Notas de investigación

 

Diseño y construcción de un péptido con potencial inmunogénico a partir del dominio de unión a supresor de hairless de la proteína hairless de Drosophila melanogaster*

 

Design and construction of a polypeptide with immunogenic potential from suppressor of hairless binding domain from Drosophila melanogaster hairless protein

 

Humberto Contreras Cornejo^a, Víctor Manuel Baizabal Aguirre^a, Juan José Valdez Alarcón^a, Marco Cajero Juárez^a, Alejandro Bravo Patiño^a

 

^a Centro Multidisciplinario de Estudios en Biotecnología (CMEB), Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Posta Veterinaria, Km. 9.5 Carretera Morelia-Zinapécuaro. Tarímbaro, Mich. Teléfono y Fax: (443) 295-80-29. abravo@umich.mx. Correspondencia al último autor.

 

Recibido el 3 de agosto de 2010.
Aceptado el 9 de diciembre de 2010.

 

RESUMEN

Las funciones de los diferentes tipos de células que constituyen un organismo multicelular, son reguladas mediante vías de transducción de señales, cuyo objetivo final es la regulación de genes blanco. La vía de señalización Notch participa principalmente en el desarrollo temprano y tardío del embrión, y en menor grado en el funcionamiento correcto del individuo. Hairless es una proteína involucrada en la vía de señalización Notch y su papel es modular negativamente la vía. A pesar de los esfuerzos realizados para detectar a hairless en animales superiores, no se ha logrado identificar un homólogo de la misma. Su identificación es fundamental para entender mejor los procesos de regulación de la vía, del desarrollo embrionario y de otros procesos patológicos que involucran a Notch. Los homólogos de Hairless en insectos poseen al menos tres dominios altamente conservados, de los cuales el dominio de unión a Supresor de hairless, una proteína propia de la vía, es el más conservado. Mediante análisis in silico y técnicas de biología molecular se identificó y delimitó un péptido con potencial inmunogénico del dominio de unión a Supresor de hairless de la proteína hairless de Drosophila melanogaster. Este péptido se usó como antígeno en gallinas, para generar anticuerpos policlonales. Los sueros se probaron contra extracto total de proteína de embriones de la mosca de la fruta.

Palabras clave: Desarrollo embrionario, Notch, Hairless, Péptidos inmunogénicos.

 

ABSTRACT

Signal transduction pathways regulate the functions of different types of cells that constitute a multicellular organism; with the final goal of to regulate of target genes. The Notch signaling pathway is mainly involved in early and late embryo development, and recently has been described its participation in the adult organism proper function. Hairless, a protein member of the Notch signaling pathway modulates negatively this signal transduction pathway. Despite efforts to detect Hairless in higher animals, it has not been able to identify a homolog protein. The identification of a Hairless homolog protein is essential for the understanding of the regulatory processes during embryo development and other pathological processes where Notch pathway is involved. The Hairless counterparts described in insects have at least three highly conserved domains, where the Suppressor of Hairless binding domain is the most conserved. Using analysis in silico and molecular biology techniques was identified and delimited a peptide with immunogenic potential from the Suppressor of Hairless binding domain from Drosophila melanogaster Hairless protein. This peptide was used as antigen to generate polyclonal antibodies in hens. Sera were tested against total protein extract from fruit fly embryos.

Key words: Embryo development, Notch, Hairless, Immunogenic peptides.

 

En los últimos años, los avances biotecnológicos en la producción animal se han enfocado a la obtención de embriones in vitro, tanto para su transferencia a hembras receptoras, como para su manipulación genética. Sin embargo, la baja supervivencia de este tipo de embriones impacta negativamente su viabilidad para la transferencia, lo cual representa un problema para la implementación de estas técnicas. Las metodologías biotecnológicas en la producción animal implican el conocimiento de la composición y tipo de medios de cultivo empleados, la clonación por transferencia nuclear, el sexado de embriones, la producción de animales transgénicos y la determinación de la viabilidad misma de los embriones, entre otras.

