Artículos

 

Desarrollo de un inmuno–ensayo enzimático (ELISA) para el diagnóstico de paratuberculosis en bovinos

 

Development of an enzyme–linked immunosorbent assay (ELISA) for the diagnosis of bovine paratuberculosis

 

Adriana Guadalupe Martínez Covarrubiasª, Marco Antonio Santillán Flores^b, Claudia Celic Guzmán Ruiz^c, Lucía del Carmen Favila Humara^b, Dionicio Córdova López^b, Efrén Díaz Aparicio^b, Laura Hernández Andrade^b, Miguel Ángel Blanco Ochoaª

 

ª Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México.

^b CENID–Microbiología. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), carretera México Toluca km. 15.5, Colonia Palo alto. Delegación Cuajimalpa 05110. Tel. 55 36 18 08 00 ext. 49 santillan.marco@inifap.gob.mx, mayco1768@yahoo.com.mx. Correspondencia al segundo autor.

^c Campo experimental Bajío, INIFAP.

 

Recibido el 16 de diciembre de 2010.
Aceptado el 8 de abril de 2011.

 

Resumen

Los objetivos del trabajo fueron estandarizar y desarrollar un ELISA con antígeno protoplasmático obtenido de una cepa de Mycobacterium avium paratuberculosis (Map) 3065 de origen ovino, para el diagnóstico de paratuberculosis en bovinos. El antígeno se fijó en las placas a concentraciones de 10, 5, 2.5 y 1.25 μg/100 μl y se probaron diluciones de los sueros control positivo y negativo de 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160. El punto de corte se estableció con un intervalo de confianza del 95 % y dos desviaciones estándar. Para determinar la sensibilidad y especificidad del ELISA se trabajó con 491 sueros de bovinos, así como también, se colectaron muestras de heces para efectuar el aislamiento bacteriológico, y la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada para la detección de Map. Los resultados de las tres pruebas fueron analizadas para determinar la asociación o concordancia por medio de una prueba de Kappa La concentración de antígeno y suero que dieron mejor diferencia entre los controles fue de 1.25 μg/100 μl antígeno y la dilución del suero 1:160, el punto de corte se estableció a una densidad óptica de 0.196; la sensibilidad que se obtuvo fue 79.31 %, la especificidad 82.25 % y el índice de concordancia de 0.2763 del ELISA con respecto al cultivo. Los resultados obtenidos permiten recomendar el ELISA con antígeno protoplasmático de la cepa de Map 3065, como una alternativa para el diagnóstico de la paratuberculosis en bovinos.

Palabras clave: Paratuberculosis bovina, ELISA, Antígeno protoplasmático, Mycobacterium avium paratuberculosis.

 

Abstract

The objective of this study was to standardize and develop an ELISA with protoplasmatic antigen from a Mycobacterium avium paratuberculosis (Map) 3065 strain obtained from sheep, to be used for the diagnosis of bovine paratuberculosis. The antigen was set on plates at 10, 5, 2.5 and 1.25 μg/100 μl concentrations and 1:20, 1:40, 1:80 and 1:160 dilutions of positive and negative control sera were tested. The cutoff point was established with a confidence interval of 95% and two standard deviations. Four–hundred and ninety–one bovine sera were used to establish sensitivity and specificity of the ELISA; likewise feces samples were collected for bacteriological isolation and the nested polymerase chain reaction test (PCR) was applied for Map detection. Results of the three tests were analyzed by kappa test to determine association or concordance. Antigen and sera concentration that gave the best difference between controls was 1.25 μg/100 μl antigen and 1:160 serum dilution, cutoff point was established at an optic density of 0.196; obtained sensitivity was 79.31 %, while specificity was 82.25 % and concordance index of the ELISA was 0.2763 as compared to the culture. Results obtained by ELISA with protoplasmatic antigen of the Map 3065 strain make the recommendation of this assay appropriate as an alternative for the diagnosis of bovine paratuberculosis.

Key words: Bovine paratuberculosis, ELISA, Protoplasmatic antigen, Mycobacterium avium paratuberculosis.

 

INTRODUCCIÓN

La paratuberculosis (ptb) o enfermedad de Johne, es una enteritis granulomatosa de curso crónico que afecta a rumiantes domésticos (bovinos, ovinos, caprinos), así como también a antílopes, camellos, llamas y otras especies animales. Su distribución es mundial y su prevalencia varía de 5 a 25 %⁽¹⁾.

