Notas de investigación

 

Cultivo in vitro de Anaplasma marginale en líneas celulares endoteliales

 

In vitro culture of Anaplasma marginale in endothelial cell lines

 

G. Sarahí Luna–Castro^a, Sergio D. Rodríguez–Camarillo^a, Patricia Ramírez–Noguera^b, J. Francisco Preciado de la Torre^a, Edmundo E. Rojas–Ramírez^a, Juan J. Mosqueda–Gualito^c, Miguel A. García–Ortíz^a, Carlos A. Vega y Murguía^a

 

^a Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria, INIFAP. Carretera Federal Cuernavaca–Cuautla No. 8534 Colonia Progreso, 62500 Jiutepec, Morelos. vega.carlos@inifap.gob.mx. Correspondencia al último autor.

^b Facultad de Estudios Superiores – Cuautitlán, UNAM.

^c Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro.

 

Recibido el 29 de junio de 2009
Aceptado para su publicación el 28 de junio de 2010

 

RESUMEN

Anaplasma marginale, bacteria intracelular obligada, es el agente causal de la anaplasmosis bovina, caracterizada por anemia progresiva, fiebre, pérdida de peso y ocasionalmente, la muerte. Como alternativa para el desarrollo de nuevas estrategias de prevención se plantea el uso de cultivos celulares para la obtención in vitro de A. marginale. El propósito de este estudio fue ensayar su cultivo in vitro en células nucleadas empleando estirpes de células endoteliales de bovino y de mono, mismas que fueron expuestas a eritrocitos infectados con A. marginale. Para demostrar la invasión de las células endoteliales se emplearon diferentes opciones: tinciones, detección genómica o inmunofluorescencia, con resultados negativos; adicionalmente, tampoco se apreciaron efectos citopatológicos. Sin embargo, cuando se aplicó la metodología de co–cultivo en presencia de las células endoteliales, A. marginale se detectó durante más tiempo que en cultivos con eritrocitos únicamente. Con el supuesto de evidenciar la presencia de la infección, mediante la valoración de las constantes fisiológicas y anticuerpos específicos contra la bacteria, se inocularon bovinos susceptibles con el material biológico de los cultivos. Aún cuando no hubieron signos clínicos de anaplasmosis, en el bovino inoculado con la línea de córnea co–cultivada con eritrocitos infectados, se detectaron anticuerpos específicos contra A. marginale; sin embargo, no se logra dilucidar en este estudio la participación de las células endoteliales.

Palabras clave: Anaplasma marginale, Cultivo, Células endoteliales.

 

ABSTRACT

Anaplasma marginale, intracellular bacteria causes bovine anaplasmosis, characterized by progressive anemia, fever, decrease in body weight and death occasionally. The use of A. marginale in vitro cell culture – derived has been suggested as an alternative for development new prevention tools and control strategies. The purpose of this study was to establish the in vitro culture procedure in bovine corneal or umbilical cord and monkey retina endothelial cell lines. These were subsequently exposed to A. marginale infected erythrocytes. Different staining methodologies, immunofluorescent antibody assays or genome detection tests were used in an attempt to demonstrate the invasion of nucleated cells. In all cases, only negative results were obtained and no cytopathic effects observed; when the co–cultivation methodology was applied, it was blunt the fact that if endothelial cells are present, A. marginale can be preserved longer periods than cultivating infected erythrocytes alone. Susceptible cattle were inoculated with culture–derived biological material, and samples taken to monitor physiological variables, rickettsemia and immune response against the bacteria. Animals did not show clinical signs of anaplasmosis. Even though a calf inoculated with the cornea cell line co–cultivated with infected erythrocytes, showed antibody against A. marginale; endothelial cell lines involvement in Anaplasma marginale infection could not be clearly demonstrated in this study.

Key words: Anaplasma marginale, Culture, Endothelial cells.

