proveniente del estado de Texas, alcanzó cifras hasta de un 90 %, lo cual ocasionó un gran escándalo (y la violencia asociada) y la concomitante prohibición de cruzar muchas fronteras con otros estados del ganado proveniente del estado de Texas. En 1893 se descubrió que las garrapatas son responsables de la dispersión de la "Fiebre de Texas". Se diseñó una estrategia para erradicar a las garrapatas mediante un programa nacional de erradicación que fue iniciado en 1906. A finales de 1937, sólo 12,000 de las originales 700,000 millas cuadradas permanecían infestadas. El estado de Florida fue la excepción, ya que se encontró que el venado cola blanca también estaba infestado por garrapatas. Colectar los venados silvestres y tratar las garrapatas no era factible; por esta razón los oficiales decidieron despoblar a los venados. Entre 1939 y 1941 un total de 20,000 venados fueron sacrificados y los Estados Unidos fueron declarados libres de las garrapatas de la fiebre de Texas⁽¹⁾. Desde 1961 no ha habido brotes de la fiebre de Texas en los Estados Unidos, excepto aquéllos en la zona de cuarentena y áreas adyacentes al sur de Texas.

Los Estados Unidos se protegen contra la reintroducción de garrapatas Boophilus por el Programa de Erradicación de la Garrapata de la Fiebre del Ganado (CFTEP), el cual consiste en la inspección, tratamiento y cuarentena de animales y ranchos infestados que son supervisados por la Rama de Servicios Veterinarios de los Servicios de Inspección en Salud Animal y Vegetal del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA-APHIS, VS), el cual mantiene una zona de cuarentena permanente a lo largo de la frontera con México. Esta zona cuarentenaria permanente varía en amplitud que va de 200 yardas a las 35 millas en diferentes puntos a lo largo de la frontera. Cada año se importan de México -en donde R. (B) microplus y R. (B.) annulatus son endémicas-, aproximadamente un millón de cabezas por los Estados Unidos. Los animales presentados para importación deben ser tratados con acaricida, y sometidos a un baño de inmersión conteniendo coumafos al 0.3% (ingrediente activo) e inspeccionados manualmente para verificar la presencia/ausencia de garrapatas. Si una sola garrapata es encontrada, se rechaza el hato entero. Después de un periodo obligado de espera de 10 días, los animales pueden ser presentados nuevamente para poder ser importados, pero si durante la segunda inspección se encuentran garrapatas nuevamente, se cancela la entrada a los ganaderos reincidentes de manera permanente. Los brotes de garrapatas de la fiebre del ganado en los Estados Unidos es causa de cuarentena obligada de los ranchos infestados con tratamiento e inspección del ganado hasta erradicar a las garrapatas. Los centros de investigación: Knipling-Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory (Kerrville, TX) y el Cattle Fever Tick Research Laboratory (CFTRL) (Edinburg, TX), proporcionan el apoyo en las actividades de investigación para el Programa de Erradicación de la Garrapata de la Fiebre del Ganado.

Hay un creciente cuerpo de evidencias que indican la relación entre las garrapatas de la fiebre del ganado y diferentes ungulados silvestres localizados en el estado de Texas. La primera evidencia de esta relación ocurrió a finales de los años treinta y a principios de los cuarenta del siglo pasado en el estado de Florid, cuando se encontraron venados cola blanca infestando venados cola blanca, lo cual condujo al sacrificio de 20,000 animales⁽¹⁾. Desde finales de los sesenta los reportes de venados infestados con garrapatas se han venido incrementando a lo largo de la zona cuarentenaria permanente, paralelamente con el incremento excesivo de la población de venados en el sur de Texas durante los pasados 40 años. La población de venados en Texas fue estimada recientemente en 3.8 millones de animales⁽²⁾. Adicionalmente ha habido un incremento enorme en el número de especies de ungulados exóticos que están siendo introducidos cerca de la zona cuarentenaria permanente. El antílope Nilgai, que es nativo de la India es un primer ejemplo. Se estima que hay 30,000 de estos animales habitando el sur de Texas y el norte de México, en donde se han encontrado ocasionalmente infestados por garrapatas. El elk americano que habita la zona cuarentenaria fue encontrado infestado con garrapatas a principios de los años noventa y de nuevo en el año 2003. El gamo y el venado Rojo que habita en la zona cuarentenaria se ha encontrado infestado en el 2007, y los venados axis se encontraron infestados en el 2008.