El agente causal es Mycobacterium avium paratuberculosis (Map). Es un bacilo ácido–alcohol resistente cuya característica la confiere su compleja pared celular, la cual es relativamente resistente al agua y rica en ácidos micólicos, peptidoglicano y arabinogalactano. El bacilo está clasificado dentro del complejo Mycobacterium avium–intracelullare (M. avium subsp. avium, M. avium paratuberculosis, M. avium silvaticum y M. intracelullare) y se diferencia de las otras subespecies del complejo por su dependencia a micobactina para su crecimiento in vitro, y la estimulación de su crecimiento con piruvato^(2,3,4).

Los animales clínicamente enfermos excretan en forma masiva al bacilo en el excremento, la concentración bacteriana en materia fecal puede sobrepasar valores de 10⁸ unidades formadoras de colonia (UFC)/g⁽⁵⁾, siendo ésta la principal fuente de infección para los animales; otra forma en la que los animales se llegan a infectar es durante la lactancia, por la eliminación directa del microorganismo a través de la leche y calostro, además de la contaminación de la ubre con heces^(2,6).

La infección por Map, usualmente ocurre en los primeros meses de vida de los animales, pero los signos clínicos se observarán después de un largo periodo de incubación y generalmente aparecen entre los dos y cinco años de edad. A este largo periodo de incubación se le atribuye el difícil control de la enfermedad, ya que los animales con infección subclínica comienzan a excretar la micobacteria en las heces antes de progresar al estado terminal de la enfermedad (6).

Los signos que se observan son diarrea (al principio intermitente, más tarde permanente), pérdida de la condición corporal aunque el apetito se mantiene, disminución de la producción láctea y edema submandibular y ventral causado por hipoproteinemia. Se estima que por cada caso clínico hay 25 casos subclínicos; de ahí la importancia de contar con pruebas de diagnóstico que puedan detectar a los animales infectados⁽⁷⁾.

No se puede afirmar en forma definitiva si Map puede ser considerado un agente zoonótico, ya que su participación en la etiología y patogénesis de la enfermedad de Crohn es un tema de intenso debate⁽⁸⁾.

El perfil inmunológico a la infección por Map consiste en una respuesta mediada por células durante la etapa subclínica y una respuesta de tipo humoral durante la etapa clínica de la enfermedad^(1,2,6,8). Las pruebas basadas en la detección de la respuesta inmune humoral no resultan factibles durante etapas tempranas de la infección (fase subclínica) porque no se producen anticuerpos contra Map⁽⁹⁾, pero en ani males clínicamente afectados su sensibilidad y especificidad son relativamente altas⁽¹⁰⁾.

El diagnóstico de la ptb por medio del ensayo inmuno–enzimático o ELISA (por sus siglas en inglés) se ha utilizado para la detección de ptb, principalmente en bovinos, ovinos y caprinos; generalmente el antígeno que se ha empleado para realizar el ensayo se obtiene de una cepa de Map, la cual ha sido evaluada como antígeno sonicado y filtrado cepa 19698 TTCC⁽⁸⁾, células completas inactivadas con formaldehído, antígenos de superficie, cepa Linda^(9,11), antígeno protoplasmático cepa 18^(3,12), y proteínas de secreción temprana cepa JTC 303⁽¹³⁾; la sensibilidad obtenida con los diferentes antígenos varia de 8.9 a 32.1 % en animales que eliminan bajas cantidades de bacilos en el excremento, y del 30 al 95 % animales que eliminan una mayor cantidad^(8,11,12). Actualmente existen paquetes comerciales para realizar el diagnóstico de ptb, pero se tiene el inconveniente que son de importación y su precio es elevado, razón por lo cual no se lleva a cabo el diagnóstico de forma rutinaria en los laboratorios de salud animal en México.

La ptb ocasiona importantes pérdidas económicas a la industria pecuaria, por lo que es indispensable el contar con pruebas diagnósticas para detectar a los animales infectados y poder establecer las medidas de control necesarias; el objetivo del trabajo fue desarrollar y estandarizar un ELISA para el diagnóstico de ptb en bovinos, empleando un antígeno protoplasmático de Map cepa 3065 de origen nacional.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Elaboración del antígeno

El antígeno protoplasmático se obtuvo de un aislamiento de Mycobacterium avium paratuberculosis cepa 3065, proveniente de excremento de un caso clínico de ovino. La cepa se inoculó en medio líquido de Proskawer y Beck adicionado con micobactina (2 mg/L) y se incubó a 37 °C por ocho semanas. Las bacterias se concentraron por centrifugación a 900 xg durante 10 min, se lavaron tres veces con solución amortiguadora de fosfatos pH 7.2, 1M (PBS), y fueron sonicadas (Ultra Soni Procesor) durante 20 ciclos de 59 seg cada uno; el material obtenido fue centrifugado a 900 xg durante 90 min y el sobrenadante se dializó a 4 °C en una membrana de celulosa (21 a 33 mm de diámetro promedio) (Sigma–Aldrich) durante 18 h, el dializado fue congelado a –170 °C durante 2 h, para posteriormente liofilizarlo. La concentración de proteína se determinó utilizando el paquete comercial Micro BCA Protein Assay Reagent Kit® y se comparó con la concentración de proteína del antígeno PPA–3 (Paratuberculosis Protoplasmic Antigen, Allied Monitor Inc®) de Map⁽¹⁴⁾.