Actualmente, y dado que la comunicación celular es la encargada de regular las complejas organizaciones espacio-temporales de los organismos vivientes, es esencial un conocimiento detallado a nivel molecular del desarrollo embrionario para ayudar a esclarecer los mecanismos reguladores de las vías de comunicación celular, lo que a su vez ayudaría a proponer estrategias más finas de manipulación de embriones in vitro⁽¹⁾, para impactar de manera favorable en la producción animal. La comunicación celular, una característica común de los organismos multicelulares complejos, es regulada mediante vías de transducción de señales, cuyo fin es la activación o inactivación de genes blanco.

Las vías de transducción de señales conocidas en animales pueden contarse por decenas, pero de manera particular en el desarrollo embrionario temprano y tardio de los metazoarios, ha sido posible identificar siete vías que aseguran el correcto destino celular: Wingless (Wnt), Factor de Crecimiento Transformante beta (TGF-β), Hedgehog (Hh), Receptor de Tirosina Cinasa (RTK), Receptor Nuclear, Jak/STAT y Notch (N). Cada vía es usada de manera reiterada durante el crecimiento de los organismos de acuerdo al contexto o estadio de desarrollo^(2-5).

De estas siete vías, Notch tiene un papel muy importante durante el desarrollo embrionario de los metazoarios, ya que toma el control del desarrollo embrionario, especialmente durante la formación de somites. Dentro de los elementos de la vía N, la proteína hairless (H) juega un papel importante como el mayor antagonista de la vía, definiendo los destinos celulares; sin embargo, su actividad es prácticamente desconocida en mamíferos, ya que no se ha logrado detectar ningún ortólogo o parálogo de esta proteína⁽⁶⁾. En Drosophila melanogaster (D.m.), H posee varios dominios de unión bien conservados. En el extremo N-terminal se encuentra el dominio de unión DS que sirve de enlace a la proteína Supresor de hairless (Su[H]), un factor de transcipción propio de la vía. En la región central de la proteína se encuentra el dominio DA, de enlace a Groucho (Gro) y, finalmente, en la región C-terminal se encuentra el dominio DC, al que se une la Proteína de Unión a C-terminal (CtBP, por sus siglas en inglés). Gro y CtBP son dos co-represores necesarios para regular la expresión de los genes blancos de N. En este contexto, H actúa como una molécula de unión entre Su(H) y los compresores^(7-16).

Estudios comparativos entre las proteínas H de D. hidei y D.m. , especies con 50 millones de años de divergencia, revelan una baja conservación de los dominios DS, DA y DC, donde el más conservado es DS (H"85%) y el menos conservado es el DA (H"33%)^(16,17,18).

La proteína H no solo muestra variación en sus dominios funcionales, sino también en su tamaño, lo cual se evidencia en el hecho de que un ortólogo de H recientemente estudiado en Apis mellifera (H.A.m), muestra una proteína con un peso molecular de 44.5 kDa que corresponde a un tercio del tamaño respecto a la proteína H de D.m. de 110 kDa, pero que contiene los dominios conservados DA, DS y DC, que son esenciales para su funcionamiento⁽¹⁸⁾.

El conocimiento detallado de la proteína H en invertebrados, es requisito para identificar los homólogos funcionales en mamíferos, donde a pesar de los esfuerzos, no se ha encontrado ningún homólogo de H en vertebrados^(9,18). La falta de identificación de una proteína con funciones semejantes a H, que no excluye la presencia de un parálogo u ortólogo en animales superiores, explica por qué este gen sea ampliamente ignorado en el desarrollo embrionario de los mamíferos. Sin embargo, una vez que los detalles de la regulación negativa en la vía de señalización de N se clarifiquen, se espera identificar una proteína funcional con las características de H, en animales superiores⁽⁶⁾, sobre todo si se sabe que todos los metazoarios, desde insectos hasta el hombre, necesitan de N para llevar a cabo con éxito la diferenciación celular durante la embriogénesis^(18,19).