 

Anaplasma marginale, es una bacteria Gram– negativa redondeada u oval de 0.3 a 0.8 mm diámetro⁽¹⁾ que pertenece al orden Rickettsiales⁽²⁾, familia Anaplasmataceae, género Anaplasma⁽³⁾ y es causante de la Anaplasmosis bovina. Identificada por primera vez en 1893 por Smith y Kilborne⁽⁴⁾, la enfermedad fue descrita en 1910 por Theiler⁽⁵⁾, diferenciándola de la babesiosis bovina⁽⁶⁾. Desde entonces, las tentativas para reproducirlo in vitro, han sido numerosas⁽⁷⁾. Intentos realizados en México^(8,9), arrojaron datos acerca de los requerimientos de las cepas mexicanas. La metodología hasta el momento descrita como exitosa, involucra el establecimiento de una línea celular de garrapata del género Ixodes⁽¹⁰⁾, el cultivo de A. marginale en esta línea celular y entonces, la transferencia de las bacterias cultivadas a líneas celulares endoteliales de origen bovino y de primate⁽¹¹⁾. Por lo que el propósito de este trabajo fue ensayar la propagación de la rickettsia Anaplasma marginale, en condiciones de laboratorio, directamente en células endoteliales a partir de eritrocitos de bovino infectados.

Para la reproducción de la rickettsia se utilizaron hasta diez bovinos criollos (Bos taurus) entre 12 a 18 meses de edad, provenientes de zona libre de garrapatas en Chihuahua, negativos a tuberculosis y brucelosis bovinas, según las normas de las campañas oficiales^(12,13) e igualmente, negativos para A. marginale utilizando la prueba de ELISA⁽¹⁴⁾. Estos se transportaron al CENID PaVet, en Jiutepec, Morelos y mantenidos en estabulación con alimento, heno y concentrado y agua ad libitum.

Se utilizaron cinco cepas de A. marginale aisladas de casos clínicos en diferentes estados de México (Cuadro 1), algunas de ellas parcialmente caracterizadas con relación a su virulencia o particularidades de su genoma^{(15,16,17,18)}. Las cepas se mantuvieron en congelación a –196 °C y para reactivarlas se inocularon en los bovinos previamente esplenectomizados. Para estimar el porcentaje de eritrocitos infectados (Ei), a partir de una muestra se prepararon dos frotis teñidos con colorante de giemsa⁽¹⁹⁾, observándose al microscopio con objetivo de inmersión 100X, tomando el valor promedio de ambos. Cuando los valores de infección fueron mayores al 10 %, asépticamente se tomó sangre infectada mediante punción en la vena yugular, empleando un matraz Kitasato con perlas de vidrio previamente esterilizado, agitándole mediante rotación para evitar la coagulación. La sangre obtenida se lavó con solución VYM estéril⁽²⁰⁾, cada lavado consistió en centrifugar a 1,500 xg por 15 min a 4 °C, decantando el sobrenadante y resuspendiendo al 50 % (v/v) en VYM, eliminando la capa flogística. Los inóculos consistieron en eritrocitos infectados suspendidos al 50 % en VYM (v/v) o en su caso, cuerpos iniciales (Ci) que corresponden a los cuerpos de inclusión de A. marginale liberados para facilitar la invasión de las células huésped, obtenidos mediante la aplicación de protocolos de lisis, purificados con gradiente de Percoll®, en presencia o ausencia de fluoruro de fenil–metil–sulfonilo (PMSF), como inhibidor de proteasas⁽²¹⁾.

Las estirpes celulares adquiridas comercialmente fueron, RF/6A (ATCC No. CRL–1780) de retina de mono Rhesus (Macaca mulatta) y BCE C/D–1b (ATCC No. CRL–2048) de córnea de bovino. Además se empleó una estirpe transformada de cordón umbilical de bovino denominada BUVEC E₆E₇ (Donada por la Dra. Carmen Clapp, Instituto de Neurobiología–UNAM)⁽²²⁾. Todas se mantuvieron en criopreservación a –196 °C en nitrógeno líquido, hasta su uso. Para la línea RF/6A se utilizó el medio mínimo esencial (MEM), para BCE/D–1b se empleó el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DEMy para BUVEC E₆E₇ el medio F–12 HAM modificado (todos de Sigma–Aldrich, St. Louis, Mo. EE.UU). Los medios, adquiridos comercialmente fueron suplementados con suero bovino fetal, mezcla de penicilina+estreptomicina (100 UI+125 /ig/ml) y anfotericina B (0.25 ml) (GIBCO, EEUU. No. Cat. 15290–018). Todos los cultivos se realizaron en condiciones estrictas de esterilidad, por duplicado. La cantidad de medio de cultivo fue de 2 /il/mm² de superficie. La densidad de siembra fue de 1.0 ó 1.2 x 10³ células/ mm² para pozos de 16 mm de diámetro o matraces de 25 cm², respectivamente. El cambio de medio se realizó cada 48 h y el subcultivo con seis días de intervalo.