Estudios llevados a cabo en el CFTRL demostraron que el venado es capaz de servir como hospedador alternativo de la garrapata R. (B.) microplus, aunque produce 12.5 veces menos garrapatas por animal que el ganado bovino. Las garrapatas colectadas de venados pesan también significativamente menos que las colectadas de ganado bovino y producen significativamente menos huevos con una tasa menor de eclosión que las garrapatas del ganado; con base en las observaciones diarias durante las infestaciones en venados y bovinos se muestra que los venados son muy agresivos para removerse las garrapatas que pueden alcanzar aun antes de que estas logren la repleción total. Los estudios concluyeron que aunque los venados no producen los números tan altos de garrapatas producidos por los bovinos, estos poseen una capacidad de dispersar un número de garrapatas suficiente para producir un gran brote en áreas en donde no había garrapatas previamente establecidas, y que también puedan mantener infestados de garrapatas los potreros en descanso de ganado^(3,4).

Retos de los programas de erradicación

Actualmente, el CFTEP está muy cerca de una situación de crisis. Ha habido un número record de ranchos infestados reportados en 2009, lo que amplía aun más la preocupante tendencia de los años recientes. Desde Julio del 2008, 894,219 acres (3619 Km²) en el sur de Texas han sido cuarentenados temporalmente debido a las infestaciones por garrapatas fuera de la zona de cuarentena permanente. En 1973, hubo 170 ranchos infestados por garrapatas detectados en Texas. Entre el primero de octubre del 2007 al 30 de septiembre del 2008, hubo 132 ranchos infestados⁽⁵⁾, y en el periodo del primero de octubre del 2008 al 31 de agosto de 2009 ha habido infestaciones identificadas en 144 ranchos en Texas, 60 de ellas dentro de la zona de cuarentena permanente (área sistemática) y 84 fuera de ella (área libre), el segundo número más alto de infestaciones desde que se completó el programa de erradicación durante 1943. Se cree que existen varios factores responsables de esta tendencia, incluyendo el incremento de las poblaciones de venados y ungulados capaces de servir como reservorios alternativos de Boophilus microplus⁽⁶⁾. El uso de Sistemas de Información Geográfica (GIS) para el mapeo espacio temporal de nuevas infestaciones es de gran ayuda para dilucidar el grado de infestación de los focos, la identificación de ranchos adyacentes que están sujetos a inspección y cuarentena, la planeación de los esfuerzos de control y subsecuentemente la evaluación de la efectividad en el control.

Se ha probado que el venado cola blanca y otros ungulados, parecen ser factores importantes en el mantenimiento de las poblaciones de garrapatas en ranchos infestados en los cuales el ganado ha sido evacuado como una opción aprobada de erradicación. El movimiento de venados y otros ungulados entre ranchos son más difíciles de limitar que el movimiento de ganado infestado que representa una amenaza a las propiedades vecinas. El desarrollo de la metodología de mapeo GIS para identificar el hábitat de los venados a través del análisis de imágenes satelitales está en curso. Se utilizó el sistema de imágenes satelitales para desarrollar los mapas de predicción de los hábitats del venado en el condado de Zapata, en Texas basado en la vegetación, para el monitoreo del clima, disponibilidad de agua y refugio. Estos mapas son superpuestos con mapas basados en avistamiento de venados y otros parámetros del hábitat para predecir los corredores de los venados. El conocimiento de los corredores de los venados nos va a permitir el rompimiento de las rutas de viaje mediante cercas o la colocación efectiva de instrumentos diseñados específicamente para el tratamiento de venados y otros ungulados. Por otro lado, el conocimiento del hábitat de los venados dentro de las zonas de pastizales puede ser utilizado para predecir la efectividad del descanso de la pradera como un medio para la erradicación de garrapatas en ranchos infestados. El muestreo de campo de garrapatas y la determinación de la preferencia de hábitats mediante el monitoreo, son componentes importantes necesarios para la validación del mapeo de imágenes satelitales, actualmente bajo evaluación en nuestro laboratorio.