Por tanto, es posible que generando péptidos con potencial inmunogénico para producir anticuerpos policlonales contra DS, partiendo de un análisis in silico para identificar las zonas más antigénicas de dicho dominio de H de D.m., se avance en la identificación de una proteína funcional similar a H en embriones de animales superiores, con la finalidad de poder establecer estrategias biotecnológicas más finas a nivel molecular, que aseguren la su pervivencia de embriones de mamíferos in vitro y se logre un mayor impacto en la aplicación de la biotecnología en la producción animal.

A fin de delimitar el dominio de interés de la proteína H y poder generar una construcción que nos permitiera obtener un péptido in vitro, para ser utilizado como antígeno en gallinas, y así poder generar anticuerpos policlonales contra este dominio, se utilizaron las siguientes técnicas:

Análisis de hidrofobicidad y antigenicidad del dominio DS de D.m

Se partió de la comparación hecha por Maier et al⁽¹⁸⁾ de los homólogos de H en invertebrados, donde se reporta a DS como la región mejor conservada de la proteína. Con el programa CLC Main Workbench 5.6.1 (CLC bio, Aarhus, Dinamarca) se realizó un análisis de antigenicidad e hidrofobicidad de la secuencia reportada por los mismos autores para delimitar las zonas con mayor inmunogenicidad.

Obtención del fragmento DS y clonación en el vector pF1A T7 Flexi®

Se diseñaron dos oligonucleótidos par amplificar DS. El DSFLEXI01 (5' -gA CCgCGATCgCCATgTC CACCgCCTCAAATggCTT-3'), que inserta en el extremo 5' un codón de inicio (ATg en negritas), el sitio de restricción para Sgf I y cuatro bases aleatorias. El DSFLEXI02 (5'-C77ggTTTAAACg TCTCCATTTTCCgCCTTgATTgC-3'), que inserta en el extremo 3' el sitio de restricción para Pme I que incluye el codón de valina, un codón de paro y cuatro bases aleatorias. El fragmento DS se obtuvo mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de ADN de D.m. silvestre y ADNc de la variante rucuca de D.m del laboratorio de D. Maier y A. Preiss (Instituto de Genética de la Universidad de Hohenheim, Sttutgart, Alemania), y agregando a concentración final los siguientes reactivos: 150 ng de ADN genómico, amortiguador para PCR (Tris-HCl 200 mM, KCl 500 mM), 2 mM de MgCl₂, 0.2 mM de dNTP's, 0.2 µM de cada oligonucléotido, 1.0 U de Taq DNA polimerasa (Gibco BRL®, Gaithersburg, MD, USA) y agua destilada desionizada estéril para un volumen final a 50 µl. La reacción de PCR se llevó a cabo en un termociclador GeneAmp® PCR System 2700 (Applied Biosystems), empleando el siguiente programa: 1 ciclo a 94 °C por 3 min, 2 ciclos a 94 °C por 30 seg, 55 °C por 45 seg, 72 °C por 90 seg; 35 ciclos a 94 °C por 20 seg, 61.3 °C por 30 seg y 72 °C por 90 seg; un ciclo a 72 °C por 7 min y un ciclo sostenido a 4 °C. El producto de PCR se clonó en el vector pF1A T7 Flexi® (siguiendo las instrucciones del fabricante) empleando el Kit de clonación Flexi® Vector Systems y las enzimas de restricción correspondientes (PROMEGA™, USA).

Transcripción y expresión del fragmento DS

Para la transcripción y expresión del fragmento DS se empleó el kit TnT® Coupled Reticulocyte Lysate System® (PROMEGA™, USA), se siguieron las indicaciones del fabricante, ya que permite realizar transcripción, procesamiento de intrones y traducción in vitro en una sola reacción. Después de las reacciones se verificó la presencia del péptido en un gel de acrilamida SDS-Page al 10%.