Estandarización del ELISA

El antígeno se fijó en las microplacas de ELISA a concentraciones de 10, 5, 2.5 y 1.25 μg/100 μl, diluidos en solución amortiguadora de carbonatos pH 9.6, 0.06 M. Se colocaron 100 μl de antígeno por pozo, se mantuvieron en incubación a 37 °C, durante 24 h, se lavaron cuatro veces con 300 μl de solución de lavado PBS–tween 20 (PBST)(0.05%) pH 7.4 y por pozo se depositaron 100 μl de solución de bloqueo albúmina 1%, (Fluka Biochemika), las placas se incubaron a 37 °C durante 1h, se realizaron cuatro lavados con PBST, y se almacenaron a 4 °C envueltas en plástico y papel aluminio, hasta su uso. Se trabajó con un suero testigo positivo (Allied Monitor, Inc^®) y con un suero testigo negativo, diluidos en una solución al 0.02% de M. phlei en una solución amortiguadora de fosfatos con 0.1% de gelatina y 0.05% de tween 80 (Sigma), a concentraciones de 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160. Se utilizó un conjugado anti IgG bovino marcado con peroxidasa de rábano (HRP) (Sigma) a diluciones de 1:750, 1:1500 y 1:2000.

En cada placa se colocaron en sus pozos correspondientes 100 μl de los sueros testigo negativos o positivos; todos los sueros fueron probados de manera pareada, se incubaron a temperatura ambiente por 30 min, se lavaron con 300 μl de PBST cuatro veces, se agregaron 100 μl de conjugado anti IgG bovino–HRP en cada pozo, se incubó a temperatura ambiente por 30 min, se eliminó el contenido de la placa y se lavó con PBST cuatro veces; a cada pozo se agregaron 100 μl de solución de sustrato 2–2' azino–di–(3–etil–benzothiazol–sulfona–6)–(diamonio) (ABTS) (AMReSCO), se mantuvieron en obscuridad a temperatura ambiente y agitación por 30 min. La lectura se realizó a 650 nm en un espectrofotómetro de ocho canales (eLx800, BioTek)⁽¹⁵⁾.

Determinación del punto de corte, sensibilidad y especificidad

Se trabajó con 50 sueros de bovino positivos a aislamiento de Maptb y con 50 sueros negativos provenientes de hatos libres a ptb y tuberculosis. El punto de corte se estableció por Intervalos de Confianza al 95% y dos desviaciones estándar utilizando la siguiente fórmula (15):

M= x ± Z (0.5 – ^0.05/₂)(δ/√n), donde: n (población), M (media), δ (desviación estándar)

Con el software Stata 7.0® ⁽¹⁵⁾, se calcularon los valores de la prueba de Kappa, Sensibilidad (Se) y Especificidad (E).

Evaluación con muestras de campo

Se determinó la Se y e del ELISA evaluando 491 sueros de bovinos de la raza Holstein mayores a dos años de edad, procedentes de hatos lecheros de los estados de Hidalgo, México y Aguasealientes.

La determinación de los valores positivos vs negativos, se obtuvo con los valores promedio de las OD de acuerdo a lo descrito por Martínez⁽¹⁵⁾; se consideró que la prueba de comparación de poblaciones de Ji² de Pearson para dos muestras independientes como evaluación estadística de los grupos, cuya hipótesis nula (Ho) planteada fue que las pruebas diagnósticas en paratuberculosis bovina son iguales. Respecto a Se, E, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo, se calcularon mediante tablas de contingencia de 2X2; para evaluar la concordancia entre cada diagnóstico (ELISA, PCR y cultivo) se calculó mediante los valores de la prueba de Kappa de Cohen:

Donde: Po= proporción de acuerdos observados; Pe= proporción de acuerdos esperados.

Aislamiento bacteriológico

Se depositaron 2 g de materia fecal en 50 ml de cloruro de hexadecilpiridinio (HCP) al 7.6 %, se mantuvieron en agitación durante 60 min, para posteriormente dejarlos en reposo por 18 h.

