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Introducción
En la agricultura, muchas plantas de interés son las leguminosas debido a su alto contenido de proteína (~40%), teniendo un gran valor nutrimental, sin embargo, requiere alto contenido de nitrógeno, conocido por ser un factor limitante, al mismo tiempo, una alternativa natural implementada por las plantas para suplir esta necesidad es, a traves de la FBN (Meena et al., 2017). No obstante, algunos autores favorecen el implementar fertilizantes inorgánicos, pero el uso excesivo de estos y una mala práctica lleva a la alteración de los ecosistemas (Soumare et al., 2020). Por otro lado, los fertilizantes nitrogenados y la FBN que realizan algunos microorganismos, son las fuentes que permiten incorporar nitrógeno (N) al suelo; ambos procesos, utilizan el N contenido en la atmósfera.
La planta de soya, una de las leguminosas mas importantes, establece simbiosis con bacterias del genero Bradhyrizobium japonicum y satisface sus necesidades de N mediante dos vías de asimilación, una ruta es la FBN que se realiza en el bacteroides de los nódulos formados en la raíz en donde se fija entre 50 y 60% del N total requerido por la planta y la segunda vía es la absorción por la raíz del N-mineral (NH4 + y NO3 -) presente en el suelo de manera natural o aplicado con fertilizantes químicos (Ortez et al., 2017).
Mundialmente, un estimado de ~2.5 × 1011 kg NH3 es fijado anualmente con la BNF (Meena et al., 2017). Actualmente, el potencial de fijación de N simbiótica por leguminosas es subexplotado debido a que sólo implica 13% de la fertilización en tierras de cultivo (Anglade et al., 2015). En vista de que la concentración de N en la materia orgánica del suelo es limitante y se reduce rápidamente con unos pocos ciclos de cultivo así como la eficiencia de los fertilizantes nitrogenada resulta ser inferior a 50%, desde una pespectiva económica como ambiental la FBN es actualmente la manera mas sustentable para incorporar el N a la planta de soya (Saturno et al., 2017).
Tradicionalmente la planta de soya ha sido utilizada en estudios controlados de laboratorio y campo, para comprender los procesos de absorción y metabolismo del N-mineral y del N2 provienente de la FBN, así como su distribución en los órganos de la planta (Ohyama et al., 2017; Senthilkumar et al., 2021). Estudios con 15N como NO3 -, NH4 + o N2, demostraron que las dos fuentes de N son reducidas a amonio (NH4 +) en la raiz (Yoneyama et al., 2020) y utilizados en la síntesis de aminoácidos y proteínas (Ertani et al., 2013); sin embargo, la fuente de N absorbida por la planta controla su distribución en los órganos de la planta (Balta-Crisólogo et al., 2015).
En la planta de soya abastecida con N mineral, el N se transporta como N-aminoácido y como N-ureido (alantoina y ácido alantoico) el N que proviene de la FBN (Hartmann et al., 2012). Ambas formas de N abastecen los órganos del follaje y estructuras reproductivas (Kipp et al., 2020). El N-aminoácido abastece el aparato vegetativo y más específicamente los tallos (Yan et al., 2016), mientras que el N-ureido es utilizado en órganos en desarrollo y durante el período reproductivo son las vainas, estructuras en las que se determinó 52% de N proveniente de la FBN (Gregg et al., 2015; Chen et al., 2018). Sin embargo, el uso de N mineral podría incrementar el rendimiento en la planta de soja en condiciones muy especificas, pero esta práctica raramente es económicamente viable (Saturno et al., 2017).
Los estudios sobre la FBN en soya, se han enfocado también a entender las complejas interacciones moleculares que controlan: a) la selectividad existente entre la planta y el Bradhyrizobium japonicum; b) la formación de los nódulos (Bala y Giller, 2006); c) los factores que afectan la eficiencia de la fijación (Freixas et al., 2011); d) los factores que influyen en la senescencia de los nódulos (Fernández-Luqueño y Espinosa-Victoria, 2008); y e) los métodos para cuantificar el N que proviene de la FBN (Ortez et al., 2017).