Para reducir el impacto que la fauna silvestre de ungulados nativos y exóticos está teniendo en el CFTEP, los Servicios de Investigación para la Agricultura (ARS) del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, ha realizado un gran esfuerzo para desarrollar métodos para el tratamiento pasivo de estos animales con acaricidas, como un medio para reducir o eliminar las garrapatas. Una tecnología que ha sido desarrollada por el ARS para el control de garrapatas en venados cola blanca silvestres y otros ungulados exóticos, es una tecnología de control sistémica usando maíz impregnado con ivermectinas. Los estudios han demostrado que los venados cola blanca, consumen una libra de maíz medicado por cada 100 libras de peso, lo que resulta en una concentración de ivermectina de 30,000 ppm en el suero del venado. Estudios previos han mostrado que un nivel de por lo menos 10,000 ppm de ivermectina sérica es suficiente para matar el 100 % de las garrapatas que se alimentan sobre el animal⁽⁷⁾. El uso de esta tecnología ha eliminado exitosamente las infestaciones en un rancho de 6,500 acres con un hato de elk y en uno de 40,000 acres con venado cola blanca, en el cual el descanso del pastizal y los baños de inmersión no han tenido éxito para eliminar las infestaciones por garrapatas. Otras tecnologías desarrolladas incluyen el comedero y autoaplicador de acaricidas para los venados^(8-10).

Este instrumento redujo las poblaciones de garrapatas en venados en el noreste de los Estados Unidos en una amplia área de estudio con el fin de reducir la enfermedad de Lyme^(11-21). El concepto usado para el comedero a nivel del piso, de cuatro postes, fue modificado para producir uno elevado de dos postes, que fue diseñado por ser un instrumento ligero para la aplicación tópica en los comederos ya existentes para el suministro de proteínas y utilizados para alimentar venados cola blanca en el sur de Texas. Posteriormente, se han desarrollado nuevos rodillos aplicadores que requieren menos mantenimiento para mejorar la aplicación de pesticidas (Patente en trámite). En adición a estas innovaciones, se ha desarrollado e incorporado a estos instrumentos manipulado por un microprocesador capaz de identificar y colocar o remover los collares de venados individualmente⁽²²⁾.

Resistencia a los acaricidas

La resistencia a los acaricidas está ampliamente distribuida en México y el organofosforado coumafos, es el único acaricida autorizado para el uso en baños garrapaticidas en CFTEP. Brotes en los Estados Unidos provocados por cepas de garrapatas R. (B.) microplus resistentes a organofosforados (OP) o piretroides (Pyr), fueron descubiertos por primera vez en 2004^(23,24). Al 31 de agosto del 2009, han ocurrido otros siete brotes adicionales de cepas de garrapatas moderada o altamente resistentes a los piretroides, pero no se han reportado brotes de garrapatas resistentes a OP. Estudios de laboratorio utilizando la cepa "San Román" resistentes a OP fueron realizados para comprobar la capacidad de larvas ninfas y adultas para sobrevivir la inmersión en varias concentraciones de coumafos. Resultados de estos estudios indicaron que un solo baño de garrapatas resistentes a OP, con coumafos al 0.6% (de ingrediente activo) no produjo el nivel de control requerido por el CFTEP, necesitándose múltiples baños para alcanzar el nivel requerido de control^(25-27).