Para la detección del microorganismo, adicionalmente a la tradicional tinción de giemsa, como alternativa de confirmación, se aplicó indistintamente una o más de las metodologías que se describen a continuación.

PCR: Para la extracción del ADN de Ei se empleó el paquete comercial Ultra Clean DNA BloodSpin. En el caso de las células nucleadas se utilizó la técnica "Hot Shot"⁽²³⁾ y para la técnica de PCR se empleó el paquete comercial Master Mix siguiendo el protocolo "Nested–PCR", descrito por Torioni de Echaide, utilizando fragmentos del gen conservado msp5 como iniciadores⁽²⁴⁾:

Los geles de agarosa se prepararon al 1 % (p/v) y se observaron en un transiluminador⁽²⁵⁾ de luz UV de 200–300 nm (Ultra–Lum, Modelo UVA–40).

Como antígeno control para inmunofluorescencia, se prepararon laminillas a partir de sangre infectada, conservándose a –70 °C hasta su uso. La preparación de las células nucleadas consistió en su fijación con metanol–acetona y lavados con Nonidet 40® al 0.5% (v/v) en solución salina fisiológica (NaCl 0.7% p/v) en agua destilada estéril⁽²⁶⁾. El Conjugado se elaboró a partir del suero hiperinmune contra A. marginale, obtenido de un bovino inoculado con Ci de la cepa Aguascalientes y refuerzos más adelante con Ei de la cepa Morelos; los niveles de anticuerpos medidos periódicamente con la técnica de ELISA⁽¹⁴⁾, determinaron el momento óptimo para la colecta del suero. Las inmunoglobulinas se purificaron, concentraron y conjugaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC), según lo publicado⁽²⁷⁾. Para la inmuno detección directa, el ensayo se realizó de acuerdo a lo publicado previamente y las muestras se observaron en un microscopio de epifluorescencia⁽²⁸⁾. En lo relativo a la inmuno detección indirecta, se empleó la metodología anteriormente publicada^(29,30); en el primer paso se utilizaron anticuerpos monoclonales anti– msp1 o msp2, (VMRD Laboratories, Pullman, Washington, EE.UU.) incubándose a 37 °C por 30 min, y después de un enjuague, se agregó el segundo anticuerpo (Alexa Fluor 488; Invitrogene, EE.UU.), incubando, enjuagando y dejándose secar nuevamente, para su posterior observación.

La tinción de contraste supravital consistió en la incubación a 37 °C durante 30 min de suspensiones de Ei o células nucleadas, con 50 µl de una solución compuesta de 10 µM de Di acetato de carboxi–fluoresceína (CFDA) en solución salina amortiguadora de fosfatos (SSAF) pH 7.2 ó 10 µM de acetato de carboxi–metil–rodamina (CMRA) en SSAF; concluida la incubación, se adicionaron 500 µl de VYM y se enjuagó vigorosamente, incubando nuevamente a 37 °C por 30 min; finalmente se retiró el VYM enjuagando el sustrato durante dos ocasiones⁽⁹⁾. La incorporación de colorante se observa bajo el microscopio de fluorescencia al distinguir según el color, verde para CFDA o rojo para CMRA.

