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Introducción
En la industria del queso, de 100 L de leche procesada se obtienen entre 85 y 90 L de suero con retención hasta de 55% de los nutrientes de la leche (Utama et al., 2017; Montalvo-Salinas et al., 2018). A nivel mundial se generan al año entre 180-190 millones de toneladas de lactosuero (Guerrero-Rodríguez et al., 2012; Mieles-Cedeño et al., 2018). En México, se generan más de 2.4 millones de toneladas anuales de suero, pero sólo 50% es procesado (Mazorra-Manzano y Moreno-Hernández, 2019), el resto se desecha a los cuerpos de agua o en el suelo y ocasionan un grave daño ambiental (Dainka et al., 2019).
González (2012) reporta una demanda biológica oxígeno (DBO) de 40 g L-1 y una química (DQO) de 60 g L-1 con un índice de biodegradabilidad (DBO5/COD) entre 0.4 a 0.8 que rebasan los límites permitidos por la Norma Oficial Mexicana NOM-001-ECOL-1996, sobre los límites máximos permisibles de contaminantes en las descargas de aguas residuales para uso agrícola, que es de 0.2 g L-1 (DOF, 1997). Ramírez (2012) equipara la fuerza contaminante de 5 L de lactosuero a la de las aguas negras producidas en un día por una persona.
Para aprovechar la lactosa, proteínas y microelementos del lactosuero (Chandrapala et al., 2015; Andrade et al., 2017), se han realizado diversos estudios para aplicarlo en alimentación humana y animal, elaboración de bioplásticos y fertilizantes (Quille et al., 2021) y para riego agrícola (Araújo et al., 2017; Krause et al., 2017; Araújo et al., 2020). Donde predominan las queserías con baja tecnificación (Faría et al., 2002; Villegas-Soto et al., 2018), el uso de lactosuero dulce en aplicaciones agrícolas representa una buena opción.
Cuando el suero se vierte en el suelo agrícola afecta física y químicamente su estructura (Carvalho et al., 2013) y por tanto disminuye el rendimiento agrícola (Parra, 2009; Araújo et al., 2013). Sin embargo, en otros estudios se ha demostrado que mejora la agregación del suelo (Kelling, 1981) y su fertilidad (Robbins y Lehrsch, 1998; Jones et al., 1993).
Los bioensayos realizados en DBO y DQO se utilizan para estimar la toxicidad o impacto biológico potencial que tiene la exposición de los efluentes industriales en la función fisiológica de organismos vivos (Schultz et al., 2002). En estas pruebas se determinó la concentración que inhibe la germinación de 50% de los organismos expuestos, lo que se conoce como concentración letal media (CL50), así como la concentración a la que se produce un efecto subletal (CSL), caracterizado por el retraso de su crecimiento (Uc-Peraza y Delgado-Blas, 2012).
Además de las pruebas realizadas in vitro, Teacă y Bodĭrlău (2008) proponen bioensayos de fitotoxicidad en sistemas hidropónicos. Por tanto, el objetivo fue evaluar la toxicidad de diferentes concentraciones de lactosuero en el riego de alfalfa (Medicago sativa L.) y maíz. (Zea mays L.) en las etapas de germinación y desarrollo de plántulas.
Materiales y métodos
Los experimentos se realizaron en el Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana del Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas (CICM) de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (ICUAP-BUAP). Preparación y análisis del lactosuero. Se obtuvo suero dulce de la elaboración de queso fresco en la quesería ‘Lácteos Galeazzi’ en Chipilo Puebla, el cual se caracteriza por su baja acidez, pH neutro y ausencia de sales. Inmediatamente se refrigeró a 4 °C en frascos Schott de 1 L hasta su uso. Para caracterizarlo se midió por triplicado su pH con un potenciómetro Hanna 2010 y su acidez por titulación expresada en grados Dornic (°D) (AOAC, 1995).
Material biológico
Se utilizaron semillas de productores locales sin esterilizar de alfalfa (Medicago sativa L.) y maíz (Zea mays L.) seleccionadas según su forma y tamaño, almacenadas en frascos ámbar herméticos a temperatura ambiente. Diseño experimental, tratamientos y variables. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar (DECA).
Se evaluaron seis concentraciones del lactosuero en un rango entre 0 y 100% para medir la variable CL50, (concentración del efluente que causa 50% de mortalidad de la población en cinco días) y seis concentraciones entre 0 y 20% para evaluar la CSL (disminución significativa del desarrollo de germinados y plántulas medida por biomasa total, longitud total y de hipocótilo) en cuatro bioensayos de toxicidad aguda y crónica (Eaton et al., 1995) con 3-10 repeticiones con dos especies vegetales en dos etapas fenológicas conforme se describe en el (Cuadro 1).
