Material biológico

Cepa de Pleurotus ostreatus (Jacq. Ex Fr.) P. Kumm (Fungi: Agaricomycetes: Pleurotaceae) obtenida del cepario del laboratorio de micología del Departamento de Investigación en Ciencias Agrícolas (DICA).

Reactivos

Micelio vegetativo, micelio activado y biomasa de P. ostreatus, medio de cultivo agar papa-dextrosa (PDA) BD Bioxon^®, soluciones estándar de nitrato de plomo [Pb (NO₃)₂] CAT. 7731 Accustandard Inc lote: A8035019, estándar de nitrato de cromo [Cr (NO₃)₃•9H₂O] CAT. 7731 Hycel de México, SA de CV lote: 298404 y estándar de nitrato de cadmio [Cd (NO₃)₂•4H₂O)] CAT. 7801 Hycel de México SA de CV lote: 298399. Las metodologías utilizadas se enmarcan en los procesos de biorremediación propuestos por ^{Beyer (2005)}; ^{Noble (2005)}; ^{Stamets (2005)}.

Obtención del micelio vegetativo

Se utilizaron las metodologías propuestas por ^{Flegg et al. (1985)}; ^{Smith et al. (1994)}; ^{Chang et al. (2013)}, modificadas de acuerdo con las condiciones de equipo y presupuesto de la institución. En placas de Petri con medio de cultivo agar papa-dextrosa, se inoculó tejido vegetativo de basidiocarpos frescos de P. ostreatus, se incubaron a 25 °C durante 7 días (^{Staments, 1983}; ^{Mumpuni et al., 2017}).

Preparación del micelio activado

Con base en la metodología propuesta por ^{Chalmers (1993}); ^{Stamets et al. (1983)}. Se colocó en un biorreactor con capacidad de 1 L, 1 kg de semilla de sorgo (Sorghum sp.), previamente hidratada al 40% (p/v) se esterilizó a 121 °C y 15 psi por 1 h (Sánchez y Roice 2004), posteriormente la semilla se inoculó con 3 círculos de 1 cm de diámetro de agar con micelio vegetativo de P. ostreatus (0.01 mg en peso seco) y se incubó a una temperatura de 25 °C ±2 por 5 días (^{Staments, 1983}).

Obtención de biomasa (adsorbente) en medio líquido

La metodología empleada fue la propuesta por ^{Chalmers (1993)}. Se esterilizaron en autoclave a 121 °C y 15 psi por 15 min, 12 matraces Erlenmeyer de 500 ml con 250 ml de medio Kirk modificado a pH 5.5 con 1 g de fibra natural de salvado de trigo y 0.01 g de CuSO₄, se inocularon 3 discos de micelio de 1 cm de diámetro de agar con micelio de P. ostreatus (0.01 mg en peso seco), se incubaron durante 10 días a 25 °C ±2 (^{Díaz et al., 2013}).

Soluciones para evaluar la adsorción de metales en medio líquido (adsorbato)

Los metales pesados se determinaron en un EAA (espectrofotómetro de absorción atómica, Varian 55B), utilizando las metodologías propuestas por la ^{EPA (2002)}, la ^{APHA (2018)}, así como las recomendaciones de la ^{CONAGUA (2018)} en sus estadísticas y el Atlas del agua en México, utilizando la ^{NOM-003- SEMARNAT-1997}. A partir de soluciones patrón AccuStandard Inc. de 1 000 mg L^-1, se prepararon 4 repeticiones de soluciones metálicas a concentraciones de 20 mg L^-1 de Pb (NO₃)_2, Cr (NO₃)₃•9H₂O, y Cd (NO₃)₂•4H₂O, que se colocaron en biorreactores de 500 ml, se les agregó 1 g de glucosa, se ajustó el pH a 5.5 y se esterilizaron a 121°C por 15 minutos 15 psi.