Se colectaron 5 ml del sobrenadante y de la fase intermedia, se centrifugaron a 180 xg durante 10 min, se decantó el sobrenadante y a la pastilla obtenida se le adicionaron 3 ml de cloruro de benzalconio (Zephiran) al 3%, dejándolo en reposo por 30 min, posteriormente se centrifugó a 180 xg por 10 min. Se decantó el sobrenadante conservando aproximadamente 1 ml, en el cual se homogenizó la pastilla y se realizó la siembra por duplicado en medio de Herrold adicionado con yema de huevo con y sin micobactina, dejando incubar las muestras a 37 °C durante 8 a 16 semanas^(14,15,16).

Extracción de ADN a partir de excremento

Se colocaron 2 g de materia fecal en 50 ml de HCP al 7.6 %, se mantuvieron en agitación durante 60 min y 18 h en reposo. Del sobrenadante se tomaron 20 ml que se centrifugaron a 180 xg por 10 min. Se decantó el sobrenadante y se realizaron tres lavados con 5 ml de PBS a la pastilla.

Finalmente, la pastilla se resuspendió en 1.5 ml de PBS y se transfi ri ó a tubos de 2 ml, para centrifugarlo a 1,260 xg durante 5 min, se eliminó el sobrenadante y la pastilla fue resuspendida en 500 μl de Te–Triton X100 y transferida a criotubos de 1.5 ml. Las muestras se colocaron tres veces en nitrógeno líquido (–170 °C) a intervalos de 5 min y en calor seco a 100 °C, para la lisis celular. A cada muestra se le agregaron 450 μl de isotiocionato de guanidina 5M y 250 μl de acetato de amonio 7.5 M (pH 6.3) y se mantuvieron en hielo por 15 min. Las muestras se transfirieron a tubos eppendorf donde se les agregó en dos ocasiones 500 /d de cloroformo–alcohol isoamílico (1:24), se centrifugó a 1,260 xg 15 min. La fase acuosa se transfirió a un tubo eppendorf de 2 ml y se le agregaron 450 μl de isopropanol, para precipitar los ácidos nucleicos. Los tubos se colocaron a –20 °C toda la noche. Las muestras se centrifugaron a 1,260 xg por 15 min y se eliminó el sobrenadante. Se realizaron dos lavados con 1 ml de etanol al 70%. Se eliminó el sobrenadante y la pastilla se dejó secar a temperatura ambiente, para posteriormente resuspenderla en 100 μl de agua bidestilada. Las muestras de ADN se mantuvieron a –20 °C hasta su uso en la PCR anidada^(17,18,19).

PCR anidada

A las muestras de ADN obtenidas a partir de excremento, se les realizó la PCR anidada. Se utilizaron iniciadores para el elemento de inserción IS900 que es específico para Map, descritos por Erume et al⁽¹⁷⁾ Paratb1 (5' TGA TCT GGA CAA TGA CGG TTA CGG A 3') y Paratb 4 (5' CGC GGC ACG GCT CTT GTT 3') para la primer reacción de PCR, obteniendo un producto de 563 pares de bases y para la segunda reacción Paratb 2 (5 ' GCC GCG CTG CTG GAG TTG A 3') y Paratb 3 (5' AGC GTC TTT GGC GTC GGT CTT G 3') obteniendo un producto final de 210 pares de bases. Para la primer reacción se utilizaron 2 μl de ADN obtenidos a partir de excremento de bovino; las condiciones para 48 μl de premezcla fueron 5 μl de amortiguador de reacción 10X (67 mM/μl) (Biogénica), 4 μl de MgCl₂ 30 mM 20 X (Biogenica), 1 μl DNTP (200 mM), 1 μl Paratb 1 (25 pMol) (Invitrogen), 1 μl Paratb 4 (25 pMol) (Invitrogen), 0. 25 μl de polimerasa (5 U) (Amplificasa, Biogénica) y 35.75 μl de agua bidestilada. La amplificación se realizó en un termocicl ador (Thermo Electron Corporation) utilizando el programa: un ciclo a 95 °C por 5 min, 35 ciclos a 95 °C por 1 min, 65 °C por 1 min, 72 °C por 1 min, un ciclo más por 1 min a 72 °C y un ciclo a 4 °C por 5 min. Para la segunda reacción, se tomaron 3 μl de la primera reacción y se transfirieron a microtubos de PCR, que contenían la misma cantidad y concentración de reactivos ya descritos, excepto que los iniciadores Paratb 1 y Paratb 4, fueron sustituidos por los iniciadores Paratb 2 y Paratb 3. Se utilizó el mismo programa del termociclador. Se incluyó como testigo positivo ADN de la cepa de Map (ATCC 19698), las muestras se corrieron en una cámara de electroforesis (GIBCO BRL Horizontal Gel Electrophoresis Apparatus) a 100 volts por 1 h y los productos de la amplificación fueron visualizados en geles de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio^(18,19).