Cuadro 1 Diseño experimental.
| Variable | Tiempo (días) | Especie | Etapa fenológica | Nivel experimentación | Tratamientos (concentración % lactosuero) |
|---|---|---|---|---|---|
| CL50 | 5 | Alfalfa | Germinación semilla | in vitro * | 0, 20, 40, 60, 80 ,100 |
| CL50 | 5 | Maíz | Germinación semilla | in vitro * | 0, 20, 40, 60, 80 ,100 |
| CSL | 10 | Alfalfa | Desarrollo germinado | in vitro | 0, 4, 8, 12, 16, 20 |
| CSL | 10 | Maíz | Desarrollo germinado | in vitro | 0, 4, 8, 12, 16, 20 |
| CL50 | 60 | Alfalfa | Emergencia plántula | hidropónico** | 0, 20, 40, 60, 80 ,100 |
| CL50 | 20 | Maíz | Emergencia plántula | hidropónico | 0, 20, 40, 60, 80 ,100 |
| CSL | 60 | Alfalfa | Desarrollo plántula | hidropónico | 0, 4, 8, 12, 16, 20 |
| CSL | 20 | Maíz | Desarrollo plántula | hidropónico | 0, 4, 8, 12, 16, 20 |
*= en cajas Petri, obscuridad y temperatura controlada. **= en germinadores y tubos Falcon, vermiculita estéril y condiciones de temperatura-fotoperiodo controladas.
Descripción de experimentos
La determinación de la CL50 se hizo con el objetivo de determinar la concentración a la cual un residuo produce el 50% y más de la muerte de los organismos a los que se expone y que se considera como potencialmente tóxica. Para calcular la CL50 del lactosuero en semillas de alfalfa y maíz se prepararon cajas Petri con papel Whatman saturado con 5 ml de cada dilución. Se pusieron 10 semillas por caja y por dilución separándolas al máximo para permitir su desarrollo (tres cajas por dilución). Cada caja se selló con Parafilm®, se envolvieron en plástico negro y se incubaron a 20 ±2 °C durante 5 días (Wang, 1987; Navarro et al., 2006).
Se graficó el porcentaje de semillas germinadas contra la concentración del lactosuero y se obtuvo el valor que produjo la inhibición de la germinación en el 50% de la población por extrapolación, así por la ecuación obtenida de la regresión polinómica. Se consideraron como semillas muertas aquellas que no germinaron después de 20 días aún regadas con agua potable. El experimento se hizo tres veces, con lactosueros de diferente lote y fechas y se reportaron los resultados del experimento más ilustrativo.
El objetivo de determinar la concentración subletal (CSL) es conocer si un residuo, aunque no sea tóxico, afecta el crecimiento en etapas tempranas de un organismo. La CSL de lactosuero dulce se determinó a los 10 días en diluciones menores al 20%, en el cual se evaluó la disminución del desarrollo de germinados (longitud del hipocótilo, longitud y peso total), en las mismas condiciones del experimento anterior conforme al método descrito por Tiquia y Tam (2000). Para evaluar la CL50 del lactosuero dulce en plántulas de alfalfa y maíz se preparó un germinador de unicel con vermiculita estéril como sustrato con 10 semillas de alfalfa por pozo y después se asignaron cinco de ellos para cada tratamiento.
Paralelamente se prepararon tubos Falcon de 50 ml con 30 ml de vermiculita estéril y se sembró una semilla de maíz por tubo con 10 repeticiones por tratamiento. El material se puso en condiciones de incubación controlada (20 ±4 °C con fotoperiodo 12-12) en una cámara climática TE-4002 Tecnal Trae® y se regó con 5 ml de cada tratamiento durante 20 días para el caso de maíz con pipeta serológica y 60 días para la alfalfa con una jeringa hipodérmica. Se contabilizó el número de plántulas emergidas, se graficó el porcentaje de estas contra la concentración del lactosuero y se obtuvo el valor que inhibió la emergencia en 50% de la población por interpolación y mediante la ecuación obtenida por la regresión de la curva polinómica.
Para determinar la CSL del lactosuero dulce en plántulas de alfalfa y maíz se probaron diluciones menores al 20%. Se evaluó la disminución del desarrollo (biomasa expresada en peso seco, longitud total y longitud de la raíz con respecto al control de agua potable) conforme al método descrito por Tiquia y Tam (2000) a 20 días para maíz y 60 para alfalfa, se empezó el riego con los tratamientos una vez que emergieron las plántulas y se regaron en su base. Se consideró que había un efecto subletal significativo cuando la comparación de medias entre cada tratamiento contra el control resultó menor de manera estadísticamente significativa según la prueba t-Student (p< 0.05).
