En la década de 1960 la utilización del ensilaje en la industria ganadera incrementó considerablemente y se volvió el método de preservación de forraje que más se utiliza para la alimentación del ganado (^{Cheli et al., 2013}), este representa entre 45-60% de las dietas en los sistemas de producción de ganado lechero en todo el mundo, así como en la producción del ganado productor de carne en América y Europa (^{Adesogan, 2009}; ^{Millen et al., 2009}; ^{Tangni et al., 2013}; ^{Alpizar, 2015}), el ensilaje puede ser de diferentes cultivos o forrajes como alfalfa, avena, maíz, mezcla de mazorcas o pulpa de remolacha (^{Tangni et al., 2013}), el objetivo de este es maximizar la preservación de nutrientes originales del cultivo forrajero, con una pérdida mínima en su calidad nutricional (^{Alonso et al., 2013}). Uno de los problemas que presenta el ensilaje es la contaminación por bacterias y hongos, que provocan la pérdida de materia seca y nutrientes (^{Garon et al., 2006}; ^{Alonso et al., 2013}), ocasionando que el ganado disminuya el consumo del mismo, afectando la producción de leche, rendimiento en ganancia diaria de peso (GDP) y la salud de los animales (Alpízar, 2015).

^{Carrillo (2003)} indica que la contaminación por hongos en los alimentos puede ser antes, durante y después de la cosecha, en el transporte y almacenamiento, ya que los alimentos se encuentran permanentemente en contacto directo con esporas de los hongos toxicogénicos. ^{Reyes-Velázquez et al. (2008)}; ^{Keller et al. (2012)}; Alpízar (2015) reportan que la contaminación del ensilaje de maíz en México, Argentina, Brasil, Lituania, Suiza, Holanda, Irlanda y Dinamarca es provocada por hongos principalmente de los géneros: Mucor spp., Penicillium spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Alternaria spp., Cladosporium spp. y Geotruchum spp.

Mientras que otros estudios realizados en Lituania y Brasil, han reportado la presencia de hongos de los generos: Aspergillus spp., Rhizopus spp. y Penicillium spp., en ensilajes de trébol, ryegrass, sorgo, triticale, avena y mezcla de pastos (^{Baliukoniene et al., 2012}; ^{Keller et al., 2012}). Algo muy similar ha sido reportado en ensilajes de maíz y alfalfa, donde los hongos contaminantes fueron: Penicillium spp., Aspergillus fumigatus, Trichoderma viride, Geotrichum candidum, Paecilomyces variotii, Monascus ruber y Monascus purpureus (^{Bočarov-Stančić et al., 2014}).

Monascus purpureus es utilizado en la industria farmacéutica y alimentaria como un colorante natural en la cultura oriental y en países asiáticos. Este hongo crece a una temperatura de 25 a 37 °C, con un máximo de 45 °C, puede crecer en un amplio intervalo de pH, desde 2.5 a 8 (^{Pineda-Insuasti et al., 2016}). Es capaz de producir citrinina, una micotoxina que afecta al riñón, pero también se han notificado otros órganos diana, como el hígado y la médula ósea, está micotoxina es nefrotóxica, embriocida, fetotóxica, teratogénica y genotóxica causando daño a humanos y animales (^{Flajs y Peraica. 2009}; ^{Bensassi et al., 2011}; ^{Wang et al., 2017}).

Los posibles mecanismos toxicológicos de la citrinina son ubicados en la mitocondria renal y hepática, causando atrofia en la interferencia del proceso del transporte de electrones, además de la alteración de la homeostasis del Ca²⁺ y la generación de estrés oxidativo (^{Chia-Ding et al., 2014}). La Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) clasificó a la citrinina en el grupo 3 de los carcinógenos, debido a la evidencia limitada de su carcinogenicidad en animales y no hay evidencia para humanos (^{Flajs y Peraica, 2009}). Por otro lado, ^{Bočarov-Stančić et al. (2014)}, realizaron estudios en ensilaje de maíz y alfalfa en Serbia encontrando hongos del género Monascus en sus muestras. El objetivo de esta investigación fue identificar la presencia del hongo Monascus purpureus en ensilaje de maíz, avena, triticale y alfalfa.