En países productores de soya, los programas de mejoramiento genético han aprovechado los avances en la FBN, indentificado líneas altamente eficientes en la FBN (Cerezini et al., 2020), incrementándo el rendimiento y disminuyendo el uso de fertilizantes nitrogenados (Fontanetto et al., 2011). Estudios realizados en genotipos liberados comercialmente en distintas decadas (1980-2010) de EE. UU y Argentina confirmaron mayor potencial de rendimiento al recibir fertilización nitrogenada, los genotipos liberados en 2010 registraron un rendimiento mayor entre 15 y 34% al registrado en materiales liberados antes de 2010 en EE. UU y Argentina, respectivamente.
No obstante los avances antes mencionados, la interacción entre los genotipos de la soya y la respuesta del fertilizante nitrogenado es un tema que requiere de mayor estudio, por lo que el objetivo del presente estudio fue contribuir al conocimiento de la nutrición nitrogenada y en la producción de la materia seca de la planta de soya.
Materiales y métodos
La investigación se realizó en el Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo (19° 28’ 4.26” latitud norte, 98° 53’ 42.18” longitud oeste y una altitud de 2 250 m) en Texcoco, Estado de México, bajo condiciones de invernadero tipo cenital de estructura metálica cubierto con plástico blanco lechoso (calibre 720).
Semilla de soya cv Santa Rosa, fueron sembradas en charolas de polipropileno de 200 cavidades, hasta que las plántulas presentaron el primer par de hojas verdaderas. Posteriormente seis plántulas fueron transplantadas en una maceta de plástico de 5 L de capacidad previamente desinfectada (unidad experimental), como sustrato en las macetas se utilizó agrolita. Los tratamientos consistieron en desarrollar la planta de soya en seis condiciones, provenientes de combinar: a) tres niveles de nitrógeno mineral 0, 3.5 y 7 meq L-1 de N, utilizándose el NH4 NO3 grado reactivo como fuente de nitrógeno; y b) dos niveles de inoculación (con y sin inocular); cada tratamiento se aplicó por triplicado.
El diseño experimental utilizado fue completamente al azar. Al tercer dia después del trasplante, se inocularon las plantas de los tratamientos correspondientes, aplicándose en la base del tallo de cada planta 1 ml de cultivo que contenía 109 células de bacterias de Bradyrizobium japonicum provenientes de la cepa CP-2 de la colección de microbiología del CP. Los riegos, desde la germinación hasta la inoculación, se proporcionaron diariamente con agua destilada y después de la inoculación con solución nutritiva sin nitrógeno (Tirado y Alcántar, 1989).
Con la solución nutritiva se prepararon las tres tratamientos de nitrógeno aplicados a las plantas de soya, iniciándose su aplicación a los 15 días después de la inoculación, dicha solución nutritiva fue renovada cada semana (Cuadro 1).
Cuadro 1 Composición de la solución nutritiva sin nitrógeno, utilizada durante el desarrollo del estudio.
| Sal | (meq L-1) |
| KH2PO4 | 2.4 |
| MgSO4 | 1.2 |
| CaCl2 | 1 |
| K2SO4 | 1 |
| (ppm) | |
| H3BO3 | 2 |
| MnSO4 4H2O | 1.8 |
| ZnSO4 | 0.2 |
| CuSO4 | 0.8 |
| NaMoO4 2H2O | 0.04 |
| Fe-EDTA | 16 |
Durante el desarrollo de la planta se realizaron cuatro muestreos destructivos; etapa vegetativa (V7), floración (R2), formación de vaina (R4) y máximo llenado de grano (R6), etapas registradas a 28, 54, 79 y 103 dias después de siembra (DDS). En cada evaluación se tomaron seis plantas por maceta registrándose el peso húmedo (PH) y seco (MS) de hojas, tallos, vainas (cuando estuvieron presentes) y raíces. En este último órgano, en las primeras tres etapas fenológicas, se evalúo la fijación biológica del nitrógeno (FBN) mediante la actividad de la nitrogenasa (N’asa) mediante la reducción de acetileno (ARA), el número y peso seco de nódulos por planta.