La insensibilidad de la acetilcolinesterasa (AChE, EC 3.1.1.7) se considera como uno de los principales mecanismos de resistencia a los OP, tanto en garrapatas como insectos^(28-31). Dentro de la última década, se han descrito tres diferentes cDNAs, BmAChE1, BmAChE2, y BmAChE3; como secuencias presuntamente codificantes de acetilcolinesterasas en R. (B.) microplus^(32-34). De éstas, con base en la expresión de la proteína recombinante y la verificación bioquímica, sólo se ha establecido la identidad de la BmAChE3 como una acetilcolinesterasa⁽³⁵⁾. Una mutación (R86Q) en BmAChE3 que provoca una disminución aproximada de 20 veces la sensibilidad a la inhibición por OP, se ha presentado con mayor frecuencia en cepas de laboratorio resistentes, pero no pareció ser suficiente por si sola para producir resistencia fenotípica en cepas de garrapatas del laboratorio.

Las diferencias en los valores de K_m indicaron un incremento en la actividad del sustrato (Acetiltiocolina, ASCh) en la mutante R86Q. Una disminución en la tasa de inhibición enzimática por Paraoxón en la cepa mutante, fue reflejada en la disminución de los valores k1 y k2. El tipo silvestre de la enzima fue fosforilada 19.2 veces más rápido que la cepa mutante R86Q. Cinco mutaciones adicionales en BmAChE parecieron correlacionar con el estatus de resistencia de las cepas de laboratorio, altas frecuencias genotípicas en cepas resistentes a organofosforados y bajas frecuencias en cepas susceptibles; sin embargo, la expresión en baculovirus de las construcciones, exhibieron poca actividad enzimática, por lo que no fue posible la caracterización de las propiedades bioquímicas⁽³⁶⁾. La búsqueda de mutaciones asociadas con la resistencia a OP y el desarrollo de ensayos para la genotipificación para cada una de las mutaciones en BmAChE3 reveló una asociación entre la substitución R86Q en BmAChE3 y el fenotipo insensible a los OP en cepas mexicanas de R.(B.) microplus de laboratorio y de campo^(36,37). Estudios similares de genotipificación revelaron una aparente asociación de las mutaciones P157S, Q488R, W571R, y W571F con la resistencia fenotípica (Temeyer, datos no publicados).

Se expresaron, construcciones recombinantes de BmAChE1 de cepas de laboratorio sensibles a OP (Deutch5) y resistentes a OP (Tux11), así como una construcción de rBmAChE2. La construcción rBmAChE3, SR-BC26, ha sido previamente caracterizada como resistente a OP⁽³⁵⁾. Las construcciones recombinantes de BmAChE1, BmAChE2, y BmAChE3, fueron fuertemente inhibidas por sulfato de eserin y por el inhibidor específico de acetilcolinesterasas BW284C51.

Como se muestra en el Cuadro 1, cada una de las rBmAChEs demostraron una fuerte preferencia por la acetiltiocolina (ASCh) comparada con la butiriltiocolina (BuSCh), según los valores de la tasa comparativa de hidrólisis del sustrato a una concentración 1 mM, y por comparación de los índices de V_max/K_m para los dos sustratos, consistentes con su identificación como acetilcolinesterasas (EC 3.1.1.7). El valor de la constante K_m para el construido rBmAChE1 de la cepa tux11 (resistente a OP) fue particularmente elevado para la butiriltiocolina (BuSCh), pero no para la acetiltiocolina (ASCh), indicando un incremento sustancial en la especificidad del sustrato comparado con el construido de la cepa Deutch5 (susceptible a OP). Los valores de V_max fueron significativamente más elevados para la AChE que para la BuSCh, lo cual refleja la preferencia por el sustrato. El construido de la cepa Tux11 fue significativamente más resistente a la inhibición que cualquiera de los construidos analizados. Con base en esto concluimos que las construcciones rBmAChE1, rBmAChE2 y rBmAChE1 rBmAChE3, son propiamente identificadas como acetilcolinesterasas con base en su preferencia por el sustrato, sensibilidad a los inhibidores de acetilcolinesterasas y propiedades bioquímicas generales.

