Material vegetal

En este trabajo experimental se utilizaron cinco genotipos de frambuesa roja (Rubus idaeus L.): ‘Joan J’, ‘Heritage’, ‘A-1’, ‘UM-702’ y ‘C-6’, los dos primeros son materiales comerciales y los tres últimos se generaron en el programa de mejoramiento genético de frutillas de la Facultad de Agrobiología ‘Presidente Juárez’ de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo.

Establecimiento in vitro del material vegetativo

Brotes axilares y apicales provenientes del banco de germosplasma de frambuesa del invernaderon de frutillas, fueron desinfectados utilizando la metodología descrita por ^{Granados-Rubio (2017}), y establecidos in vitro en medio de cultivo MS (^{Murashige y Skoog, 1962}) con las sales minerales en concentración al 100%, vitaminas y sacarosa 30 g L^-1. Para la proliferación de los brotes el medio fue adicionado con 2 mg L^-1 de BAP (^{Minas y Neocleous, 2007}), se agustó el pH a 5.7 ±1, el medio de cultivo se gelificó con 8 g L^-1 de agar y se virtieron 20 ml de medio en frascos de 100 ml de capacidad. Se esterizaron en autoclave a 15 psi de presión durante 15 min.

Los explantes fueron colocados en un cuarto de crecimiento a 16/8 h luz/oscuridad y una temperatura de 24 ±1 ^oC. Transcurridas tres semanas los brotes que no presentaron contaminación se colocaron en el mismo medio de proliferación, con la finalidad de contar con suficiente explantes para establecer los experimentos del efecto de los reguladores de crecimiento sobre la oxidación y regeneración de frambuesa a partir de segmentos de hojas.

Oxidación y regeneración de segmentos de hojas

Para determinar el efecto de los reguladores de crecimiento sobre la oxidación y regeneración de frambuesa segmentos de hoja de cada genotipo (establecidos in vitro) fueron colocadas en un medio de cultivo MS básico adicionado con citocininas [cinetina (Kin), BAP y TDZ] y auxina (AIB) a concentraciones de 1 1.5, 2, 2.5 y 3 mg L^-1 para Kin y BAP y 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mg L^-1 para TDZ, solas o combinadas con 0.1 mg L^-1 de AIB. A partir de las plántulas propagadas in vitro se realizó la siembra de los explantes bajo el siguiente procedimiento: dentro de la campana de flujo laminar con la luz apagada, se colocó agua destilada estéril con ácido ascórbico (50 mg L^-1) en cajas Petri para prevenir la oxidación de los explantes; enseguida, se disectaron hojas en secciones de aproximadamente 1 cm² y se colocaron dentro de cada frasco con medio de cultivo, los cuales se mantuvieron en el cuarto de crecimiento bajo condiciones de oscuridad durante ocho días; transcurrido ese periodo de tiempo, se colocaron en un fotoperiodo de 16/8 h de luz/oscuridad y 24 ±1 ^oC. Después de tres semanas se subcultivaron en un medio de cultivo fresco con las mismas condiciones que contenía el medio anterior.

Diseño experimental

Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 34 tratamientos y un control con 5 repeticiones, cada unidad experimental constó de 5 explantes por frasco. Con los datos obtenidos se hizo un análisis de varianza univariado y, las variables que mostraron diferencias significativas se sometieron a la prueba de ^{Duncan (p≤ 0.5) (Duncan, 1995}) para comparación de medias entre tratamientos con el programa estadístico SAS versión 9.0 (^{SAS, 2002}).

Las variables evaluadas fueron: 1) oxidación de explantes; se determinó mediante la siguiente fórmula: oxidación (%)= número de explantes oxidados x 100/ número total de explantes establecidos; 2) explantes regenerados: se determinó el porcentaje de regeneración mediante la siguiente fórmula: regeneración (%)= número de explantes con brotes x 100/ número total de explantes establecidos; y 3) el coeficiente de multiplicación: se determinó mediante la siguiente fórmula: coeficiente de multiplicación= número de plántulas finales/número de explantes establecidos.