Ensayo 1. Cuando las líneas celulares BCE, BUVEC y RF/6A presentaron al menos 90 % de confluencia en cultivo, se inocularon por duplicado con la cepa Morelos de A. marginale, obtenida de un bovino esplenectomizado. Se prepararon seis tipos inóculo, cada uno a partir de una dosis infectante de 1x10⁹ cuerpos de inclusión. Los inóculos consistieron en: Ei intactos, Ei sometidos a choque térmico, Ei sonicados, Ei tratados con saponina y Ci extraídos con o sin PMSF como inhibidor de proteasas que los degradaran. Después de la inoculación los cultivos se mantuvieron con cambio de medio cada 48 h y subcultivo cada 6 u 8 días, evaluándose su morfología y rendimiento celular expresado en número de células. El remanente celular entre cada subcultivo se almacenó a 4 °C ó –20 °C.

Ensayo 2. La línea BUVEC fue inoculada con la cepa Yucatán obtenida de un bovino esplenectomizado. Se emplearon los tipos de inóculo descritos en el ensayo 1, con la misma dosis infectante. El cambio de medio se realizó a intervalos de tres o cuatro días y los subcultivos, semanalmente. Se evaluó morfología y rendimiento celular expresado en número de células. A diferencia del ensayo anterior, después de cada subcultivo se sembraron 2x10⁵ células en placas de 24 pozos, con un cubreobjetos en el fondo. Estos se extrajeron 24 h más tarde, para su tinción con CMRA, giemsa, wright⁽³¹⁾ y naranja de acridina⁽³²⁾. Se extrajo el ADN celular y se caracterizaron mediante PCR para el gen específico msp5⁽²⁴⁾. El remanente celular de cada subcultivo se criopreservó con sulfóxido de diMetilo (DMSO) al 8 % (v/v).

Ensayo 3. La línea BCE fue previamente inoculada con 4.1x10⁶ de Ei con la cepa Yucatán, procedente de un bovino esplenectomizado. Las células nucleadas se incubaron con 50 μl de solución CFDA 10 μM, al momento de la siembra, paralelamente, 25  μl de Ei al 50 % en VYM fueron incubados con 50 μl de solución CMRA 10 μM. 24 h después se co–cultivaron, el cambio de medio se hizo cada 48 h, hasta las 144 h. Se tomaron muestras del co–cultivo a las 24, 72 y 144 h y se observaron con diferentes filtros en el microscopio de epifluorescencia, con rangos de emisión de 490 ó 548 nm y excitación de 520 ó 576, para CFDA o CMRA, respectivamente.

Ensayo 4. La metodología de co–cultivo fue similar a la empleada por Waghela y colaboradores⁽³³⁾, con algunas modificaciones. La finalidad de este estudio fue sembrar con Ei intactos, las líneas celulares endoteliales no expuestas, adicionando periódicamente eritrocitos no infectados. Las líneas BUVEC y BCE fueron utilizadas en co–cultivo con las cepas Morelos y Yucatán (primera variante) y con el aislado Tamaulipas (Soto la Marina) y la cepa Yucatán (segunda variante). Estos inóculos se obtuvieron de bovinos esplenectomizados. La siembra se hizo por duplicado en placas de 24 pozos. Cada placa se dividió en tres grupos: testigo, con Ei y con eritrocitos no infectados. En la primera variante, después de la inoculación de los monoestratos celulares con 1.25 ml de Ei, el cambio de medio se realizó sustrayendo y reconstituyendo 1.0 ml del medio de cultivo cada 24 h. El subcultivo, se hizo semanalmente y 24 h después se adicionaron 25 μl de eritrocitos no infectados al 50 % en VYM, a todos los pozos exceptuando el grupo testigo. Antes de cada cambio de medio se realizó un conteo de la proporción de eritrocitos infectados, mediante frotis teñidos con giemsa. Para la segunda variante, se colocó un cubreobjetos en el fondo de los pozos de las placas, la inoculación y cambio de medio fue a los mismos intervalos que en la primera variante. Semanalmente se llevaron a cabo los pases, retirando el material suspendido en el medio de cultivo y agregándolo a un nuevo pozo con un monoestrato de células endoteliales previamente sembradas y sin infectar. Se realizó el conteo de rickettsemia con frotis teñidos antes de cada cambio de medio, los cubreobjetos del fondo de los pozos se tiñeron con giemsa o se prepararon para inmunofluorescencia.