Uso y actividad inmunogénica del péptido generado como antígeno

El péptido generado in vitro se empleó para inmunizar gallinas de acuerdo al siguiente programa: el péptido de interés obtenido con el kit TnT^® Coupled Reticulocyte Lysate System se identificó en un gel SDS-PAGE. La banda se cortó y homogenizó en 500 µl de solución salina isotónica. Se añadió un volumen de adyuvante Completo (en la primera inmunización) o Incompleto (en las siguientes inmunizaciones) de Freund® (Sigma™, USA), se llevó a un volumen de 1.5 ml con solución salina isotónica y se inyectó vía intramuscular a los largo de la quilla en gallinas en etapa productiva. El procedimiento se repitió una vez por semana durante cuatro semanas. Se obtuvieron 2 ml de sangre antes de cada inmunización y una semana después de la última, para determinar el título de anticuerpos generados. Para separar el suero, de las gallinas se dejó formar el coágulo y se incubó a 4 °C toda la noche, después de la incubación se centrifugó a 10,000 rpm durante 10 min, se recuperó el sobrenadante en tubos eppendorf de 1.5 ml estériles y se congeló a -20 °C.

Obtención de proteína de embriones de D. melanogaster

Las moscas se colocaron en placas con medio de manzana (se agregaron 12 g de Agar en 375 ml de agua y se esterilizó; se agregaron 125 ml de jugo de manzana y 12.5 g de azúcar, se calentó a 60 °C; se mezcló el agar y el jugo de manzana, se mantuvieron a 60 °C; se agregaron 5 ml de Nipagina al 15 % en etanol absoluto, se mezcló y se vertió en cajas petri [60x15 mm. SyM Laboratorios, México]) a fin que ovipositen. Los embriones se colectaron cada 30 min. El corion de los embriones se eliminó lavando, sobre la placa de medio de manzana, con una solución de cloro al 50 % durante 30 seg. Los embriones se pasaron a una malla fina para eliminar la solución de cloro y se enjuagaron con solución de lavado (NaCl al 0.7%, Tritón x100 al 0.02%). Se colectaron 100 embriones y se colocaron en un tubo eppendorf de 1.5 ml estéril. Se adicionaron 100 µl de amortiguador de homogenizado (10 mM de HEPES pH 7.6, 5 mM de EGTA, 5 mM de EDTA y 1 a 2 µl de PMSF a una concentración final de 0.5 mM). Se incubaron a 90-95 °C durante 5 min. Se centrifugaron durante 30 min a 14,000 rpm a 4 °C. El sobrenadante se recuperó en un tubo eppendorf de 1.5 ml esteril y se almacenó a -20 °C.

Titulación del suero

Para la titulación del suero se utilizó la técnica de Dot Blot de acuerdo al siguiente protocolo: se cortaron cuadros de membrana de nitrocelulosa (MNC) de 2 cm², se impregnaron en TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5) durante 15 min y se dejaron secar los cuadros. Se agregó 1 µg de antígeno (extracto total de proteína de embriones de D.m. ) sobre la MNC y se dejó secar de 5 a 10 min. Los cuadros de MNC se transfirieron a cajas de cultivo celular de seis pozos (Corning Incorporated, NY, USA) y se agregó 1 ml de solución bloqueadora al 5% (Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk®, BIORAD™ en TTBS [TBS más 0.1% de Tween 20®, BIORAD™]) por 45 min en agitación constante (todos los procedimientos se realizan en agitación constante a menos que se indique lo contrario); el bloqueo se repitió durante 45 min. La MNC se lavó con agua destilada estéril durante 10 min, después se lavó con TBS durante 10 min y por último se lavó con TTBS durante 10 min. El suero obtenido de las gallinas (anticuerpo primario) se añadió por separado, en diluciones de 1:200, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:3000 y 1:5000 en un volumen de 1 ml en solución bloqueadora al 5% y se dejó en agitación a 4 °C por lo menos 12 h. Después de la incubación, la membrana se dejó con la dilución del suero a temperatura ambiente por aproximadamente 1 h, sin agitación. La MNC se lavó con agua destilada estéril durante 10 min, después se lavó con TBS durante 10 min y por último se lavó con TTBS durante 10 min. Se agregó el anticuerpo secundario, cabra anti-IgY de pollo, conjugado a peroxidasa de rábano (Santa Cruz, Inc. CA. USA.) en solución bloqueadora al 5%, a una dilución de 1:5000 y se dejó en agitación 1 h; se eliminó la solución. Se agregó el reactivo de Luminol (Western Blotting Luminol Reagent®, Santa Cruz Biotechnology, Inc. CA. USA.), se incubó 1 min. La MNC se dejó en contacto con placas radiográficas (ORTHO T2, JUAMA, México) a tiempos de exposición variables de 3 a 10 min y se reveló.