Efecto de auxinas y citocininas sobre la oxidación de los explantes

El Cuadro 1 incluye los resultados del efecto de los reguladores sobre la oxidación de los explantes de los cinco genotipos analizados. El genotipo ‘C-6’ tratado con TDZ (0.2 a 1 mg L^-1) mostró porcentajes de oxidación de 8 a 16%, cuando se utilizó 0.2 mg L^-1 + 0.1 mg L^-1 de AIB no se presentó oxidación (0%), mientras que en el testigo se observó (72%). Los explantes de ‘Joan J.’ que se establecieron con TDZ presentaron oxidación de 0 a 28%, esto se redujo cuando se combinó TDZ con AIB donde la oxidación fue de 0 a 12% y en el tratamiento testigo fue de (64%). La oxidación aumentó radicalmente con 3 mg L^-1 de cinetina (84%).

El genotipo ‘A-1’ presentó menor oxidación con TDZ a concentraciones de 0.2 mg L^-1 y 1 mg L^-1 más 0.1 mg L^-1 de AIB (4%). Mientras que, las dosis de 3 mg L^-1 de BAP, 0.5 mg L^-1 de BAP más 0.1 mg L^-1 de AIB o 1.5, 2.5 y 3 mg L^-1 de cinetina combinada con 0.1 mg L^-1 de AIB mostraron 100% de oxidación (Cuadro 1). El genotipo ‘UMC-702’ mostró 0% de oxidación en los explantes expuestos a 0.4 - 1 mg L^-1 de TDZ + 0.1 mg L^-1 de AIB, los explantes expuestos a cinetina solo o combinado con AIB presentaron 100% de oxidación (Cuadro 1). El TDZ disminuyó la oxidación en el genotipo ‘Heritage’. Donde concentraciones de 0.2 a 1 mg L^-1 de TDZ + 0.1 mg L^-1 de AIB mostraron porcentajes de oxidación de 0 a 16%, mientras que la cinetina (0.5 a 3 mg L^-1) + 0.1 mg L^-1 de AIB indujo la oxidación de 96 a 100%, valores superiores al tetigo (68%).

Efecto de auxinas y citocininas sobre la regeneración de brotes adventicios en explantes de hojas

Los reguladores de crecimiento tuvieron efecto sobre el número de explantes que formaron brotes en los genotipos estudiados. Los explantes del genotipo ‘C-6’ presentaron su mayor tasa de formación de brotes con TDZ (0.2 mg L^-1) con 1.4 brotes por explante; al aumentar la dosis y combinar con AIB disminuyó la inducción de brotes. También se pudo observar que la cinetina, sola o combinada con AIB, no indujo la regeneración (Cuadro 2, Figura 1A). Los explantes del genotipo ‘Joan J.’mostraron una mayor formación de brotes con 0.6 mg L^-1 de TDZ y 0.1 mg L^-1 de AIB, donde se obtuvieron 1.6 brotes por explante (Cuadro 2, Figura 1B).

En el genotipo ‘A-1’ el TDZ (0.2 mg L^-1) indujo la regeneración (0.92 brotes por explante, esto representó 36% más que el tratamiento control (Cuadro 2, Figura 1C). Para el caso de ‘UM-702’ se observó que dosis bajas de TDZ (0.2 mg L^-) + AIB (0.1 mg L^-1) indujeron la regeneración de brotes (1.12 brotes por explante) (Cuadro 2, Figura 1D). En el genotipo ‘Heritage’ se obtuvo regeneración de los con el TDZ a dosis de 0.2 mg L^-1, solo o en combinación con 0.1 mg L^-1 de AIB (40%), mientras que en el tratamiento control no se obtuvo regeneración (Cuadro 2, Figura 1C).

Figura 1 Diferentes números de explantes que muestran el grado de oxidación y de regeneración in vitro de secciones de hojas de frambuesa genotipos ‘C-6’(A), ‘Joan J’ (B), ‘A-1’ (C), ‘UM-702’ (D) y ‘Heritage’ (E), todos creciendo en un medio MS básico adicionado con 0.2 mg L ^-1 de TDZ y 0.1 mg L ^-1 de AIB. 