La secuencia de aminoácidos de los construidos de rBmAChE fueron comparados con las secuencias enlistadas en el GenBank para identificar substituciones. Las frecuencias de las substituciones de aminoácidos presentes en Tux11, pero no en la cepa Deutch5 fueron determinadas por la secuenciación del cDNA de transcritos independientes de BmAChE de cepas susceptibles a organofosforados (OP), (OP-S) o resistentes (OP-R). Las substituciones D188G, E196G, V331A y F390S, estuvieron presentes con mayor frecuencia en la secuencia del gen BmAChEI de las cepas resistentes a OP, que en los transcritos de las cepas susceptibles, lo cual nuevamente sugiere una asociación con la resistencia a los OP (Temeyer, datos no publicados).

Se determinaron los fenotipos bioquímicos AChE-OP-R/S individuales de garrapatas adultas^(38,39), con el fin de encontrar una correlación entre las diferencias de los genotipos y sus fenotipos bioquímicos. El singanglión de garrapatas adultas fue dividido en dos, la mitad se utilizó para la determinación bioquímica de la actividad de AChE y la otra mitad fue conservada en RNALater para el análisis genético posterior. Se extrajo el RNA total de cada una de las muestras de singanglión preservadas en RANLater, y se utilizó para la construcción de su cDNA y posterior secuenciación. Fue una sorpresa la obtención de más de dos transcritos para cada una de las BmAChEs, lo cual sugiere rearreglos alternativos de los transcritos, o la presencia de más de dos alelos para cada uno de los genes de BmAChE. La secuenciación posterior del DNA genómico para BmACh1 encontró un intrón de 664 bp en la posición 16634 en sólo uno de los alelos, lo cual sugiere una duplicación del gen asociado con la pérdida/ganancia del intrón (Temeyer, datos no publicados).

Se utilizó el ensayo de PCR cuantitativo en tiempo real (QRT-PCR), para determinar la expresión relativa de los RNA mensajeros de BmAChEI, BmAChE2, y BmAChE3 en larvas individuales y en el singanglión de garrapatas adultas. El singanglión de garrapatas adultas fue seccionado y colocado en RNALater a 4 °C por 24 h y posteriormente congelado hasta su uso. Se extrajo RNA total a partir de larvas sin alimentar, congeladas o del singanglión de garrapatas adultas usando TriReagent (Sigma Chemical Co., St. Louis MO). La primera cadena de cDNA fue sintetizada usando Trasncriptasa Reversa SuperScript III, con un oligo (dT24V) iniciador. QRT-PCR se utilizó para evaluar la expresión relativa de los genes BmAChEI, BmAChE2, y BmAChE3 en larvas individuales o en el singanglión de hembras adultas aplicando un programa con las siguientes condiciones: 2 min at 95 °C para activar la DNA polimerasa, seguido de 40 ciclos de 20 s a 95° C, 1 min a 57 °C, y un min a 72 °C. La expresión relativa en larvas fue 1:1.6:1.9 comparado con 1.2:3.6:1 en el singanglión de garrapatas adultas para los genes BmA ChE1 :BmA ChE2:BmA ChE3, respectivamente, lo cual sugiere que la expresión es regulada de manera individual.