 

RESULTADOS

Determinación de la concentración de proteínas

Una vez resuspendido el antígeno protoplasmático se determinó su concentración de proteínas utilizando el paquete comercial Micro BCA Protein Assay Reagent Kit, se hizo la lectura a una absorbancia de 563 nm, obteniendo un promedio de 178 μg/100 μd, mientras que el antígeno PPA–3 de Map tuvo un promedio de concentración de proteínas de 174 μg/100 μl.

Estandarización del ELISA

Para la estandarización del ELISA, se evaluaron diferentes concentraciones de antígeno protoplasmático de Map cepa 3065 (10, 5, 2.5 y 1.25 μg/100 μl), los testigos positivos y negativos se diluyeron a 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160, así como también el conjugado anti IgG bovino–HRP el cual fue probado a 1:750, 1:1500 y 1:2000. La mayor diferenciación entre testigos positivos y negativos, se obtuvo empleando el antígeno a 1.25 μg/100 μl y 1:2000 de conjugado anti IgG bovino–HRP. Las diluciones de suero 1:80 y 1:160, permitieron detectar una diferencia tres veces mayor entre los testigos positivos y negativos; sin embargo, con la última dilución los sueros testigo negativos mostraron una OD promedio de 0.143 y los testigo positivos se mantuvieron elevados con un promedio de 0.532 OD; por esta razón se consideró que la mejor dilución del suero era 1:160 para llevar a cabo la evaluación del ELISA (Cuadro 1).

Determinación del punto de corte, sensibilidad y especificidad

Los valores promedio obtenidos fueron de 0.01 (OD) el valor más bajo, y 1.43 (OD) el valor más alto; los resultados obtenidos con las 100 muestras, permitieron establecer un punto de corte de 0.196 (OD), por lo que los valores iguales o mayores a este valor fueron considerados como positivos (Figura 1).

Además que se logró clasificar de una manera semi–cuantitativa los 50 sueros positivos en escalas de fuerte, positivo y débilmente positivos en base a la intensidad de respuesta de los sueros y los valores promedio de las densidades ópticas (Figura 2).

Al trabajar para la estandarización con un banco de sueros tanto positivos con cultivo y PCR y sueros negativos, la Se y E que se obtuvo fue de 100 % y un valor de Kappa de 0.98. Con un valor predictivo positivo de 100 % y un valor predictivo negativo de 100 %.

Evaluación con muestras de campo

Se obtuvieron 68/491 (13.84 %) muestras positivas y 423 negativos al ensayo. Se calculó la sensibilidad y especificidad para la prueba, empleando los resultados de cultivo y PCR como "pruebas de oro". Los resultados obtenidos indican que el ELISA tuvo una Se=79.31 %, E=82.25 %, con un valor predictivo positivo de 22 % y un valor predictivo negativo de 98 %, con una concordancia entre las pruebas de 0.2763 con respecto al cultivo. Al compararla con la PCR se tuvo una Se= 67.8 %, E= 84 % con un valor predictivo positivo de 38 % y un valor predictivo negativo de 95 %, con una concordancia entre las pruebas de 0.394 Al determinar la Se y E de la PCR con respecto al cultivo bacteriológico fue de 62.7 % y 91.13 % con un valor predictivo positivo de 30.5 % y un valor predictivo negativo de 97.45 %, con una concordancia entre las pruebas de 0.66. Las observaciones de cada técnica diagnóstica, corresponden a grupos independientes, ya que con la prueba de Ji² empleada, se obtuvo un resultado altamente significativo P<0.01, Los resultados indican que tanto PCR como el cultivo son técnicas diagnósticas muy parecidas, sin embargo comparado con ELISA existe diferencia entre ellas.

Aislamiento bacteriológico

Se realizó el cultivo bacteriológico de las 491 muestras de excremento, obteniendo 29 aislamientos positivos (5.9 %). Se observó crecimiento de colonias bacterianas a partir de la octava semana de incubación; únicamente en los medios que fueron adicionados con micobactina y con la tinción de Ziehl–Neelsen se observaron bacilos ácido–alcohol resistentes (BAAR). La identificación definitiva de los aislamientos compatibles con Map se realizó por medio de la prueba de PCR anidada ya descrita.