Inmunodetección de H en extracto total de embriones de D.m. mediante Western Blot

La separación de las proteínas del extracto de embriones de D.m. (15-20 µg) se realizó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 10% y se transfirieron a una MNC mediante electroforesis a 250 mA durante 1.5 h con agitación constante de amortiguador de transferencia. La MNC colocó en solución bloqueadora al 5% durante 45 min, con un cambio de esta solución y bloqueo durante 45 min adicionales. La MNC se lavó tres veces (10 min/lavado) con agua destilada desionizada esteril, TBS y TTBS respectivamente. El suero obtenido de la gallina GN (anticuerpo primario) se añadió a una dilución de 1:3000 y se dejó incubando a 4 °C por lo menos 12 h. Posteriormente, la membrana se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 h y se lavó tres veces (10 min/lavado) con agua destilada desionizada esteril , TBS y TTB S respectivamente. Se agregó el anticuerpo secundario, cabra anti-IgY de pollo, conjugado a peroxidasa de rábano (Santa Cruz, Inc. CA. USA.) en solución bloqueadora al 5%, a un título de 1:5000 y se dejó en agitación 1 h; se eliminó la solución. Se agregó el reactivo de Luminol (Western Blotting Luminol Reagent®, Santa Cruz Biotechnology, Inc. CA. USA.), se incubó 1 min. La MNC se dejó en contacto con placas radiográficas (ORTHO T2, JUAMA, México) a tiempos de exposición variables de 3 a 10 min y se reveló.

Con la estrategia descrita se obtuvieron los siguientes resultados:

Análisis in silico de DS: Su(H) es una proteína que forma parte del núcleo principal de los componentes de la vía de señalización N en D.m. y cuenta con un homólogo en mamíferos, identificado como CBF1 (RBPJk), lo que sugiere la existencia de una proteína con una función similar a H, necesaria para formar complejos de represión transcripcional en mamíferos, ya que en drosofílidos se requiere de H para reclutar proteínas necesarias para este tipo de complejos. Recientemente⁽²⁰⁾, se ha destacado que las proteína SHARP/MINT/SPEN forma parte de los complejos de represión reportados en mamíferos, y por lo tanto antagonizan la activación de la señalización de Notch/RBP-Jk, quedando abierta la posibilidad que esta proteína sea considerada como parálogo de H en estas especies. Sin embargo, no han habido estudios conluyentes al respecto, ya que dichas proteínas no han sido caracterizadas funcionalmente.

Al realizar un análisis de los homólogos en H reportados en invertebrados, se observó⁽¹⁸⁾ que la región mejor conservada de la proteína era precisamente el dominio DS. Tomando en cuenta lo anterior, y utilizando el programa CLC Main Workbench 5.6.1, en el presente trabajo se realizó un análisis de antigenicidad e hidrofobicidad de DS, con el algoritmo de Kyte-Doolittle⁽²¹⁾, con la finalidad de determinar si además de ser el dominio mejor conservado de H, el péptido que pudiera ser generado a partir de su secuencia de ADN tenía la capacidad antigénica suficiente como para ser empleado en la generación de anticuerpos policlonales capaces de reconocerlo formando parte de una proteína funcional completa.

