Ensayos de campo

En ensayos establecidos en 2013 se calificó la reacción a la infección natural por Psph con la escala de 1 a 9 (^{Shoonhoven y Pastor-Corrales, 1987}), en donde del 1 al 3 se considera resistente, del 4 al 6 reacción intermedia y del 7 al 9 como susceptible. Los recorridos de campo para evaluar la incidencia de Psph se realizaron en la etapa reproductiva. Se hicieron cruzamientos entre variedades susceptibles y resistentes para obtener Fs1 (variedades de raza Nueva Granada como hembras y plantas resistentes de otras razas como fuente de resistencia). Los progenitores y las plantas F1 se inocularon en las hojas primarias como se describe arriba.

Identificación de los marcadores moleculares asociados a resistencia

De las plantas de las diferenciales sembradas se colectó en la etapa vegetativa tejido del trifolio más joven para extracción de ADN, siguiendo el procedimiento CTAB descrito por ^{Doyle y Doyle (1987}). Para la cuantificación y determinación de la pureza del ADN se utilizó un espectrofotómetro NanoDrop 8000^®, colocando 2 μl de ADN en el pedestal y configurando el programa para una densidad óptica de 30 nanogramos por microlitro y absorbancia a 260 nm.

Se utilizaron seis marcadores de tipo sitios con marca de secuencia (STS) asociados a tres genes de resistencia al tizón de halo descritos por ^{Fourie et al. (2004}); ^{Miklas et al. (2009}, 2011). Para determinar la utilidad de esos marcadores se sembraron 10 semillas de cada diferencial y se realizó una mezcla equivalente en peso de tejido foliar para la extracción de ADN de las plántulas de cada una. El ADN se usó para amplificar por PCR los seis marcadores siguiendo las indicaciones de ^{Fourie et al. (2004)}; ^{Miklas et al. (2009, 2011)}. Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1.5% con amortiguador TBE. Los geles se dejaron correr 2 h a 120 V, se revelaron con bromuro de etidio y documentaron por fotografía en un transluminador UV.

Identificación de genotipos resistentes en invernadero

La inoculación con las razas 2 y 6 de Psph mostró heterogeneidad de reacción en los síntomas de las plántulas de algunas variedades; es decir, en un mismo material hubo plantas con reacción susceptible y resistente. Asimismo, hubo genotipos resistentes uniformes. También se identificaron genotipos de reacción intermedia de acuerdo con la escala utilizada 0 a 1 son resistentes y de 2 a 3 intermedios y 4 susceptibles) (^{Innes et al., 1984}). Por la diversidad de los genotipos resistentes, de diferentes tipos, al parecer ambas razas son de amplia distribución en México. Los genotipos resistentes a la raza 6 fueron: Pinto 168, Bayo 66 y Bayo 161, de raza Jalisco, Azufrado Tapatío, Lagunero 80 y Pinto Saltillo, de raza Durango y Bayo Azteca de raza Mesoamericana. En este grupo se incluyeron variedades de tipo Azufrado y todas resultaron susceptibles.

A través de la inoculación con dos aislamientos de Psph (Razas 2 y 6) se identificaron cinco variedades resistentes a la raza 2, y ocho a la raza 6, ninguno de tipo Azufrado (Cuadro 1).

^{Guising et al. (2014}, ²⁰¹⁶) caracterizaron la reacción de 283 accesiones de frijol por su resistencia a la raza 6 e identificaron cinco resistentes, sugirieron su uso como fuentes de resistencia, entre ellas un frijol nativo de Puebla, México. En Guanajuato, solo las variedades Flor de Mayo M38 y Pinto Saltillo se han utilizado en cruzas, el resto de los materiales resistentes por sus características agronómicas no deseables como tipo de grano sin valor comercial, ciclo largo y de hábito de crecimiento trepador no se han utilizado. Asimismo, para la selección en poblaciones segregantes, ésta deberá realizarse a través de la inoculación con las razas presentes en la región para la cual se estén desarrollando las variedades y no solo basarse en reacción de campo donde pueden ocurrir escapes (^{Ghising et al., 2014}).

Reacción de genotipos azufrados establecidos en campo

En campo, los 10 materiales de tipo azufrado establecidos en junio mostraron un severo ataque por el tizón de halo (datos no mostrados). En este ensayo la precipitación fue alta en la fase vegetativa durante Julio, y las temperaturas favorables para el desarrollo del tizón de halo (Figura 1). Debido al salpicado de la lluvia de plantas infectadas hacia plantas sanas, la infección por Psph fue uniforme. También es probable que Psph estuviera presente en el suelo por siembras anteriores con frijol en el sitio.

Figura 1 Temperatura máxima, mínima y precipitación decenal de enero a noviembre de 2018 en Celaya, Guanajuato. 1 y 2 indican las fechas de siembra. 

En el ensayo con 16 materiales establecido en Julio, la incidencia de la enfermedad fue menor, esto se comprobó́ porque las variedades testigo fueron las mismas en los dos ensayos, JANASA, Azufrasin y Azufrado Higuera, las que mostraron menor incidencia en el segundo ensayo (Cuadro 2). Esto indica que las condiciones ambientales influyen en la incidencia de la enfermedad, ya que la fecha de siembra de fines de julio y un período de sequía a mediados de agosto, no favorecieron el desarrollo temprano del tizón de halo, para los testigos de ambos ensayos se utilizó́ la misma fuente de semilla.