Ensayo 5. Se hizo una inoculación con BUVEC expuesta a A. marginale in vitro, a partir de material criopreservado en el segundo experimento, del que se obtuvo el inóculo conformado por células expuestas a Ci extraídos con inhibidores de proteasas y su respectivo control negativo. Se inocularon dos bovinos con 2x10⁵ células cada uno vía intramuscular (IM). A partir del día de la inoculación los bovinos se monitorearon dos veces por semana, durante 60 días, valorando título de anticuerpos y constantes fisiológicas. Otro bovino se inoculó con BCE expuesta a A. marginale in vitro obtenido a partir de cultivos de células BCE expuestas a Ei con la cepa Morelos y su control negativo; 1x10⁹ células de cada uno de estos, fueron administrados IM; a partir del día de la inoculación el monitoreo de los bovinos se desarrolló como ya se mencionó.

Los resultados de la inoculación de cultivos de células nucleadas con la cepa Morelos, indican un cambio gradual en las formas celulares, principalmente en las células expuestas al inóculo conformado por Ei intactos; estos cambios fueron más radicales conforme se incrementaba el número de pases, se inició en el pase cero y se realizaron al menos cuatro pases, dependiendo de la estirpe celular. Estos cambios consistieron en formas ahusadas pronunciadamente con incremento en el número de gránulos o partículas intracitoplasmáticas, características más evidentes en las líneas RF/6A y BCE. En el resto de los inóculos se mantuvieron las características morfológicas sin cambios aparentes, a lo largo del ensayo. Todos los cultivos inoculados con los Ei sometidos a choque térmico presentaron contaminación bacteriana, razón por la cual se desecharon, al igual que la mayoría de los cultivos de BCE, después del tercer pase. En tanto, las células no expuestas a A. marginale con más de 90 % de confluencia mostraron formas típicas de "mosaico" en las líneas RF/6A y BCE. En cuanto a los rendimientos celulares, en RF/6A se presentó una disminución drástica, conforme el número de pase, en los cultivos expuestos a Ei sonicados, tratados con saponina y Ci con y sin inhibidores de proteasas, siendo constante el rendimiento de las células cultivadas con Ei intactos. En BUVEC se apreciaron diferencias mínimas en forma, tamaño y número de células, entre pases e inóculos, lo mismo ocurrió con BCE y RF/6A. En la Figura 1 se ejemplifica la fluctuación en el crecimiento de estas líneas celulares expuestas a Ci extraídos con o sin PMSF como inhibidor de proteasas.

En el segundo ensayo, los resultados observados señalan que no se encontraron diferencias morfológicas provocadas por los inóculos, ya que a lo largo del experimento BUVEC mantuvo sus formas ahusadas, independientemente del tipo de inóculo y número de pase. La adhesión celular no se vio afectada y el número de gránulos intracitoplasmáticos no variaron. En el rendimiento celular las diferencias no fueron mayores a un logaritmo. Con la tinción de giemsa se pudo distinguir entre citoplasma y núcleo y comparando el grupo testigo contra cada uno de los inóculos, no hubo indicios de A. marginale a través de cada pase; con el colorante de NA se observaron las membranas citoplasmática y nuclear bien definidas, se tiñeron indistintamente citoplasma y núcleo celular, por ello, fue de nula utilidad para distinguir el ADN de la rickettsia, de aquél de la célula huésped nucleada. Este resultado también se obtuvo con la tinción de CMRA. Finalmente, con el colorante de wright el núcleo y citoplasma se tiñeron del mismo color. A partir del ADN extraído de las células endoteliales expuestas a A. marginale, se realizó el protocolo de PCR, sin embargo, se consideró negativo al no obtenerse la amplificación del gen específico msp5 utilizado.

Los resultados del tercer ensayo orientado a observar el contraste entre la línea celular BCE y la cepa Yucatán de A. marginale con la tinción supravital, en la primera lectura a las 24 h, se pudieron apreciar las formas celulares bien definidas, los eritrocitos contenían al A. marginale en su interior. Al sobreponer los filtros del microscopio, para CFDA y CMRA, los Ei aparentemente se encontraban en contacto cercano con las células endoteliales. Este mismo patrón se observó en la segunda la lectura, a las 72 h, sin embargo, la intensidad de los colorantes disminuyó drásticamente dificultando la visualización. La última lectura, a las 144 h ambos colorantes mostraban menor intensidad, principalmente CMRA (Figura 2).