Posteriormente se depositó la biomasa adsorbente generada en el medio líquido y se incubaron por 10 días a 25 °C. Se extrajeron alícuotas de 2 ml cada 24 h durante 10 días para analizar la concentración metálica de cada solución en un espectrofotómetro de adsorción atómica modelo VARIAN 55B, longitud de onda para Pb 217.0 nm, Cr 425.4 nm y Cd 228.8 nm (^{Kumar et al., 2011}; ^{Fleites, 2015}).

Medio de cultivo para evaluar la tolerancia e inhibición del crecimiento miceliar

A partir de soluciones estándares de 1000 mg L^-1 de Pb(NO₃)_2, Cr(NO₃)₃•9H₂O, y Cd(NO₃)₂•4H₂O se prepararon diferentes concentraciones (20, 40, 60, 80, y 100 mg L^-1) de soluciones para usarlas en la preparación de PDA (agar papa dextrosa), se ajustó el pH a 5.5, se esterilizo 121°C por 15 min, 15 psi, se vertió en cajas Petri (^{Fleites, 2015}) en cada una se inoculó el micelio activado, se incubó a 25 ºC ±2 y se cuantificó diariamente el crecimiento radial en milímetros durante 8 días (^{Morales et al., 2010}).

Descripción del efecto de las concentraciones metálicas sobre el micelio de P. ostreatus por microscopía electrónica de barrido (SEM)

El análisis por microscopía electrónica de barrido se realizó en un microscopio JECL modelo JSM-6610LV, complementado con un equipo de microanálisis EDX Inca Energy-350, Oxford Instruments, con detector de rayos X modelo X-Max 50, de 50 mm², con resolución teórica de 127 eV a la energía del pico K del Mn. Cada muestra se deshidrató y se cubrió con polvo de oro en un equipo de recubrimiento marca Balzers modelo SCD 004 (^{Lozano et al., 2014}). Conjuntamente se realizó el análisis de espectrometría de dispersión de energía de rayos X (EDX) al micelio de P. ostreatus, para describir la presencia de metales en su interior celular.

Análisis estadístico

Se utilizó un diseño completamente al azar (DCA) con tres repeticiones para evaluar el efecto de las variables independientes: concentración de los metales Pb, Cr y Cd, y los días de crecimiento del micelio sobre las variables de respuesta: porcentaje de retención o adsorción. El conjunto de datos experimentales se analizó a través de una prueba de varianza (Anova) de dos vías (los factores fueron los metales experimentales y los días de contacto con el micelio para evaluar su retención o adsorción) y una prueba de medias Tukey (p≤ 0.05) con el software R-commander (^{Fox, 2005}).

Evaluación de la adsorción de metales en medio líquido

En la Figura 1 se describe el comportamiento de los metales Pb, Cr y Cd en solución a una concentración de 20 mg L^-1 en función del tiempo de contacto con la biomasa de P. ostreatus.

Figura 1 Cuantificación de las concentraciones retenidas por la biomasa de P. ostreatus en contacto con soluciones de: a) plomo; b) cromo; y c) cadmio en función del tiempo a una concentración de 20 mg L^-1. 

Los resultados en la Figura 1, indicaron que la adsorción de Pb (75%) fue la más eficiente, seguida de Cr (42%) y Cd (2.25%). Con ello se demuestra que el micelio de P. ostreatus tiene la capacidad de retención de Pb y Cr, de acuerdo a las evaluaciones desde el primer día (Figura 1a) el Pb registró disminución drástica de la concentración inicial de 20 mg L^-1 a 5.065 mg L^-1, siendo el día 5 la de mayor adsorción de dicho metal (75%), los demás días se observaron procesos de desorción y adsorción con diferencia significativa respecto al tiempo cero (Cuadro 1), algo semejante ocurre en los trabajos de Marín et al. (2015), quienes describen un proceso de adsorción de 57.9% en las primeras 48 h, con una concentración inicial de 100 mg L^-1.