Se empleó la técnica de Interferencia de RNA (RNAi) para silenciar cada una de las BmAChEs, individualmente ó combinadas inyectando garrapatas hembras adultas sin alimentar. Se utilizó el gen de la β-actina de R. (B.) microplus como un gen interno de referencia para la normalización y como control positivo de silenciamiento. Se microinyectó RNA de doble cadena (dsRNA) de las regiones codificantes del gen de BmAChE, o de β-actina (100-400 ng dsRNA en 50-300 nL de solución salina amortiguadora de fosfatos, (PBS) en el hemocele en un grupo de 35 garrapatas hembras adultas sin alimentar. Para la microinyección se utilizaron agujas capilares montadas en jeringas Hamilton de 10 μl acopladas a un dispensador automatizado. Los grupos control incluyeron garrapatas no inyectadas e inyectadas solo con PBS. Se cruzaron machos sin inyectar con las hembras de los grupos experimentales y se colocaron en cámaras colocadas en los lomos de bovinos mantenidos en aislamiento. Las garrapatas fueron removidas y disectadas en diferentes tiempos posteriores a la inyección para monitorear los cambios en los niveles de expresión de los mRNA. Los tejidos disectados fueron almacenados en RNALater y congelados hasta su uso. Para determinar los efectos fenotípicos del silenciamiento de la AChE El tiempo de ingurgitamiento se determinaron los pesos de las hembras ingurgitadas y de la masa de huevos y la tasa de eclosión, y se utilizó el QRT-PCR para evaluar los niveles de expresión de los mRNA. Los resultados demostraron que el 93 a 96 % de silenciamiento del gen de los transcritos de la β-actina se llevó a cabo a las 48 h postinyección, con 70 % de mortalidad antes del desprendimiento; los sobrevivientes pesaron el 37 % del peso de los controles y no ovipositaron. La inyección del RNA de doble cadena de solo uno de los genes de BmAChE no produjo un silenciamiento medible de los transcritos de BmAChE del singanglión dentro de las 48 hrs y las hembras adultas ingurgitadas no mostraron ningún parámetro biométrico diferente del de los controles. En contraste, la inyección con dsRNA de los tres genes BmAChE's produjo el 50 % de mortalidad en las garrapatas antes del desprendimiento. Los resultados se interpretaron como la complementación funcional del silenciamiento de BmAChE's in vivo.

Los datos obtenidos sin importar las características bioquímicas de las tres BmAChE's, sugieren que cada una de las colinesterasas juegan de manera individual un papel vital e importante en la fisiología de la garrapat, y la presencia de las mutaciones, pueden ser importantes en más de uno de los genes en ausencia de resistencia metabólica (en condiciones naturales), para poder producir una resistencia fenotípica a los OP. La barrera del baño de inmersión en coumafos, para prevenir la reentrada de la garrapata del ganado a los Estados Unidos, fallará si los niveles de resistencia se incrementan. Es claro que las acetilcolinesterasas de R. (B.) microplus poseen múltiples rutas posibles para la generación de resistencia; sin embargo el papel fisiológico específico que juegan cada uno de estos genes, de manera individual, todavía es un misterio por resolver. Estos blancos vitales pueden presentar nuevas oportunidades para diseñar ensayos de interferencia prometedores.

Futuros prospectos para el control de la garrapata de la fiebre del ganado

Actualmente se investigan opciones de control alterno que incluyen: i) el desarrollo de vacunas contra garrapatas y Babesia sp. del ganado y de otras especies hospedadoras, II) nuevos acaricidas y excipientes y iii) la expansión de recursos de origen genómico disponibles para R. (B.) microplus.

R. (B.) microplus, una garrapata de un solo hospedador, debe sortear la presión de la respuesta inmune que resulta de alimentarse en todos los estadios sobre un solo hospedador. Un parasitismo exitoso requiere de un mecanismo de evasión que perdure entre 21 a 24 días. La naturaleza antihemostática, anti-inflamatoria e inmunosupresora de su saliva ha sido ampliamente documentada en varias especies de garrapatas ixodidas^(40,41), así como en el transcriptoma/sialoma de las glándulas salivales de I. scapularis, I. pacificus, A. variegatum y R. appendiculatus, que han llevado a encontrar un conjunto notable de moléculas producidas en el tejido y que ayudan en el proceso de alimentación de las garrapatas exitoso^(42-45).