Reacción en cadena de la polimerasa

Se probaron las 491 muestras de excremento, y en total amplificaron 59 muestras (12.01 %), obteniendo un producto final de 210 pares de bases que corresponde a la región IS900 que es específica de Map (Figura 3).

 

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en el presente trabajo muestran que el ELISA con antígeno de Map cepa 3065, presentó una Se y E relativas de 79.31 % y 82.25 %, respectivamente, al compararla con el aislamiento bacteriológico, el cual es considerado como la prueba de oro. Dichos resultados coinciden con los obtenidos en diversos estudios, donde se han realizado evaluaciones con diferentes antígenos de Map, en ELISAs para el diagnóstico de ptb, en los cuales la Se del ensayo va de un 30 al 95 %^(20,21,22).

La capacidad del resultado positivo o negativo de una prueba para predecir de forma precisa el estado de un animal o población con respecto a una infección, es la consideración más importante para la validación de un ensayo, por lo que se deben considerar factores que pueden influir en el resultado, en este caso al desarrollar el ELISA para determinar la presencia de anticuerpos contra Map, se sabe que en ocasiones los animales negativos a ELISA pueden resultar positivos a PCR o al aislamiento bacteriológico, debido a que en etapas tempranas de la infección la respuesta inmune predominante es de tipo celular, y la eliminación del bacilo en excremento comienza a darse de manera intermitente. Otra razón por la cual la producción de anticuerpos se puede ver afectada es a causa de la pérdida de respuesta inmune ante la infección; esta actividad supresora es denominada anergia, y se presenta cuando los animales son viejos o la infección está en su etapa final, de manera que estos animales pueden estar excretando el bacilo y no ser detectados con las pruebas serológicas^(20–23).

De las 491 muestras trabajadas, 59 fueron positivas a PCR anidada y se obtuvieron 29 aislamientos de Map, lo que equivale al 12.01 y 5.9 %, respectivamente. Estos resultados coinciden con lo descrito por Erume et al⁽¹⁷⁾, quienes detectaron una mayor canti dad de animales positivos a paratuberculosis a partir de excremento, utilizando la PCR anidada y una menor cantidad mediante el aislamiento bacteriológico, el cual es considerado como la prueba de oro para el diagnóstico de ptb en bovinos, pero que presenta algunas limitantes, pues el procedimiento requiere de 8 a 16 semanas de incubación como mínimo para el aislamiento de Map. Otra desventaja que presenta el cultivo es la contaminación de las muestras con otros microorganismos, principalmente hongos. La PCR anidada es capaz de detectar bacterias viables y no viables, además tiene la ventaja de que los resultados a partir de esta prueba se pueden obtener en tres días, lo que representa una ventaja de tiempo en comparación con el aislamiento bacteriológico^(17,18,19).

La concordancia entre las distintas pruebas ELISA, PCR anidada y cultivo bacteriológico utilizadas en el presente trabajo, fue considerada de baja a discreta; sin embargo cabe señalar que cada método, detecta a los animales en diferente etapa de la infección, pero su uso de manera complementaria, contribuyó a que se incrementara la sensibilidad de la prueba serológica⁽²³⁾.

Estudios de tipo epidemiológicos transversales realizados en ganado bovino de los Estados de Guanajuato y San Luis Potosí; indican que existe una seroprevalencia de ptb del 10.71 y 31.3 % respectivamente; en el presente trabajo se incluyeron muestras de animales que procedían de los Estados de Hidalgo, Aguascalientes y Estado de México, de las cuales se obtuvieron 68 animales positivos de los 491 animales evaluados con el ELISA con antígeno protoplasmático de Map 3065, esto corresponde a una frecuencia de 13.84 %, si bien este dato no proviene de un estudio con diseño epidemiológico, pone de manifiesto que la enfermedad, se encuentra ampliamente distribuida en hatos de distintos Estados del País y que se requiere el realizar estudios con los que se pueda determinar la situación real de la enfermedad, y el impacto económico que representa para la ganadería nacional^(24,25,26).

Los antígenos protoplasmáticos de Map, que se utilizan en las pruebas serológicas, son mezclas complejas de lípidos, carbohidratos, proteínas y ácidos nucleicos que contienen determinantes antigénicas en común para la mayoría de las cepas de Map sin importar que sean de origen ovino o bovino^(21,22). Existe un alto grado de conservación genética entre las cepas de Map de origen ovino y bovino, por lo que comparten determinantes antigénicos, los cuales son reconocidos por los anticuerpos presentes en los sueros que resultan positivos a las pruebas serológicas. Se considera que una de las limitantes por las cuales no se lleva a cabo el diagnóstico de la ptb en el ganado en México, es por la falta de antígenos o paquetes comerciales de ELISA, ya que los que existen en el mercado, tienen un precio alto y el tiempo de entrega del material tarda demasiado tiempo, al ser productos de importación; razón por la cual es importante el realizar estudios con cepas de Map de origen nacional, para la obtención de antígenos que sean evaluados como candidatos para poder llevar a cabo el diagnostico de la enfermedad.