De igual modo, ^{Yang et al. (2017)} observaron la eliminación de Pb de 99.9 -100% y que se transportaba a la pared celular fúngica en relación de 68.2 al 91.2%. Esto indica que el metal además de ser adsorbido en la superficie de la biomasa miceliar, ingresó al interior de las células interfiriendo con el metabolismo causando alteraciones en la estructura y morfología, este proceso fue favorecido por la variación del pH inicial de 5.5 a pH de 3.5, ya que de acuerdo a ^{Javaid et al. (2011)}; ^{Eliescu et al. (2020)}; ^{Huang et al. (2009)}, este cambio propicio la disociación química tanto de grupos funcionales carboxílicos, amino, metilo, fosfato e hidróxidos constituyentes de la pared celular y de los metales en solución, aumentando su solubilidad y favoreciendo la disponibilidad de biosorción en la biomasa y la bioacumulación intracelular.

El comportamiento del Cr en solución se aprecia en la Figura 1b, la concentración inicial (20 mg L^-1) disminuyó a 13.15 mg L^-1 (34.2%) a pH de 5.5, la bioadsorción no mostró diferencia significativa hasta el día 4 registrando 11.6 mg L^-1 (41.9%) lo que correspondió al máximo de retención, los siguientes días se observaron desorciones del metal sin registrar mayor bioadsorción a pH final de 6.6. Al respecto, Marín et al. (2015) observaron que el Cr en una concentración de 100 mg L^-1 tuvo una adsorción ascendente a partir del cuarto día de muestreo de 33.9 mg L^-1, hasta 59.8 mg L^-1 a los 10 días a pH 5.2, además en los trabajos de ^{Da Rocha et al. (2019)} al utilizar solución de Cr (Ⅵ) 25 mg L^-1 la adsorción en 15 días alcanzó 100%.

Esto permite considerar que la retención de Cr ocurrió en los primeros días de contacto y posteriormente el pH influyó en la desorción del metal haciéndolo insoluble para la retención por el micelio. En contraste, ^{Prasenjit et al. (2005)} indican que trabajando con Aspergillus foetidus con concentración inicial de 5 mg L^-1 de cromo, a pH 7.0 en 92 h de contacto registraron retenciones metálicas de 97%. ^{Nasseri et al. (2002)} reportan que experimentando con Aspergillus oryzae, en concentración inicial de 240 mg L^-1, a pH de 5 en 36 h de contacto, registraron 97% de retención de cromo y ^{Bai y Abraham (2005)} indican que trabajando con Rhizopus nigricans, en concentraciones iniciales de 100 mg L^-1 de cromo, a pH de 2, en 4 h de contacto, evaluaron 80% de retención del metal.

Esto indica que el pH del medio y el tiempo de contacto son factores importantes para la retención del metal y también indica que la naturaleza de la cepa puede ser determinante en los resultados obtenidos. La adsorción de Cd (Figura 1c) fue de 0.46 mg L^-1 (2.25%) del primer día de contacto a pH de 5.5, hasta el día 7 de incubación.

En el Cuadro 1 se presenta el análisis estadístico del efecto del tiempo sobre la absorción de metales pesados en el medio liquido experimental, en el caso de cadmio en los días 9 y 10 la retención del metal alcanzó 1.08 mg L^-1 (5.5%), a pH 2.8, conjuntamente con inhibición del crecimiento miceliar, posiblemente debido a las características toxicas propias del metal y el cambio drástico del pH inicial de 5.5 a 2.8, esta tendencia de retención coincide con la descrita en los trabajos de ^{Yang et al. (2017)} quienes observaron disminución del 45.9-61.1% de una concentración inicial de 40 mg L^-1 a pH de 4.5.

De acuerdo con ^{Frutos et al. (2016)}; ^{Deng et al. (2009)}, los valores de pH de una solución deben considerarse como un factor importante que influye en el proceso de biosorción, también influye en la toxicidad y la química de la solución de los metales, así como en las propiedades de hidrólisis y complejación al provocar cambios en la forma iónica.