En el cuarto ensayo, los resultados en la primera variante de co–cultivo, permitieron observar Ci como resultado de la infección por A. marginale durante 91 días en los eritrocitos con BCE y 87 días con BUVEC. La dinámica de la rickettsemia de ambas líneas celulares mostró patrones diferentes, la línea de córnea se mantuvo, a partir del día 5 del cultivo, con rickettsemia del 0.13 % hasta 1.1 %. En tanto, la línea de cordón umbilical mostró fluctuaciones entre los días 8 y 10 con porcentajes de 1.14 y 4.25 respectivamente; entre los días 16 y 17 con porcentajes de 0.74 y 3.41; al día 18 los cultivos aparecieron negativos y al día 26 el porcentaje de rickettsemia observado fue del 4.39 (Figura 3). Los resultados de la segunda variante nos permitieron observar A. marginale en los eritrocitos durante 145 días en el co–cultivo con BCE y 149 días con BUVEC, el porcentaje máximo después de iniciado el cultivo fue de 17.96 con BCE y en BUVEC de 2.5 %, lo que representa una diferencia del 15.19 % (Figuras 4,5). Al inicio del cultivo A. marginale presentaba la típica forma de los Ci y con el paso de los meses fue disminuyendo hasta pequeñas subunidades o cuerpos marginales, algunos Ci se observaron antes del incremento en el porcentaje de rickettsemia. En ciertas células de la línea BCE, teñidas con el colorante de giemsa se apreciaron en la periferia del núcleo celular principal partículas teñidas con características similares a los ácidos nucleicos, a la periferia de los núcleos celulares, este hallazgo estuvo ausente en BUVEC (Figura 6). Las características morfológicas de ambas líneas permanecieron sin alteraciones durante todo el experimento. La técnica de inmunoflourescencia confirmó la presencia de A. marginale en los Ei, en cambio, con la técnica directa aplicada a las células nucleadas no pudo distinguirse a la bacteria pues toda la silueta celular se apreció con FITC y con la técnica indirecta no se detectó a la bacteria (Figura 7).

Los resultados de la inoculación del bovino con BUVEC expuesta a A. marginale in vitro no arrojaron alteraciones sugestivas en alguna de las constantes fisiológicas medidas, tampoco hubo signos de anaplasmosis, ni variaciones en la respuesta de anticuerpos. En el caso del bovino inoculado con BCE expuesta in vitro con A. marginale, tampoco se presentaron alteraciones en las constantes fisiológicas, ni signos de anaplasmosis, pero en un animal hubo una momentánea respuesta de anticuerpos específicos contra la rickettsia a los días 31 y 35 post–inoculación, retornando a negativos al día 38.

La idea de usar diversas presentaciones de A. marginale, con el propósito de evaluar qué condiciones permitirían la invasión de la célula huésped y en dado caso, la proliferación de la bacteria en su célula hospedera, pretendía identificar aquéllas que más le favorecieran. Se intentó buscar a este microorganismo mediante la observación de su morfología o por los probables cambios citopatológicos en el hospedero. En la línea celular de retina de mono (RF/6A), las observaciones microscópicas mostraron marcadas diferencias morfológicas, evidentes entre el inóculo de Ei intactos respecto al resto. Estas mismas diferencias coincidieron con las distancias numéricas apreciadas, determinadas con los conteos celulares, durante la duración del experimento a través de cada subcultivo. Cuando se empleó esta estrategia con la línea celular de cordón umbilical igualmente se buscó a la bacteria mediante los cambios en la morfología, combinando la microscopía óptica con técnicas de tinción mencionadas por otros autores. También se intentó comprobar la presencia de A. marginale por la amplificación del gen msp5 característico de la bacteria, mediante PCR⁽³⁴⁾ y por análisis microscópico en células posiblemente infectadas utilizando la tinción de giemsa⁽³⁵⁾. En ambos casos los resultados no fueron exitosos aunque existen reportes en los que ha sido posible observarla en las inmediaciones de las membranas nucleares o citoplasmáticas⁽³⁶⁾, en el presente estudio no se observaron en las células nucleadas.