Para la determinación de la longitud de germinados y plántulas se utilizó un vernier electrónico digital LCD Metric® con capacidad máxima de 150 mm. Las determinaciones de biomasa se hicieron por gravimetría a peso constante; es decir, se comprobó que no había variación en la lectura por exposición sucesiva a secado en estufa de convección en una balanza analítica Ohaus Adventurer® con capacidad máxima de 420 g y resolución de 0.001 g. El secado se realizó en una estufa de convección Thermo Cientific® equipada con termómetro para ajustar la temperatura de secado.
Análisis estadístico. Para lograr que el coeficiente de variación se mantuviera por debajo de 30% se eliminó, cuando fue necesario, un par de datos (máximo y mínimo). Se utilizaron los paquetes estadísticos Excel y SAS v 9.4 (2004).
Resultados y discusión
Análisis fisicoquímico. Se encontraron dos tipos de lactosuero como subproducto de la elaboración de queso: dulce y salado. El primero, que proviene principalmente de la elaboración de queso fresco, presentó un pH cercano al neutro (6.8 ±0.3) y baja acidez (19 ±0.5 °Dornic) por no tener sales añadidas y con bajas concentraciones de cloruro de calcio. El segundo, que proviene de la elaboración de quesillo, requesón y queso ranchero, presentó un pH de 5.41 ±0.3 y acidez de 38 ±0.6 °Dornic. Estos resultados son similares a los reportados por Panesar et al. (2010) para el lactosuero dulce y por Guerrero-Rodríguez et al. (2012) para el ácido.
Es importante considerar que las características de los lactosueros varían dependiendo del tipo de queso que se procese, y que su uso agrícola dependerá principalmente de que esté libre de sal añadida. Por otra parte, el lactosuero, aunque tiene una acidez baja en el momento en que se genera, tiende a acidificarse rápidamente de manera natural por efecto del desarrollo de su flora microbiana: el ácido láctico generado en dicho proceso puede tener un efecto benéfico en procesos agrícolas como en la quelación y solubilización de fosfatos (Paredes-Mendoza y Espinosa-Victoria, 2010) pero será prioritario cuidar el desarrollo de microorganismos patógenos con procesos de fermentación controlada; por ejemplo, con la tecnología de microorganismos benéficos o eficientes (Morocho y Leiva, 2019).
CL50 en la germinación de semillas. En concentraciones de 0 a 40% de lactosuero, la germinación se mantiene casi al 100%; sin embargo, con una CL50-5, la germinación bajó hasta 53% en semillas de alfalfa (Figura 1) valor obtenido gráficamente por interpolación y que coincide al sustituir el valor y= 50 (50% de la población que no sobrevive) en la ecuación polinómica. La disminución de la germinación a partir de 40% de concentración de suero se debe a la alta concentración de NaCl que eleva la presión osmótica y causó un efecto fisiológico adverso.
Figura 1 Efecto tóxico de lactosuero dulce a diferentes concentraciones en la germinación de semillas de alfalfa a five días. Valores corregidos que se consideraron con un 83.5% de germinación del control.
Dantas et al. (2005) encontraron resultados similares en la germinación de semillas de alfalfa expuestas a estrés salino. Laynez-Garsaball et al. (2008) observaron una disminución de la germinación por efecto del aumento del potencial osmótico ejercido por el NaCl, mientras que Porta et al. (1999) demostraron que la inhibición total de la germinación en altas concentraciones de sal es debida a la acumulación de cloruro que disminuye la absorción de agua y afecta la tasa de germinación.
Por su parte Mahdavi y Sanavy (2007) reportan que los iones presentes en el suero de leche también pueden causar endurecimiento de las paredes celulares y afectar el crecimiento de la plántula. No se obtuvo la CL50 en maíz, debido a que en todos los tratamientos hubo contaminación por hongos filamentosos. Esto puede ser debido a la carga microbiana natural del maíz, la cual se ve favorecida con el aporte de nutrientes del lactosuero.
CSL en el desarrollo de germinados. El suero dulce presentó un efecto subletal a concentraciones mayores al 12% en el desarrollo de germinados de alfalfa a los 10 días de exposición, observándose diferencias significativas entre la longitud total de los germinados y de los hipocótilos en comparación al control de agua potable (p< 0.05) (Figura 2 a y b), aunque no se observaron efectos en la biomasa total (datos no presentados). En trabajos similares Navarro et al. (2006) reportan la inhibición en el crecimiento de hipocótilos de semillas de achicoria, lechuga y escarola expuestas a efluentes neutralizados de industrias citrícolas y vitivinícolas diluidos al 103.
Figura 2 Efecto subletal de lactosuero dulce en la longitud total (a) y longitud del hipocótilo; y (b) de germinados de alfalfa de 10 días. Letras diferentes entre columnas indican diferencia significativa (t-Student p< 0.05).