Por lo tanto, la carga iónica de los grupos funcionales y la especiación del metal a diferentes valores de pH pueden afectar la biosorción. Otro aspecto importante es la especie del hongo utilizada debido a que de acuerdo con ^{Javaid et al. (2011)}; ^{Ogbo y Okhuoya (2011)} en cada especie la biosorción puede variar con el tipo de metal, su concentración y composición del medio de cultivo o sustrato, y el comportamiento de un elemento depende de las especies particulares en la que está presente debido a que la mayor reactividad de una especie no siempre coincidirá con la mayor concentración inicial del metal en esa forma química. Por lo tanto, el comportamiento de un elemento en el ambiente (biodisponibilidad, toxicidad, distribución, etc.) no puede predecirse basándose en su concentración.

En este análisis se puede apreciar en la columna de cada metal las diferencias significativas entre el tiempo cero y el tiempo de mayor retención metálica por parte de la biomasa de P. ostreatus, en caso de plomo es el día 5, con cromo es el día 4 y con cadmio es el día 7. También es importante observar que existe diferencia significativa entre la retención de los metales por la biomasa, independientemente de los días señalados anteriormente, la diferencia se manifiesta entre el Pb y Cr y entre el Pb y Cd.

Evaluación de concentraciones metálicas inhibitorias del crecimiento miceliar

El crecimiento radial del micelio de P. ostreatus se presenta en la Figura 2, en mm por día a diferentes concentraciones metálicas (20, 40, 60, 80 y 100 mg L^-1) de Pb, Cr y Cd. En la Figura 2, se describe como el micelio de P. ostreatus, con ninguna concentración de plomo y cromo presento inhibición de su crecimiento, sin embargo, cadmio si logro inhibirlo a partir de la concentración de 60 mg L^-1. Los resultados indican que el micelio de P. ostreatus presenta tolerancia a ciertas soluciones metálicas, lo que se sustenta mediante el análisis de la Figura 2a, donde se observa el desarrollo continuo del micelio en las 5 concentraciones sin presentar inhibición, ni diferencia significativa (p≤ 0.05) en los días 1 y 2, en cambio, muestra diferencia a partir del día 3.

Figura 2 Crecimiento radial del micelio del hongo P. ostreatus en mm por día en cinco concentraciones (20, 40, 60, 80 y 100 mg L^-1) de: a) plomo; b) cromo; y c) cadmio. 

Asimismo, se puede observar que el día 8 alcanza el más alto crecimiento a la concentración de 100 mg L^-1, resultado que coincide con el trabajo de ^{Yang et al. (2017)} quienes observaron el mismo fenómeno de resistencia. De igual modo ^{Morales-Fonseca et al. (2010)}. Cuantificaron el crecimiento radial, a concentraciones bajas entre 0.02-1.5 mg L^-1 y altas entre 15-11 000 mg L^-1, de acetato de Pb y observaron un crecimiento de micelio de P. ostreatus de 50 mm a los 10 días de incubación sin alteración en la morfología macroscópica y microscópica, con las concentraciones altas las alteraciones se presentaron, pero la tolerancia hacia el pomo se registró entre 200 y 500 mg L^-1, se debe mencionar además que Marín et al. (2015).

Al examinar el crecimiento miceliar de P. ostreatusen concentración de 50 mg L^-1 de solución de Pb observaron que no fue inhibido, permaneciendo viable después de 20 días de exposición en medio sólido. Se puede suponer que P. ostreatus tiene una gran capacidad para tolerar y eliminar Pb; a través, de procesos consecutivos de adsorción y bioacumulación debido a que este metal puede fijarse en los grupos funcionales aminas (NH₂) e hidroxilos (OH) de la estructura química de la pared celular, logrando penetrar hasta la célula depositándose en el citosol de la estructura celular del micelio (^{Huang et al., 2009}; ^{Wang et al., 2019}; ^{Eliescu et al., 2020}).