En cada etapa de muestreo se tomaron 0.22 g de materia fresca de peciolos, 0.5 g para tallos y hojas y 1 g en raíces, cada muestra fue envuelta en papel de aluminio y conservadas en nitrógeno líquido (-70 (C) hasta su utilización en la determinación de N-soluble; las muestras utilizadas para la determinación de nitrógeno total se secaron en una estufa de aire forzado durante 72 h a 70 (C. Las muestras del material vegetal fresco se molieron con un mortero en 10 ml de la solución amortiguadora de fosfato de potasio 0.1 M, pH 7.4, filtrándose en una gasa para separar los residuos gruesos. A partir de este extracto vegetal fue determinado el N-aminoácido y el N-ureido (Tirado y Alcántar,1989). En material vegetal seco se determinó el N total por el método de Microkjeldahl. Los datos obtenidos de las variables respuesta fueron analizados mediante análisis de varianza y prueba de separación de medias utilizando la prueba de Tukey (p≤ 0.05).
Resultados y discusión
Número y actividad de los nódulos
El número, peso seco de nódulos y los valores de ARA, en la planta de soya, desde la etapa de V7 hasta la etapa de R4, fueron afectados negativamente por el N mineral aportado en la solución nutritiva (Cuadro 2). El aporte de 3.5 y 7 meq L-1 de N en la solución nutritiva originó una disminución de 9 y 25 nódulos en la raíz de la planta de soya, respectivamente. De igual manera el peso seco de nódulos por planta, fue mayormente afectado cuando las planta recibió 7 meq de N L-1 (Cuadro 2).
Cuadro 2 Valores medios de el número, peso seco y actividad de los nodulos en la fijación de N2 (ARA) registrados en tres etapas de evaluación por efecto del N mineral aportado en la solución nutritiva.
| Tratamiento | Nódulos planta-1 | ARA (nmol de C2H4 h-1 p-1) | |
| Número | Peso seco (mg) | ||
| 0 meq L-1 de N + Inoc | 85 (100)* | 117.5 (100) | 1.02 (100) |
| 3.5 meq L-1 de N + Inoc | 76 (89) | 80.5 (69) | 0.89 (87) |
| 7 meq L-1 de N + Inoc | 60 (71) | 42.1 (36) | 0.46 ( 45) |
*= valor entre paréntesis es % relativo al tratamiento sin nitrógeno.
La actividad de la N’asa mostró variación con el desarrollo de la planta y también fue afectada negativamente por la aplicación de N mineral. Por efecto del aporte de N en la solución nutritiva, el valor medio de la actividad de la N’asa estimado en tres etapas del desarrollo de la planta (V7, R2 y R4) se redujo 13 y 55% cuando recibieron 3.5 y 7 meq L-1 de N en la solución nutritiva respectivamente.
Las causas que originan la disminución de la actividad de la N’asa podría deberse según Stal et al. (2017) al efecto de la regulación de compuestos como el oxígeno o temperaturas, mientras que Xia et al. (2017) menciono que la aplicación de NO3 - redujo el envío de carbohidratos a los nódulos y lo atribuyen a la formación de NO2 - que es tóxico para la nitrogenasa e interfiere en la regulación del oxígeno y por lo tanto en la fijación de N2.
Nitrógeno soluble (N aminoácido y N ureido)
Al avanzar el ciclo, el crecimiento de órganos vegetativos y reproductivos originó en la planta de soya un incremento la demanda de N del follaje, registrándose incrementos significativos (p≤ 0.05) en la concentracion de N soluble trasportado desde la etapa de V7 hasta la etapa de R4. La excepción de esta tendencia se registró en plantas inoculadas que no recibieron N mineral y en las plantas no inoculadas desarrolladas con 7.5 meq L-1 de N mineral, ambas plantas presentaron a R2 el valor máximo en la concentración de N soluble transportado y disminuyó a la etapa de R4 (Cuadro 3).