Si se compara este valor con el obtenido en el presente trabajo, en el cual se observó inhibición del desarrollo del hipocótilo a una concentración de 12% (101), entonces se puede afirmar que el lactosuero dulce tiene una toxicidad baja. Por otro lado, no se obtuvieron valores de CSL para maíz debido a que, al igual que en el experimento anterior, las semillas se contaminaron con hongos filamentosos en todos los tratamientos.
CL50 en la emergencia de plántulas. La concentración letal de suero dulce en plántulas de maíz se obtuvo a una concentración de 40% y de forma similar en plántulas de alfalfa, aunque no se observó letalidad al 100% en alfalfa a altas concentraciones de lactosuero, la sobrevivencia de 50% de la población es evidencia de que esta especie es más tolerante al lactosuero dulce que el maíz (Figura 3). Diversos autores como Wang (1987); Navarro et al. (2006), en trabajos realizados en lechuga, encontraron diferencias de tolerancia a la toxicidad de diferentes substancias en diferentes especies, siendo la lechuga una de las especies más utilizadas en este tipo de estudio por su alta sensibilidad.
Figura 3 Efecto tóxico de lactosuero dulce a diferentes concentraciones en la emergencia de plántulas de maíz (Zea mayz L.) y alfalfa (Medicago sativa L.).
La tolerancia de la alfalfa se puede explicar por ser una semilla más resistente a pH bajo, como ha sido reportado por Köpp et al. (2011) quienes encontraron que la alfalfa puede crecer de manera óptima entre pH 5 y 6 pero que puede tolerar valores de pH aún más bajos, mientras que el pH óptimo de crecimiento de maíz es de 6 a 7.2 y presenta inhibición de crecimiento en valores de pH menores de 5 (Aldrich y Long, 1994).
CSL en el desarrollo de plántula. No se observaron diferencias en variaciones de longitud total en todas las concentraciones estudiadas (p< 0.5) por lo que se asume que el suero dulce no tiene efecto subletal a una concentración menor al 10%, en plántulas de maíz o alfalfa; sin embargo, se observó un efecto benéfico a una concentración de 5±2.6% para la longitud de alfalfa (p< 0.05) (Figura 4a y 4b).
Figura 4 Efecto subletal de lactosuero dulce en la longitud (a) y biomasa (b) de plántulas de alfalfa de 60 días. Letras diferentes entre columnas indican diferencia significativa (t-Student p< 0.05).
Las diferencias observadas entre los experimentos con semillas y plántulas indican que es menor la fitotoxicidad para la alfalfa que para el maíz y que en ambas especies el lactosuero es más tóxico en las etapas tempranas del desarrollo. Por otro lado, es necesario llevar a cabo más investigaciones para evaluar cuál es la concentración óptima en otras etapas del desarrollo de las plantas estudiadas, así como del uso del suero en condiciones de campo.
Las diferencias observadas entre los experimentos con semillas y plántulas indican que es menor la fitotoxicidad para la alfalfa que para el maíz y que en ambas especies el lactosuero es más tóxico en las etapas tempranas del desarrollo. Por otro lado, es necesario llevar a cabo más investigaciones para evaluar cuál es la concentración óptima en otras etapas del desarrollo de las plantas estudiadas, así como del uso del suero en condiciones de campo.
Conclusiones
De acuerdo con la caracterización química realizada, se encontró que los principales sueros que se generan en Chipilo Puebla son dulce y ácido-salado. El primero es el que mayor potencial de uso biotecnológico presenta, ya que tiene una toxicidad baja (CL50 de 55%) aunque se determinó que a una concentración de 12% presenta un efecto negativo en el crecimiento de germinados de alfalfa de 10 días, lo que indica que el suero dulce presenta una toxicidad baja, con altas probabilidades para utilizarse de manera segura en el riego agrícola de especies como alfalfa y maíz.
Se recomienda su uso a concentraciones menores al 12% con la finalidad de maximizar su aprovechamiento y a concentraciones menores al 4% como promotor de crecimiento vegetal. El aprovechamiento de subproductos agroindustriales representa un área de investigación con mucho potencial.
El uso de lactosuero para la elaboración de productos de interés comercial, y particularmente como materia prima para la elaboración de biocombustibles, metabolitos y biofertilizantes por transformación biotecnológica, gana cada día mayor atención. Se sugiere seguir investigando su uso como medio nutritivo para propiciar el crecimiento de microorganismos de interés agrícola como hongos y bacterias fijadoras de nitrógeno, solubilizadoras de fósforo y antagónicas de fitopatógenos y comparar su efecto en maíz y alfalfa en comparación con el lactosuero sin tratar.