Como resultado de este análisis, en la Figura 1 se observa que existen varias zonas hidrofóbicas, siendo las más representativas las localizadas entre los aminoácidos (aa) 25-35 y 65-75 (Panel A). Así mismo, se muestran las zonas hidrofílicas más representativas, localizadas entre los aa 185-195, 120-125 y 222-230 (Panel A). Al comparar los resultados anteriores con el análisis de antigenicidad, se observa que los picos hidrofóbicos e hidrofílicos corresponden, en general, con las zonas más inmunogénicas de DS, las cuales se localizan entre los aa 10-15, 25-30, 63-72, 120-125 y 220-230 (Figura 1, Panel B). Estos resultados en conjunto, sugieren que el péptido que se genere a partir del fragmento de gen H que contenga codificado el dominio DS, tiene amplias posibilidades de ser utilizado para generar anticuerpos policlonales dirigidos contra el dominio más conservado de la proteína H.

Obtención del dominio DS y generación de la construcción pF1A. Para amplificar la región correspondiente al dominio DS del gen H, se utilizó ADN genómico proveniente de D. m. rucuca y ADN genómico de D. m. silvestre (como testigo), para llevar a cabo la reacción de PCR. Como resultado se obtuvo la amplificación de dos bandas, una de aproximadamente 758 pb, proveniente de D. m. rucuca y otra de aproximadamente 1416 pb proveniente de D. m. Las bandas de ADN obtenidas corresponden a los tamaños esperados en cada caso, y la diferencia en el tamaño de los mismos se debe al hecho de que el gen de H proveniente de D. m. rucuca no contiene intrones. El producto de PCR, obtenido de D. m. rucuca, se ligó en el vector pF1A T7 Flexi® siguiendo las instrucciones del Kit, y se obtuvo la construcción pF1A-DS, que se clonó en la cepa de Escherichia coli TOP10®.

Para corroborar la presencia del fragmento en el vector se realizó una digestión con la enzima Sph I que tiene un sitio de restricción en la secuencia del vector y otra en el inserto DS. En la Figura 2 se muestran los fragmentos obtenidos después de la restricción; los cortes liberaron un fragmento de aproximadamente 800 pb, que corresponde al inserto más una pequeña parte del plásmido, y un fragmento de aproximadamente 3,100 pb que corresponde al resto del vector. En ausencia del inserto el plásmido sólo se hubiera linearizado mostrando una sola banda de aproximadamente 3,100 pb. Cabe mencionar que también se realizó la secuenciación del inserto en este vector y se confirmó que se trataba de la secuencia correspondiente al dominio DS (datos no mostrados).

Transcripción y traducción de DS. Para la transcripción y expresión de DS se empleó el kit TnT^® Coupled Reticulocyte Lysate System®, según las instrucciones del fabricante. Los productos obtenidos de las reacciones se analizaron en geles de poliacrilamida al 10%. En la Figura 3 se observa en los carriles 3 y 4 la presencia de un péptido de aproximadamente 21 kDa, que corresponde al peso esperado para el péptido DS. Además, dicha banda no aparece en el carril 2, que corresponde al testigo negativo de expresión. Por lo anterior suponemos que el péptido DS se expresa a partir del plásmido pF1A-DS.

Uso y actividad inmunogénica del fragmento DS, inmunización, titulación mediente Dot Blot. Se inmunizó una gallina (GN) en producción con los procedimientos antes descritos. Como ya se mencionó, se obtuvieron los sueros correspondientes después de cada inmunización y estos se titularon mediante la técnica de Dot Blot, usando como antígeno 1 µg de extracto de proteína total de embriones de D. m. En la Figura 4 se muestran los resultados obtenidos con suero proveniente de la gallina GN; el suero preinmune de esta gallina, muestra una señal débil a los diferentes títulos (Panel A); sin embargo, esta señal se intensifica con las inmunizaciones, como se puede apreciar en la señal detectada con los sueros obtenidos a la tercera semana del inmunización (Panel B, título 1:5000), lo que indica que el péptido DS obtenido in vitro, promueve respuesta ante el antígeno.