El crecimiento radial del micelio del hongo P. ostreatus en mm por día a diferentes concentraciones de soluciones de Cr (20, 40, 60, 80, y 100 mg L^-1), se representa en la Figura 2b, su desarrollo fue continuo, sin presentar inhibición en las cinco concentraciones de Cr, sin diferencia significativa. Asimismo, en los días 7 y 8 se observó 86.03% de desarrollo a una concentración de 100 mg L^-1, este resultado es semejante al obtenido por ^{Yang et al. (2017)} quienes trabajaron con soluciones de Cr en concentraciones de 50-300 mg L^-1 y observaron que el micelio crecía bien hasta 150 mg L^-1, pero a partir de 200 mg L^-1 presentaba una inhibición parcial y una total en 300 mg L^-1.

El mismo comportamiento lo registraron da ^{Rocha Ferreira et al. (2019)} quienes midieron el incremento radial del micelio de P. ostreatus en el rango de (10-150 mg L^-1) de Cr (VI) durante 10 días de incubación, sin inhibición de crecimiento, lo que implica que altas concentraciones de soluciones metálicas de Cr inhiben el crecimiento del hongo por el posible daño a la membrana celular, la inducción de la peroxidación lipídica, la formación de especies reactivas de oxígeno, así como daño a las estructuras de ADN y proteínas (^{Huang et al., 2009}: ^{Sazanova et al., 2015}; ^{Eliescu et al., 2020}).

En la Figura 2c se observa el crecimiento radial del micelio de P. ostreatus en mm por día a diferentes concentraciones de soluciones de Cd, se presenta inhibición a partir de la concentración de 60 mg/L, pero se aprecia crecimiento hasta el día 8 en una concentración de 100 mg L^-1 alcanzando el mayor crecimiento y no se registró avance miceliar posterior.

Este comportamiento coincide con lo reportado por ^{Yang et al. (2017)} quienes trabajaron con concentraciones de Cd de 10-50 mg L^-1 y reportaron inhibición del crecimiento miceliar en P. ostreatus a partir de la concentración de 40 mg L^-1, paralelamente, ^{Miaomiao et al. (2018)} descubrieron dos cepas de P. ostreatus JINONG21 y SUYIN6 tolerantes al Cd, observando una inhibición de crecimiento a partir del día 7 de inoculación a 40 mg L^-1 de concentración, en este caso se puede considerar como en los metales anteriores que el comportamiento y el efecto de Cd sobre el crecimiento y la viabilidad del micelio de P. ostreatus, varían de acuerdo a las concentraciones y el tipo de elemento de acuerdo con ^{Yang et al. ( 2017)}; Baldrian (2003).

Descripción del efecto de la concentración metálica en la morfología de estructuras miceliales por microscopia electrónica de barrido (SEM).

En la Figura 3 se muestra la morfología microscópica estructural interna del micelio de P. ostreatus antes y después de hacer contacto con las diferentes concentraciones metálicas experimentales de Pb, Cr, y Cd, las estructuras fueron analizadas por microscopia electrónica de barrido y espectrometría de rayos X.

Figura 3 Estructuras microscópicas del micelio de P. ostreatus del control (a) y del micelio con soluciones metálicas de plomo (b), cromo (c) y cadmio (d) respectivamente. 

En esta figura se observa el daño sobre la estructura miceliar debido a la acción de los metales experimentales indicando estas imágenes que el metal además de ser adsorbido en la superficie del micelio, logró ingresar al interior de las células interfiriendo con su metabolismo causando alteraciones en la estructura y morfología celular.

En la Figura 3a se aprecian las estructuras de reproducción del micelio de P. ostreatus, las cuales se presentan desarrolladas en el medio sólido libre de metales (control) y se aprecian hifas alargadas, hialinas, hidratadas, cilíndricas, septadas, y las estructuras esféricas o blastoconidios turgentes igual como lo indican ^{Bowman et al. (2006)}.