Particularmente a la etapa de R2, las plantas que recibieron N mineral en la solución nutritiva (3.5 y 7 meq L-1 de N) presentaron la mayor concentración de N soluble transportado, cuyos valores disminuyeron 20 y 7% al recibir inoculación; disminución que pudo ser originada por la competencia entre el desarrollo de los nódulos en la raíz y el crecimiento de los órganos del follaje (Cuadro 3). A la etapa de R4, una ves establecidos y desarrollados los nódulos en estas mismas plantas, la actividad de los nodulos y el N mineral absorbido por la raíz de la solución nutritiva, originó un incrementó 7 y 43% en los valores en la concentración de N soluble transportado con relación a la concentración de N soluble transportado en plantas no inoculadas abastecidas con 3.5 y 7 meq L-1 de N mineral en la solución nutritiva, respectivamente (Cuadro 3).
Cuadro 3 Concentración de N soluble (µg de N gmf-1) transportado en el tallo en diferentes etapas de desarrollo de la planta de soya.
| Tratamiento | Vegetativa (V7) | Floración (R2) | Reproductiva (R4) |
| (µg de N gmf-1) | |||
| 0 meq of N | 77.5 c | 104.5 f | 128.8 e |
| 3.5 meq of N | 168.1 a | 295.6 d | 318.4 c |
| 7 meq of N | 111.3 b | 384.7 a | 284.3 d |
| 0 meq L-1 of N + Inoc | 83.7 c | 329.3 c | 296.5 d |
| 3.5 meq L-1 of N + Inoc | 110.6 b | 235.2 e | 341.5 b |
| 7 meq L-1 of N + Inoc | 120.2 b | 359 b | 406.9 a |
| DSH | 17.2 | 9.6 | 15.8 |
Valores con diferente letra en la misma columna son diferentes (Tukey p≤ 0.05).
El N soluble total transportado estuvo formado por N-aminoácido y N-ureido, su proporción en cada evaluación dependió de la etapa de desarrollo y de la fuente de N asimilada (N mineral o N2). En las etapas inicial de desarrollo de la planta (V7), predominó el N-aminoácido como la forma de N soluble independientemente de la forma de N que recibió la planta, Figura 1A. Cuando las plantas recibieron exclusivamente con N mineral, en las etapas de R2 y R4 presentaron entre 86 y 95% del N soluble en forma de N-aminoácido, respectivamente (Figura 1B y 1C), valores similares a los reportados por Santachiara et al. (2017); Junior et al. (2020) quienes mencionaron que en soya abastecidas con N mineral entre 77% y 90% del N soluble es transportado como N aminoácido.
Las mismas Figuras 1B y 2C muestran que cuando la planta de soya además del N mineral recibió también inoculación, presentó una disminución en el valor de N aminoácido transportado con respecto a las plantas abastecidas solo con N mineral: A la etapa de R2 los valores de N aminoácido fluctuaron entre 66 y 82%, Figura 1 B; mientras a la etapa de R4, el valor medio del N aminoácido transportado disminuyó hasta 35%, el decremento del N aminoácido fue originado por la actividad de la fijación de N2 de los nódulos que estimuló la producción del N ureido como lo mencionaron Lopes (2015); McCoy et al. (2018), resultados que concuerdan con los consignados por Tamagno et al. (2018), quienes mencionaron que en plantas desarrolladas en estas condiciones 60% a 81% del N soluble, se transporta para las vías de rizodeposición; es decir, descomposición y deteriorio de nódulos y células de la raíz (Fustec et al., 2010; Collier et al., 2012).
En las plantas inoculadas el N-ureido transportado registró máximos valores en la etapa R4 situación inversa se registro en los valores de ARA durante esta etapa, lo anterior puede ser atribuido a que ambos métodos deben de ser calibrados como lo realizó Grageda et al. (2003), empleando técnicas no destructivas reportaron que después de R5 la planta de soya fijó 78% de N.