Inmunodetección de la proteína H de D. m.: Para probar que efectivamente los anticuerpos detectan la proteína H en su dominio DS, contra la cual fueron dirigidos, el suero inmune de la gallina GN se utilizó en un Wester Blot, con la técnica antes descrita. H es una proteína producida en cantidades ínfimas y su pico más alto de expresión es durante la organogénesis. Si bien no se tienen reportes de la cuantificación de esta proteína, los intentos que se han realizado para detectarla en la mosca de la fruta mediante Western Blot han sido positivos, con la limitante de una baja intensidad de la señal en extractos de proteína total de embriones y larvas de esta especie (Maier, comunicación personal).

En la Figura 5 se muestra la inmunodetección de H con los anticuerpos generados en la gallina GN. Si bien la señal es muy tenue, los anticuerpos revelan una banda con la migración relativa esperada a la proteína contra la cual se dirigieron. Maier et al⁽¹⁵⁾, dirigieron Ac contra dos regiones de H, usando como antígeno proteínas recombinantes; de los dos sueros obtenidos sólo uno logra reconocer H en extractos de proteína de embriones silvestres. El otro suero identifica sólo las proteínas obtenidas de cultivos celulares donde H es sobrexpresado y regulado mediante promotores de choque térmico. La señal obtenida en los Western Blot, del trabajo antes mencionado, donde se usa antígeno de embriones silvestres está bien definida para las dos isoformas de H. En este trabajo los anticuerpos se obtuvieron inmunizando animales con el dominio DS de H de D. m. y los extractos de proteína usados para los Dot Blot y Western Blot se obtuvieron de embriones silvestres con niveles normales de expresión de proteína.

Si bien, y a pesar de que la señal es muy débil, los anticuerpos obtenidos en este trabajo logran identificar una sola proteína de aproximadamente 120 kDa, la cual presumimos se trata de la isoforma más pequeña de H; entre las múltiples bandas de proteínas que se visualizan mediante el análisis SDS-Page realizado al extracto proteico total obtenido de embriones de D. m. , demostramos que utilizando las comparaciones entre proteínas homólogas e instrumentos informáticos se pueden identificar y generar péptidos con alto potencial inmunogénico, para utilizarlos como antígenos en la generación de anticuerpos policlonales, que son utilizados en la investigación por su alta afinidad para reconocer moléculas, aún con pocas diferencias entre ellas.

Estos anticuerpos policlonales nos dan la capacidad de reconocer un dominio altamente conservado entre los homólogos conocidos de H y considerando que DS sirve como dominio de unión a una proteína esencial para al funcionamiento de N en invertebrados, proteína que cuenta con un homólogo en metazoarios, se espera que los anticuerpos generados en el presente trabajo puedan reconocer también una proteína con funciones similares a H en células de animales superiores, quedando abierta la posibilidad de que se confirme que las proteínas SHARP/MINT/SPEN sean reconocidas por los anticuerpos aquí reportados.

Un conocimiento detallado de los elementos de regulación, tanto positiva como negativa, de las vías de transducción de señales, es indispensable para implementar estrategias que mejoren la manipulación y supervivencia de embriones de mamíferos in vitro y se logre una mayor penetración de las técnicas moleculares en la producción pecuaria, donde es indispensable incrementar el porcentaje de partos exitosos a partir de embriones generados ya sea por fertilización in vitro, partenogenéticos, y manipulados genéticamente implantados en madres sustitutas, con la finalidad de producir animales de interés humano que aporten mayor calidad nutrimental o sirvan de bioreactores para producir biomoléculas de interés farmacéutico o industrial.

 

AGRADECIMIENTOS

A CONACYT por el financiamiento otorgado para la realización del presente trabajo mediante el proyecto 25922 CB-2005-01-49402 y por la beca de Maestría otorgada a H. Contreras-Cornejo; A PROMEP por el financiamiento otorgado mediante el proyecto PTC-49.

 

LITERATURA CITADA

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NOTA

* Apoyos para la realización del proyecto: CONACYT proyecto 25922 CB-2005-01-49402, PROMEP proyecto PTC-49.