En el ensayo de 16 genotipos (Cuadro 2) hubo dos sobresalientes con incidencia < 3, los dos derivados de la misma cruza: (G17421/AZ 26// FME)-1-8-2 y (G17421/AZ 26// FME)-1-8-1. La cruza y la selección en la población segregante de la cual se derivaron estas líneas se realizó en la localidad de prueba, estos genotipos deberán ser inoculados bajo condiciones controladas para verificar su resistencia. En la actualidad, la producción de Azufrado Higuera en Sinaloa se realiza bajo riego y con semilla certificada y se utiliza protección química a las plantas contra patógenos (^{Félix-Gastelum et al., 2016}).

En cuanto a los cruzamientos realizados para incorporar resistencia a las variedades de tipo azufrado, se obtuvo semilla F₁ y F₂ de las cruzas: Aluyori x Flor de Mayo Dolores, Azufrasin x Minimi, Azufrasin x Flor de Mayo Dolores, Azufrasin x Junio León, San Rafael x Janasa y Raramuri x Janasa. Estas poblaciones se incorporaron al programa de mejoramiento local para continuar con su evaluación.

Uso de marcadores asociados a genes de resistencia a Psph

En las variedades diferenciales, con excepción de Tepari 1072, se determinó la presencia de los seis marcadores disponibles en la literatura (^{Fourie et al., 2004}; ^{Miklas et al., 2009}; ^{Miklas et al., 2011}) y de estos solo tres produjeron los amplicones esperados ST8, B10 y SW13 (Cuadro 3), mientras que R13, SAE 15 y H11 presentaron amplicones diferentes, lo que puede deberse a diferencias en el fondo genético de los locus que etiquetan estos marcadores. De hecho, dos de los últimos tres marcadores, R13 y H11, marcan el mismo gen que ST8 y sus desarrolladores (^{MIklas et al., 2009}) indican que sólo funcionan en material Andino y en los tipos negro y rojo de la raza Mesoamérica.

La resistencia reportada en las diferenciales corresponde a los genes Pse-1 y Pse-3, estos no poseen resistencia a las razas 2, 6 y 8. Es decir, los marcadores no funcionan en la selección contra esas razas; por lo tanto, su utilidad se limita a las razas 1, 3, 4, 5, 7 y 9 (^{Miklas et al., 2009}). Los tres marcadores que mostraron la respuesta esperada permiten identificar genotipos de frijol resistentes a las razas 1, 3, 4, 5, 7 y 9 (^{Miklas et al., 2009}), mismos que serán útiles para incorporar resistencia a las variedades de mayor demanda de los tipos Azufrado y Cacahuate Bola, pero no en contra de las razas 2 y 6 que se han aislado en Guanajuato y Sinaloa.

Estudios recientes de ^{Trabanco et al. (2014}); ^{González et al. (2016)}; ^{Took et al. (2017}) indican la presencia de diferentes genotipos resistentes a la raza 6, con resistencia de raza no especifica que al ser combinada con alelos de raza específica pueden resultar en resistencia duradera. En el caso del genotipo resistente US14HBR6 de tipo pinto, se determinó que la resistencia contra la raza 6, es mono génico (^{Duncan et al., 2014}). De los materiales estudiados, Flor de Mayo M38, Pinto Saltillo y Pinto Lagunero 80 con reacción de resistencia a la raza 6, no poseen los tres marcadores, de ello se infiere que poseen algún otro gen de resistencia.

Estos resultados sugieren la necesidad de desarrollar nuevos marcadores para poder utilizar la selección asistida en forma eficiente (^{Miklas et al., 2009}) o basarla en la inoculación en condiciones controladas. Recientemente ^{Took et al. (2017}) señalaron que la resistencia a la raza 6 incluye tanto alelos con efecto de raza no-específica (efectos cuantitativos), como específica (efecto cualitativo) y que la combinación de ambos tipos de alelos proveerá resistencia duradera.

En cuanto a las cruzas entre variedades resistentes y susceptibles, se observó que el marcador B10 está presente en todos (resistentes y susceptibles); es decir, no servirá para la selección asistida en este grupo de progenitores (Cuadro 4). La variedad susceptible Azufrasin, presentó dos de los tres marcadores, en este caso ninguno de los tres marcadores será de utilidad para la selección en cruzas con esta variedad. Los resultados de los progenitores demuestran que los marcadores, sobre todo T8 y SW13, se presentan de manera heterogénea en algunos; es decir, en diferentes proporciones (Cuadro 4).

Esto sugiere su uso para homogenizar la presencia de estos en esos genotipos. Asimismo, la no presencia del marcador correspondiente en plantas F1 de la cruza de Aluyori por Flor de Mayo Dolores indica la presencia de autofecundaciones. Recientemente, diversos autores han realizado estudios para identificar fuentes de resistencia de tipo cuantitativa considerando que esta, en combinación con resistencia de raza específica puede ser más duradera (^{Trabanco et al., 2014}; ^{González et al., 2016}). ^{Took et al. (2017}) mapearon alelos de resistencia a Psph raza 6 de diferentes fuentes y mostraron evidencia de resistencia durable al combinar alelos de raza no-específica con alelos de raza específica. Sugieren el uso de marcadores moleculares para el mejoramiento de la resistencia, sobre todo del alelo de raza no específica.

Las variedades Flor de Mayo M38 y Pinto Saltillo se han utilizado extensivamente en cruzas con materiales similares, deberían utilizarse en cruzas con materiales de los tipos Cacahuate Bola y Azufrado. La selección en las poblaciones segregantes deberá realizarse a través de la inoculación con las razas presentes en la región para la cual se estén desarrollando las variedades. En el caso de la región del Bajío, región con ciclos consecutivos de cultivo de riego y temporal, la posibilidad de mantener semilla sana de variedades susceptibles como los Azufrados y Cacahuate Bola es limitada y está comprometida por el reúso de grano como semilla por los productores.