En la Figura 3b se presentan los cambios ocurridos en la morfología del micelio por el efecto de la solución metálica de Pb, se observan las hifas deformadas, deshidratadas, aplanadas y rotas, no se advierten estructuras de reproducción, esto indica que el metal además de ser adsorbido en la superficie de la biomasa miceliar ingreso al interior de las células interfiriendo con el metabolismo causando alteraciones en la estructura y morfología celular.

La Figura 3c presenta al micelio que estuvo en contacto con solución metálica de Cr, se observan las estructuras sin turgencia, con ruptura de hifas y ausencia de los blastoconidios, esto es indicativo de la interacción del Cr con grupos funcionales OH-, -NH, pertenecientes a hidratos de carbono y proteínas de la pared celular, pero los daños celulares estructurales pueden estar relacionados con la interacción del cromo con grupos -CH₃ y =CH₂ de ácidos grasos asociados a fosfolípidos constituyentes de la membrana celular, esto implica la interacción del metal con el metabolismo celular y su bioacumulación en el interior del micelio como lo mencionan Corona et al. ( 2010); ^{Cervantes et al. ( 2006)}.

La Figura 3d muestra el micelio desarrollado en medio sólido con Cd, el cual muestra mayor deshidratación y deformación de las hifas, mayor ruptura y mínima presencia de estructuras conidiales. En las secciones b, c, y d de la Figura 3 también se aprecia el aumento del tamaño o engrosamiento de las estructuras dañadas, lo cual puede ser debido a la elevada tolerancia del micelio a ciertos metales, por lo que se inicia la activación de mecanismos de defensa como el engrosamiento de la pared, la síntesis de melaninas y la producción de ácidos orgánicos (^{Arango et al., 2009}), ya que de acuerdo con ^{Banerjee y Nayak (2007)}; ^{Javaid et al. (2011)} estos hongos de podredumbre blanca y en particular P. ostreatus tienen una pared celular compuesta por β 1-3 y β 1-6 glucanos de grupos carboxílicos, amino, tiol, fosfato e hidróxido en la pared celular que ayudan en la biosorción de iones metálicos y ofrecen una barrera primaria contra el metal.

La Figura 4 muestra el análisis de espectrometría de dispersión de energía de rayos X (EDX) al micelio de P. ostreatus, donde el Pb alcanzo mayor retención en el interior del micelio. En la figura 4a se presenta el análisis EDX a la muestra testigo del micelio de P. ostreatus, en la Figura 4b se puede apreciar la presencia de Pb en el micelio, esto corrobora que hubo bioacumulación en el interior de las células y la pared celular igual como lo refieren ^{Morales-Fonseca et al. (2010)} y en las Figuras 4c y 4d se puede observar la presencia de Cr y Cd respectivamente en la prueba de microanálisis de energía de rayos X de las muestras de micelio de P. ostreatus.

Figura 4 Microanálisis de energía de rayos X de las muestras de micelio de P. ostreatus, muestra control (a) donde se observa el contenido cuantitativo del micelio presencia de Pb (b) en el tejido fúngico Cr (c) y Cd (d). 

En la Figura 5, se presentan las alteraciones causadas por plomo y cadmio en la biomasa miceliar de otras especies de hongos.

Figura 5 Microscopía electrónica de barrido en biomasa miceliar de Phanerochaete chysosporium, a) micelio sin contacto con los metales; b) efecto de solución de Pb a 300 mg L^-1; c) efecto de la solución de Cadmio; y d) micelio de P. chysosporium en contacto con Pb y Cd (^{Morales et al., 2008}). 

Comparando las imágenes de las Figuras 3 y 5 se puede observar que las alteraciones a la morfología celular del micelio son diferentes esto seguramente está relacionado con las concentraciones metálicas y los tiempos de contacto que en este caso fueron de 72 h de acuerdo con ^{Morales et al. (2008)}.