Importante es señalar que entre las etapas de R2 y R4, las plantas abastecidas con 3.5 meq de N presentaron 79% del N soluble transportado como N ureido, observándose que dicha forma de N se redujo a 50% cuando la planta recibió 7 meq de N en la solución nutritiva. Las disminuciones en la cantidad de N-ureido por efecto de la aplicación externa de N habían sido reportadas por Ono et al. (2021), dichos investigadores mencionaron que en plantas noduladas el N-ureido resulta relativamente bajo, debido a que se convierte a urea, ocurriendo activamente en las partes subterráneas, especialmente en las raíces, en su estudio, el nitrato represento alrededor de 50% de N aplicando 5 mM de NaNO3.
Acumulación y distribución del N
El N mineral absorbido por la raíz ó el N2 fijado en los nódulos, una vez asimilado y transportado como N soluble se acumuló como N total en en la MS de los órganos de mayor demanda en cada etapa de desarrollo de la planta. A la etapa de R2, las plantas que recibieron 7 meq de N en la solución nutritiva presentaron en su MS la mayor acumulación de N total, esta forma de N favoreció el N total acumulado en la MS de los tallos y peciolos cuyas diferencias por la forma de N recibido en un mismo órgano fueron significativas (p≤ 0.05).
El menor valor de N total, se registró en la MS de plantas que no recibieron N mineral y tampoco inoculación, y representó 10% con respecto a las plantas que acumularon la mayor cantidad de N total. A esta etapa R2, independiente de la fuente de N que recibió la planta, el N total en promedio representó 72, 18 y 10% del N total de la MS de hojas, tallos y peciolos, respectivamente.
Entre la etapa de R2 y R6, se registró el mayor incremento de N total en la MS de todas las plantas. cuando estas fueron inoculadas y recibieron N mineral acumularon la mayor cantidad de N total y en promedio fue 2.3 veces mas que el valor de N total registrado en la MS de plantas que sólo recibieron el N mineral, dichas diferencias fueron significativas (p≤ 0.05). Particularmente en la planta de soya que recibió 3.5 meq de N L-1 presentó una acumulación de 158 mg de N planta-1 en la MS, cantidad de N total que considerando una densidad de 437 planta ha-1 permite estimar una extracción total de 72.2 kg de N ha-1; ésta extracción de N total por efecto del N mineral, representó 30% del N total determinado en la MS de plantas abastecidas con la misma dosis de N mineral y que también fueron también inoculadas (Cuadro 4). Es decir, en esta planta 160.5 kg de N ha-1 determinado en la MS se obtuvo por efecto de la actividad de los nódulos, deduciéndose 70% del N acumulado en la MS a la etapa de R6 provino de la fijación de N2; lo anterior muestra que ambas vías de asimilación de N actuan en la planta de manera complementaria como previamente lo mencionó Lu et al. (2021).
Cuadro 4 Cantidad de N acumulado (mg planta-1) en la materia seca de los órganos de la planta de soya durante la etapa reproductiva (R6).
| Tratamiento | Total | Hoja | Tallo | Peciolo | Vaina |
| (mg de N planta-1) | |||||
| 0.0 meq de N | 41.9 e | 7.1 e | 2.9 d | 1 d | 31 f |
| 3.5 meq de N | 158 c | 36.7 c | 4.6 c | 2.2 d | 114.5 d |
| 7.0 meq de N | 274.1 b | 93.6 b | 12.9 b | 6.2 c | 161.4 c |
| 0.0 meq de N + Inoc | 98.4 d | 23.4 d | 3.6 cd | 2.2 d | 69.2 e |
| 3.5 meq de N + Inoc | 509.2 a | 94.6 b | 21 a | 13.9 a | 379.7 a |
| 7.0 meq de N + Inoc | 487.1 a | 128.9 a | 22.2 a | 10.3 b | 325.7 b |
| DSH | 26 | 4 | 1.7 | 0.9 | 7.1 |
Valores con diferente letra en la misma columna son diferentes (Tukey p≤ 0.05).