La cepa de Map 3065 que se empleó para obtener el antígeno, se obtuvo de un caso clínico de ptb en ovino, procedente de un rebaño de Toluca, Edo. de México; la evaluación del antígeno fue realizada por Hernández⁽¹⁴⁾, quien describe el perfil proteínico de ocho bandas que tienen un peso que va de 20 a 160 kD, y una concentración de proteínas de 104 μg/100 μd. Los resultados obtenidos en el ELISA empleando antígeno protoplasmático de la cepa de origen ovino, son mejores comparados con los de Singh et al⁽²²⁾, quienes estandarizaron un ELISA con antígeno protoplasmático de una cepa de Map "tipo bisonte" de origen caprino, con la que han evaluado sueros de búfalos, bovinos y caprinos, teniendo una Se 50 y E 90 %. Se coincide con este trabajo en que el ensayo se puede utilizar con muestras de suero de distintas especies animales, independientemente del origen (ovino, bovino, caprino) de la cepa de Map con la que se elabore el antígeno para el ELISA.

Estudios realizados por Park et al⁽⁸⁾ y por Speer et al⁽⁹⁾, con un ELISA usando antígeno sonicado elaborado con una cepa de referencia de Map de origen bovino, con una concentración de proteína de 400 ng/100 /d, y 3200 ng de proteína por pozo (100 μl) respectivamente, la Se y E para ambos casos fue de 95.2 y 96.7 % respectivamente; sin embargo se considera que la prueba tiene la desventaja de que es costosa y que requiere de entrenamiento para alcanzar resultados confiables y constantes. Los resultados del presente trabajo, se obtuvieron utilizando una concentración de proteína de 178 ng por cada 100 μd de buffer de carbonatos; y se comprobó que a menor cantidad de antígeno, la divergencia entre los valores de los sueros positivos y negativos aumentaba, permitiendo una mejor diferencia entre estos.

Pinedo et al⁽³⁾ analizaron 328 muestras de suero, sangre y excremento y determinaron la asociación entre ELISA, cultivo, PCR de sangre y excremento para el diagnóstico de Map (P<0.05).

La prueba Chi² (ji cuadrada de Pearson), se emplea cuando las observaciones de una investigación corresponden a muestras independientes y las mediciones se tienen en escala nominal, y el análisis corresponde a dos o más grupos, de dos o más variables. Los resultados obtenidos con esta prueba fueron significativos (P<0.01), por lo que existen diferencias entre las pruebas evaluadas. El análisis estadístico realizado en ambos estudios determina que al menos uno de los grupos es diferente y que dependiendo del número de observaciones obtenidas, se elegirá el análisis estadístico a aplicar⁽³⁾.

Se considera importante que para determinar o clasificar las muestras positivas de las negativas de un ELISA, se recomienda agregar al valor promedio que se emplea como punto de corte dos o tres desviaciones estándar, para incluir en teoría al 95 ó 99 % de la población seronegativa, teniendo como inconveniente que al utilizar dos desviaciones estándar se pueden dar resultados falso positivos, pero al trabajar con tres desviaciones estándar existe la probabilidad de dar resultados falsos negativos, es decir se subestima o sobre estima la población susceptible⁽²⁷⁾. Al trabajar con los 50 sueros positivos a PCR y cultivo, que fueron empleados para estandarizar el ensayo, siete fueron clasificados como débilmente positivos (0.19 a 0.29 OD), si el punto de corte se hubiera establecido con tres desviaciones, estos hubieran sido clasificados como falsos negativos.

Diversos trabajos sobre la evaluación de los ELISA, para el diagnóstico de ptb, establecen el punto de corte entre 0.23 a 0.25 OD^(11,21,28). El punto de corte que se determinó en este trabajo fue de 0.196 OD y se obtuvo mediante dos desviaciones estándar y un intervalo de confianza del 95 %, lo cual permitió detectar una mayor cantidad de animales infectados y que fueron también positivos al cultivo bacteriológico y PCR anidado, con esto la sensibilidad de la prueba fue mayor en animales que comenzaban a presentar los signos clínicos de la enfermedad^(13,23); al utilizar un punto de corte mayor a 0.23 OD, se tiene la posibilidad de dar un resultado falso negativo, y dejar animales dentro del hato que posteriormente desarrollarán la enfermedad (23).