Los datos más reevevantes de este estudio, englobados en el párrafo anterior, muetran que existe una correlación entre la oxidación y regeneración de los brotes obtenidos a partir de secciones de hojas en todos los genotipos de frambuesa utilizados en esta investigación, a menor oxidación aumenta la regeneración de los explantes.

Oxidación de los explantes

Los resultados muestran que los reguladores de crecimiento pueden influir en la oxidación, y sobrevivencia de los explantes. El cultivo in vitro de plantas leñosas se ve limitado por la ocurrencia de oscurecimientos letales, éstos se relacionan con el estrés oxidativo (^{Turrens, 2003}) que se origina a partir de los cortes del explante, la composición del medio, volumen y capacidad del frasco de cultivo, entre otros (^{Abdelwahd et al., 2008}). En la mayoría de los protocolos se provoca un estrés en los explantes, esto induce la producción de compuestos fenólicos y varias especies reactivas de oxígeno (^{Phineas y Kuman, 2013}). El estrés oxidativo puede ser atribuido al uso de reguladores del crecimiento; la citocinina BAP es uno de los reguladores con más reportes de este efecto (^{Azofeifa et al., 2009}).

En nuestra investigación observamos que la oxidación de lo explantes de frambuesa se ve influida por el genotipo y por el tipo de regulador de crecimiento utilizado. Esto coincide con otras investigaciones donde se indica que la regeneración en plantas es dependiente del genotipo, ya que la regeneración se ha obtenido para algunos genotipos, pues la recalcitrancia de los tejidos de Rubus es una limitante (^{Palomo-Ríos et al., 2018}). ^{Zawadzka y Orlikowska (2006}) observaron genotipos de frambuesa in vitro que mostraron hojas cloróticas y recalcitrantes a la regeneración.

La clorosis en plantas de frambuesa y la oxidación de los explantes se incrementa de manera sustancial cuando los tejidos son expuestos a largos periodos de luz fluoresente en medios de cultivo adicionados con citocininas del tipo 6-bencyl adenina (BA) o isopentenil adenina (2iP), ya que estas interfiren en el correcto funcionamiento de calcio intracelular e incrementan la concentración de algunas proteínas involucradas en el correcto funcionamiento del fotosistema II (^{Murvanidze et al., 2022}).

Regeneración y multiplicación de brotes adventicios

Los protocolos de regeneración en ‘berries’ deben contener las dosis y combinaciones de reguladores de crecimiento correctos (auxinas y citocininas) en el medio de cultivo (^{Cappelletti et al., 2016}). La morfogénesis in vitro es afectada por factores como: genotipo, edad, posición y orientación del explante en el medio de cultivo (^{Kumar y Reddy, 2011}). En esta investigación se observó que los reguladores de crecimiento influyeron sobre la regeneración; sin embargo, cada genotipo tuvo una capacidad de respuesta distinta; el uso de BAP (0.5 mg L^-1), solo o combinado con AIB (0.1 mg L^-1), indujo la regeneración de brotes adventicios en el genotipo ‘C-6’, el resto de los genotipos mostraron una mayor regeneración con TDZ (0.2 mg L^-1).

Estos resultados concuerdan con ^{Meng et al. (2004}) donde el uso de BAP (1 mg L^-1) y AIB (0.1 mg L^-1) en frambuesa cv. ‘Marion’ indujeron la regeneración 70%, mientras que en el cultivar ‘Sunberry’ se observó 46%. ^{Kim y Dai (2020}) obtuvieron en el genotipo ‘Joan J.’ una regeneración de 70% con 2.5 µM (0.56 mg L^-1) de BAP + 1 µM (0.216 mg L^-1) de TDZ. La combinación de BAP con TDZ fomenta la proliferación celular a medida que se acelera la multiplicación de brotes nuevos (^{Bairú et al., 2007}). El efecto de las citocininas en la regeneración se puede atribuir a que éstas actúan como un activador positivo de la división celular, la BAP pertenece a este grupo, que son las hormonas clave para la inducción de brotes en diversos tejidos y órganos (^{Bustillo-Avendaño et al., 2018}; ^{Howell et al., 2003}).