Los resultados óptimos de contraste con las tinciones supravitales se obtuvieron con la primera lectura, pues permitían diferenciar las estructuras celulares y a los Ei, aunque no pudo ubicarse A. marginale dentro de la célula nucleada, ya que no se realizaron apreciaciones sagitales o transversales.

Ante este panorama poco satisfactorio, se implementó otra metodología donde se co–cultivan dos poblaciones celulares, una célula hospedera típica y otra atípica. El resultado más halagüeño fue el obtenido con la metodología de co–cultivo, ya que se logró el mantenimiento de la bacteria en los eritrocitos por más de 84 días, superior a lo descrito en estudios anteriores⁽³⁵⁾. Respecto al trabajo de co–cultivo informado por Waghela⁽³³⁾, en el presente estudio se emplearon diferentes líneas celulares, medios y manejo de los cultivos; se rebasó el número de días en cultivo, hasta los 149 días, periodo mayor al máximo de 112 días (16 semanas) y uno de los animales experimentales presentó respuesta de inmunoglobulinas G totales específicas contra A. marginale; sin embargo, la presencia de la bacteria en las células nucleadas no fue contundente, sólo se apreciaron inclusiones a la periferia del núcleo celular, situación similar a la comunicada por Blouin et al⁽³⁷⁾ quienes utilizaron como soporte células turbinadas y de aorta de bovino, inoculadas con A. marginale proveniente de células de glándula salival de garrapata; ese material biológico cultivado fue administrado a bovinos susceptibles, que tampoco desarrollaron signos clínicos de anaplasmosis o produjeron inmunoglobulinas específicas en respuesta al estímulo de la presencia del antígeno. En este estudio, el hallazgo de las inclusiones se apreció sólo en la estirpe celular de córnea, sin embargo, éstas no llegaron a carácter de colonia, formación mencionada por Munderloh et al⁽¹¹⁾ cuando se cultivó con la misma estirpe, probablemente porque en dicho estudio el inóculo de A. marginale provenía de un cultivo en células de garrapata Ixodes scapularis, previamente establecido. En cuanto a la viabilidad de A. marginale en eritrocitos, empleando un modelo de extinción por diluciones, en el que diariamente se reemplazó gran parte del volumen del medio de cultivo y tomando en cuenta la adición de eritrocitos normales, observamos que los eritrocitos infectados inoculados originalmente (día cero), debieron haber desaparecido para el día 13 del cultivo; por lo que en teoría, tomando en cuenta el factor de dilución y su número, los Ei apreciados a partir del día 14 posiblemente no corresponden a los inoculados al día cero del cultivo. Otro aspecto a considerar es que antes de los incrementos en la rickettsemia, con los frotis tomados del fondo de los pozos, se evidenciaron los cuerpos inclusión, mientras que durante la curva de disminución estas formas estuvieron ausentes. Las gráficas de la rickettsemia de los ensayos de co–cultivo presentaron ciclos de aumento y descenso, indicando que el microorganismo se encontraba viable conservando su capacidad invasiva, independientemente de la cepa o aislado y tipo de línea celular. Con la aplicación de las diversas metodologías diseñadas para la detección de A. marginale inicialmente se pretendió distinguir a la rickettsia en un entorno diferente de su célula huésped y eventualmente esclarecer el papel de la célula endotelial en el desarrollo de la bacteria, si es que interviene, como se ha planteado por otros autores⁽³⁰⁾. En definitiva, la célula endotelial contribuyó favorablemente en el ciclo vital de A. marginale.