En las pruebas de tamiz y diagnóstico, la probabilidad de que un individuo con una prueba positiva, sea realmente positivo (es decir que este cursando con la enfermedad), se le denomina valor predictivo positivo, mientras que el valor predictivo negativo, se refiere a la proporción de individuos con un resultado negativo a la prueba que no tienen la enfermedad. Es importante remarcar que el valor predictivo, está asociado a la sensibilidad y especificidad de la prueba, así como también que es altamente dependiente de la prevalencia de la enfermedad en la población donde se aplica la prueba⁽²⁹⁾. Bench–Nielsen et al⁽³⁰⁾, al evaluar un ELISA elaborado con extractos de antígeno sonicado de la cepa de Map ATCC 19698, y preabsorber los sueros con una solución de M. phlei, obtuvieron un valor predictivo positivo del 100 %, pero solamente incluyeron en el experimento sueros provenientes de animales con cultivo positivo a Map y sueros negativos de hatos libres. En la primera parte del trabajo al estandarizar el ELISA se obtuvo un valor predictivo positivo y negativo del 100 %, por haber utilizado sueros con las mismas características descritas anteriormente, pero al evaluar el ensayo con muestras de campo el valor predictivo positivo bajó considerablemente a 22 % con respecto a cultivo y 38 % a PCR, esto se debe a que las muestras trabajadas procedían de diferentes Estados del País, y de distintos hatos donde se han presentado casos de ptb, pero que se desconoce su prevalencia; además la ptb es una enfermedad de tipo crónico y generalmente la detección de anticuerpos contra Map, es posible realizarla hasta que el animal tiene entre 18 a 24 meses de edad. Cabe hacer mención que el valor predictivo negativo fue de 98 % con respecto a cultivo y 95 % a PCR, por lo que las muestras de animales de campo con resultado negativo al ELISA, fueron correctamente clasificadas, ya que correspondieron a los verdaderos negativos.

Otra situación que hay que tomar en cuenta, son las posibles reacciones cruzadas. Yokomizo et al⁽¹²⁾, demostraron que al dar un tratamiento a sueros, con una solución de M. phlei para absorber los anticuerpos no específicos, se reducían los resultados falso positivos ocasionados por infecciones con Nocardia, Corynebacterium, Mycobacterium bovis y otras micobacterias; este método no afecta los niveles de anticuerpos producidos contra Map, e incrementa la sensibilidad y especificidad de las pruebas serológicas^(12,21,30). En la evaluación realizada se trabajaron con varias diluciones de los sueros en la solución de M. phlei, la dilución de 1:160 fue con la que se obtuvieron los mejores resultados. Los sueros clasificados como positivos, fueron confirmados por cultivo y PCR, además considerando que se tuvo un valor predictivo negativo elevado, se podría pensar que no se tuvieron problemas con posibles reacciones cruzadas.

Al momento se han trabajado con 20 sueros de bovinos que fueron positivos al PPD bovino, y el resultado fue negativo. Al trabajar con 20 sueros de bovinos que fueron positivos al PPD aviar en la prueba cervical comparativa, siete fueron detectados como positivos a ptb por el ELISA y confirmados por PCR, lo que implica que se puede utilizar para realizar el diagnóstico diferencial con tuberculosis. Si bien son pocas muestras las que se han trabajado, esto permite tener un criterio más amplio de lo que está pasando en los hatos donde existen las dos enfermedades (datos no publicados).

 

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

La ptb es una enfermedad que causa grandes pérdidas económicas en la ganadería, por lo que, se requieren de pruebas diagnósticas sensibles y específicas para lograr la detección y posterior eliminación de los casos clínicos y subclínicos de los hatos, para que, de esta manera se reduzca la exposición de los animales jóvenes que son los más susceptibles a infectarse con Map. Además de que se hace indispensable el contar con técnicas diagnósticas que sean de fácil implementación en los laboratorios, y que puedan ser utilizadas para desarrollar estudios de tipo epidemiológico sobre la enfermedad en diversas especies de animales domésticos y silvestres, para poder determinar las medidas necesarias para su control. Los resultados obtenidos en el presente estudio, permiten recomendar el uso del ELISA con el antígeno protoplasmático de Map cepa 3065 (cepa nacional) como una alternativa para el diagnóstico de la ptb bovina, considerando que el diagnóstico de la enfermedad se debe llevar a cabo con una prueba serológica y una prueba confirmatoria como lo es el PCR o el cultivo.

 

AGRADECIMIENTOS

Proyecto financiado parcialmente por Fondos Mixtos CONACYT–SAGARPA 48176.

 

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