Santos et al ⁽⁴⁶⁾ brevemente, publicaron transcritos expresados en las glándulas salivares de hembras adultas de rápida ingurgitación de R. (Boophilus) microplus. En nuestros esfuerzos por describir secuencias durante la alimentación temprana (1-2 días sobre el hospedador) o tardía (4-5 días sobre el hospedador) de la hembra adulta de R. (Boophilus) microplus, se secuenció una biblioteca de cDNA de tejido de glándula salival representativas de estos dos periodos en particular. Se encontraron siete transcritos de la biblioteca construida a partir de tejidos de glándulas del estadio de alimentación temprano, que mostraron una significante similitud con metaloproteasas descritas en las garrapatas I. scapularis⁽⁴⁷⁾, I. pacificus⁽⁴³⁾, I. ricinus y recientemente Haemophysalis longicornis. Se determinó la secuencia completa de estos cinco transcritos y se analizó el perfil de expresión en varios estadios de desarrollo de R. (B.) microplus. Además se están caracterizando a profundidad cuatro transcritos que muestran una significativa similitud en la secuencia con una proteína similar a la proteína Kunitz, implicada en la inhibición de la coagulación en el proceso de alimentación de las garrapatas^(48,49).

Hipótesis a probar será que el venado adquiere resistencia inmunológica a las garrapatas del ganado como resultado de las exposiciones repetidas. La generación de este conocimiento es esencial para evaluar la respuesta inmune protectora en venados, con el fin de seleccionar las vacunas y adyuvantes apropiados para experimentos futuros de vacunación. La segunda hipótesis, es que la hembra adulta de la garrapata adquiere a la Babesia bovis del venado cola blanca y lo transmite de manera transovárica a la progenie larval^(50,51), la cual es capaz de infectar a los hospedadores bovinos nunca antes expuestos. Se está en el proceso de identificar y caracterizar a nuevos inmunógenos blanco expresados por B. bovis. Se identificarán antígenos expresados en garrapatas y etapas parásitas del parásito en el hospedador mamífero, en los que se pueda predecir la capacidad de ser utilizados como blancos del sistema inmune de los bovinos. La respuesta inmune en contra de las formas recombinantes serán probadas en estudios de inmunización. Además, se ha diseñado un sistema de Adsorción en Línea Reversa (RLB) que será probado para determinar la presencia de DNA de Babesia sp. ⁽⁵³⁾ en garrapatas del ganado encontradas en brotes de infestaciones en México y en los Estados Unidos. Se probará la hipótesis de que el nivel de exposición del ganado a la Babesia se puede determinar usando este ensayo. Los datos obtenidos en la prevalencia de estos patógenos serán de gran ayuda para que el CFTEP, determine hacia donde pueden dirigirse los recursos para que sean más eficientes.

Las investigaciones dirigidas hacia la elucidación del genoma completo de R. (B.) microplus siguen vigentes. Actualmente se han secuenciado 650 millones de bp, lo que comprende aproximadamente 9 % del geno ma total estimado en 7.1 mil millones de pares de bases. Cromosomas artificiales bacterianos (BACs) están siendo secuenciados, y en este momento se han revelado grandes áreas de secuencias de DNA repetitivo (Guerrero, datos no publicados). Se han identificado aproximadamente 15,000 regiones codificantes de genes y se le han asignado una función putativa a 5,600 de ellos. Se han identificado proteínas específicas de las membranas celulares del intestino y ovario de las garrapatas, como candidatos potenciales de las vacunas y se han iniciado ensayos de interferencia de RNA.

Finalmente, hemos desarrollado ensayos para resistencia a los acaricidas^(54,55) y se están realizando estudios para desarrollar y probar nuevos acaricidas químicos y nuevos métodos para suministrarlos, incluyendo formulaciones con sinergistas y formulaciones de liberación lenta, incluyendo microesferas inyectables^(56-60).

 

AGRADECIMIENTOS

Financiado por USDA, Proyecto CRIS No. 6205- 32000-026-00D; Titulado: Biología Molecular de Boophilus microplus.

 

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