Algunos estudios han mostrado que los procesos morfogenéticos se regulan en primera instancia por las citocininas, las cuales actúan sobre la zona central de los explantes y posteriormente intervienen las auxinas en el proceso sobre las células periféricas del explante (^{Schaller et al., 2015}). El BAP se utiliza para el cultivo in vitro de especies leñosas para inducir multiplicación porque estas plantas poseen una mayor carga hormonal endógena en comparación con plantas herbáceas (^{Bairú et al., 2007}) y cuando se utiliza en tejidos jóvenes el potencial morfogénico para la diferenciación se incrementa (^{Mazumdar et al., 2020}).

En esta investigación se observó que la cinetina, no indujo la regeneración en ninguno los genotipos evaluados. Sin embargo, ^{Zawdzka y Orlikowska (2006)} reportaron el efecto de la combinación de BAP + cinetina sobre la regeneración de cinco cultivares de frambuesa, ya que las citocininas estimulan la división celular y la propagación vegetativa (^{Taiz y Zeiger, 2010}).

En esta investigación, la adición de TDZ al medio de cultivo estimuló la regeneración de brotes en los genotipos ‘Joan J.’ y ‘A-1’, lo cual concuerda con los resultados obtenidos por ^{Fiola et al. (1990}) donde el TDZ tuvo mayor efecto que el BAP para inducir organogénesis en cotiledones y hojas de Rubus fruticosus, la dosis óptima en explantes de hoja fue de 5-20 µM (1.13-4.5 mg), esto ocurrió de manera similar en la formación de brotes a partir de yemas axilares y brotes apicales en zarzamora, donde concentraciones de 0.25, 0.5, 0.75 y 1 mg L^-1 indujeron porcentajes de regeneración de 60, 70, 100, 80 y 75%, respectivamente (^{Jadán et al., 2015}).

En los cultivares ‘Autumn Bliss’, ‘Canby’, ‘Summit’ y ‘Sentry’ de frambuesa se observó que el TDZ fue significativamente más efectivo que BAP, el medio adicionado con 1 µM (0.23 mg) de TDZ indujo la regeneración en hojas (^{Turk, 1994}). ^{Debnath et al. (2014}) reportaron 70% de regeneración con 4.5 µM (1.01 mg) de TDZ con 4.2 brotes por explante y un coeficiente de multiplicación de 1.7 en un sistema de biorreactores y al aumentar la dosis a 5 µM se obtuvo un porcentaje de regeneración de 96% en el cv. ‘MD-ETC E-1’.

^{Ruíz-Anchondo et al. (2018}) observan que la micropropagación in vitro de frambuesa cv Heritage, a partir de meristemos y entrenudos, se ve favorecida cuando se utiliza BAP (4.44 µM) y GA (1.44 µM) en el medio de cultivo, mientras que ^{Georgieva et al. (2020}) encuentran que la capacidad de proliferación es mayor en el cv Magdalena (3.9 brotes/explante) en relación con el cv Willamette (2.6 brotes/explante) en un medio adicionado con 0.5 mg L^-1 de BAP y 0.01 mg L^-1 de AIB, concentraciones de reguladores menores a las utilizadas en nuestro estudio.

El TDZ ha demostrado ser eficaz en la regeneración de muchas especies recalcitrantes (^{Liu et al., 2003}). A diferencia de otras citocininas, el TDZ es resistente a la citocinina oxidasa, por lo cual es bastante estable en los tejidos de las plantas (^{Dewir et al., 2018}). La necesidad de citocininas es extremadamente variable y depende del contenido endógeno de la especie y del genotipo, ya que éste tiene un efecto marcado sobre la capacidad de regeneración en condiciones in vitro (^{Hunková et al., 2016}).

Las dosis utilizadas influyen sobre los procesos a los que da origen, por ejemplo, cuando se usan dosis bajas de TDZ, éste induce organogénesis; al utilizar dosis altas se conduce a la embriogénesis; pero, concentraciones elevadas pueden ser tóxicas para el desarrollo de los cultivos in vitro (^{Ling et al., 2013}).