La técnica de IF indirecta aplicada a las células endoteliales co–cultivadas con eritrocitos infectados arrojó resultados insatisfactorios, los anticuerpos monoclonales no reconocieron a las proteínas de superficie de A. marginale, posiblemente porque durante el cultivo hubo cambios de conformación en algunas de ellas que interactuaban con los eritrocitos y las células nucleadas. De hecho existen evidencias que muestran que presentan alteraciones en las características infectivas de esta rickettsia⁽³⁷⁾. Pese a que se logra la demostración de la bacteria en las células hospederas al momento de inocularse en bovinos susceptibles, no se presenta anaplasmosis clínica o diferencias en la respuesta de anticuerpos específicos⁽³⁸⁾, cuando se comparan con los testigos inoculados con células no expuestas a la rickettsia. Otros estudios han demostrado que 10 μl de sangre infectada podrían ser suficientes para infectar a un animal adulto susceptible e inclusive causarle la muerte⁽³⁹⁾ y que no ocurrió en este trabajo.

La pérdida, modificación o ausencia en los cultivos celulares de algunas propiedades bacterianas determinantes en el proceso de infección in vivo, ponen en riesgo la capacidad infectiva de A. marginale hacia bovinos susceptibles. Las interacciones célula–célula durante un proceso infectivo son muy importantes. Estas regulan diversas vías de señalización importantes in vitro e in vivo. La adaptación in vitro de A. marginale en cada uno de los modelos experimentales en este trabajo pudieron generar en las formas infectivas de la bacteria; cambios moleculares de membrana, modificándose la señalización proteína–proteína entre los microorganismos y células huésped.

Cabe recordar que no fue posible encontrar la expresión evidente del gen msp5 por PCR. Los cambios adaptativos se han explicado, en el caso de microorganismos parásitos intracelulares, como un proceso de evolución reductora^(40,41), quizá por esta razón no existen patrones uniformes ni protocolos estándar para el cultivo de esta rickettsia, comparando con los sistemas de cultivo de otros hemoparásitos^(20,42).

Los primeros estudios de cultivo in vitro se realizaron en estirpes celulares nucleadas, por ejemplo, en médula ósea, riñon o nódulos linfáticos, sin resultados satisfactorios. Por otro lado, ha sido demostrado el desarrollo de A. marginale en intestino y glándula salival de garrapatas, por ejemplo, del género Dermacentor^(43,44) e Ixodes⁽⁴⁵⁾. Los informes exitosos del cultivo in vitro de A. marginale involucran formas cultivadas obtenidas en células de garrapata. Las células infectadas son re–cultivadas en un soporte biológico de células endoteliales. Esa metodología, pretende simular lo que sucedería en la naturaleza: la rickettsia proveniente de un animal infectado se desarrolla en la garrapata y luego infecta al momento de alimentarse en otro animal. Es importante continuar con el estudio de la relación in vitro entre el eritrocito, células de garrapata y células endoteliales durante el establecimiento y preservación de A. marginale en cultivos viables. De esta forma y considerando en ciclo de infección característico de la rickettsias, se podrán mantener microorganismos con capacidad infectiva hacia bovinos susceptibles. Fue contundente el hecho de que A. marginale se preservó más tiempo en presencia de las células endoteliales, que únicamente con eritrocitos. Sin embargo, el cultivo in vitro de eritrocitos infectados con A. marginale únicamente con células endoteliales, no proporciona evidencia de la división de esta rickettsia en este huésped atípico. En conclusión, el cultivo in vitro de Anaplasma marginale debe replantearse empleando condiciones experimentales diferentes a las de este estudio, como podría ser el uso de inóculos con orígenes diversos a los utilizados. El cultivo bien podría iniciarse a partir de líneas celulares que hayan demostrado ser permisibles para el crecimiento de la rickettsia, como las de origen embrionario de garrapata y entonces, explorar la posibilidad de crecimiento en otras líneas celulares.

 

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Carmen Clapp del Instituto de Neurobiología de la Universidad Nacional Autónoma de México por la donación de la línea celular endotelial BUVEC E₆E₇.

Estudios parcialmente financiados por Proyecto CONACyT– SAGARPA 2004–C01–71 y Proyecto CONACyT N° 66872. Igualmente se agradece al CONACYT por la beca otorgada a G. Sarahí Luna–Castro para realizar sus estudios de Maestría.

 

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