Durante esta etapa reproductiva, la alta demanda de N de las vainas originó que en las plantas abastecidas con N mineral exclusivamente y en las inoculadas que no recibieron N mineral, parte del N total determinado a floración en los órganos del follaje se movilizara hacia las vainas, en las plantas inoculadas que no recibieron N mineral 41.6% del N determinado en las vainas provenía del N almacenado en el follaje a R2, mientras que en las plantas abastecidas exclusivamente con la mayor dosis de N este porcentaje fue de 9.9% y 4.4% en las que recibieron la dosis intermedia.
Acumulación y distribución de la materia seca (MS) por planta
La menor cantidad de MS se registró en la planta que no recibió N mineral y tampoco inoculación, a la etapa de R2, en esta planta la MS acumulada representó 46% de la MS producida en la planta que recibió sólo inoculación. En esta etapa, la planta que recibió la mayor dosis de N e inoculación fue superada 0.5 g de MS planta-1 por la MS registrada que recibió la mayor dosis de N (Cuadro 5), situación que puede ser asociada a la la competencia que generó la formación de nódulos en la raíz.
Cuadro 5 Producción de materia seca en la planta de soya en dos etapas fenológicas.
| Tratamiento | Floración (R2) | Máximo llenado de grano (R6) | Incremento (R2 a R6) |
| (g planta-1) | |||
| 0 meq L-1 de N | 0.6 d | 1.4 f | 0.8 |
| 3.5 meq L-1 de N | 2 b | 6.2 d | 4.2 |
| 7 meq L-1 de N | 2.8 a | 8.1 c | 5.3 |
| 0 meq L-1 de N + Inoc | 1.5 c | 3.3 e | 1.8 |
| 3.5 meq L-1 de N + Inoc | 2 b | 11.8 b | 9.8 |
| 7 meq L-1 de N + Inoc | 2.3 b | 13.3 a | 11 |
| DSH | 0.4 | 0.8 | |
Valores con diferente letra en la misma columna son diferentes (Tukey p≤ 0.05).
La mayor producción de MS en la planta se produjó entre la etapa de R2 y R6, independiente de la dosis y forma de N que recibió la planta. Las plantas abastecidas con N-mineral e inoculadas consistentemente produjeron mayor cantidad de MS, el valor medio de la MS registrada a R6 en estas plantas, superó 1.7 veces a la MS de plantas que solo recibieron N-mineral (3 y 7 meq L-1) y 9.3 veces la MS de plantas desarrolladas sin N mineral y sin inoculación (Cuadro 5).
Idependientemente de la nutrición nitrogenada que recibió la planta durante su desarrollo, del valor total de la MS producida a la etapa de R6, en promedio el 59% se registró en vainas, 26% en hojas y 15% en tallos+peciolos (Figura 2). Las plantas inoculadas que recibieron N mineral produjeron en sus órganos mayor cantidad de MS, en vainas el valor fue 2.2 veces superior significativamente (p≤ 0.05) al valor de MS registrado en las vainas de plantas que solo recibieron N mineral; en tallos mas peciolos y hojas este valor fue de 1.4 y 1.3, respectivamente. Estos resultados concuerdan con los consignados por Tirado et al. (1990), demostrando que las dos vías de asimilación de N en la planta de soya son necesarias para obtener altos rendimientos de MS.
Figura 2 Materia seca (g planta-1) acumulada en los órganos de la planta de soya variedad Santa Rosa, durante la etapa de llenado de grano (R6).
Estos resultados indican que en las plantas de soya noduladas la acumulación de MS en las vainas es favorecidas por la actividad de los nódulos y que el follaje es una fuente importante de N, pudiendo concluir que el N fijado (N-ureido) es destinado prioritariamente al abastecimiento de granos como lo mencionaron (Anglade et al., 2015; Zhou et al., 2016; Ono et al., 2021).
Conclusiones
La aplicación de N mineral afectó el número de nódulos por planta, el peso seco de nódulos y la actividad de la nitrogenasa. La mayor acumulación de materia seca y nitrógeno total fue en las plantas inoculadas y abastecidas con N mineral. En las plantas noduladas entre 39 y 79% del N soluble transportado en el tallo después de floración se registró en forma de N-ureido. Del N total determinado en las vainas, entre 50 y 70% fue asimilado vía fijación de N2.