En los periodos de noviembre-diciembre de 2017 y abril-mayo de 2018, se utilizó la técnica ‘W’ para la toma de las muestras (^{Bautista y Santos, 2004}), se obtuvieron un total de 16 muestras de ensilaje de maíz, avena, triticale y alfalfa, de cuatro localidades por cada entidad, Aguascalientes, Zacatecas, Guanajuato y Jalisco. Con el uso de la tècnica antes mencionada, se tomó un kilogramo de cinco puntos del ensilaje, los cuales se homogenizaron obteniendo un total de cinco kilogramos y se extrajo una submuestra de 5 g, se les realizaron cortes de aproximadamente 5 mm, obteniendo 12 submuestras por muestra, se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio al 3% durante un minuto, se enjuagaron en tres ocasiones con agua destilada estéril, se dejaron secar, se inocularon en placas petri 20 mL con medio PDA acidificado (200 μL de ácido láctico al 85% por cada litro), se incubaron a 28 ±2 ºC por siete días.

Posteriormente, se observó el crecimiento micelial de las muestras de silo inoculado; se realizó la purificación de cada hongo, en medio PDA acidificado e incubando a 27 °C, durante 8 días en que se desarrollan las estructuras reproductivas necesarias para la identificación del hongo. Se tomaron porciones de micelio con esporas, se realizaron las tinciones, se colocaron en un portaobjetos donde ya se tenía una gota del colorante azul de algodón y se colocaba en el cubreobjetos, después se observaron al microscopio y se identificaron en base a las claves taxonómicas de ^{Barnett y Hunter (1998)}.

Mediante la técnica PCR-ITS, se realizó la identificación molecular, a las cepas aisladas se les extrajo el ADN mediante el método de ^{Doyle y Doyle modificado (1990)}. El producto de la extracción se corrió en un gel de agarosa al 1% mediante electroforesis. Posteriormente se desarrolló el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) las regiones internas transcritas ITS1 (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’), utilizando Taq&GO Matermix (1.5 mM MgCl₂, 200 µM DNTP’s) siguiendo recomendaciones del fabricante (MP^®); 0.5 µL de ITS1 a 20 µM; 0.5 µL de ITS4 a 20 µM; 1 µL de DNA problema ajustado a 100 ng y agua bidestilada estéril para aforar a 15 μL.

Las condiciones de la reacción de PCR fueron: 1 ciclo de desnaturalización inicial a 94 °C por 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 10 segundos, 30 ciclos de alineamiento a 57 °C por 30 s, 30 ciclos de extensión a 72 °C por 2 min y 1 ciclo de extensión final a 72 °C por 5 min. La amplificación se visualizó en un gel de agarosa al 1% mediante electroforesis. El producto de PCR se mandó secuenciar al laboratorio Macrogen en Maryland, Estados Unidos de América.

A las muestras de ensilaje de alfalfa, maíz, avena y triticale se les realizó una evaluación macroscópica para identificar posibles anormalidades en su apariencia, observándose que los ensilajes eran compactos y presentaban una consistencia dura que hacía difícil al corte, en la evaluación se observó tonos de color rojo intenso como se aprecia en las Figuras 1 y 2, las cuales muestran tonalidades semejantes a las reportadas para Fusarium spp.

Figura 1 Muestra de ensilaje de maíz donde se aprecia la tonalidad del hongo y apelmazamiento del ensilaje.  

Figura 2 Muestra de ensilaje de maíz donde se observa el apelmazamiento del ensilaje. 

De las 16 muestras obtenidas de los ensilajes, se logró aislar 63 cepas diferentes de hongos de las cuales 11.1% (7/63) correspondieron al hongo Monascus purpureus. Se lograron obtener siete cepas de hongos Monascus purpureus, dos en ensilaje de maíz, uno en alfalfa, dos en triticale y dos en avena que representan 3.17, 1.58, 3.17 y 3.17% respectivamente.

Asimismo, en los cultivos que se realizaron de cada una de las muestras, se pudo observar una gama de colores que fueron desde el blanco, crema, anaranjado, rojo intenso hasta un color tinto en el micelio como se observa en el anverso de las cajas de Petri (Figura 3), mientras que en el reverso las coloraciones fueron de un color anaranjado a rojas como se observa en la Figura 4.

Figura 3 En el micelio se observan las diferentes tonalidades del hongo 

Figura 4 Se observa el rojo intenso que caracteriza el hongo Monascus 

Microscópicamente se lograron observar ascocarpos de paredes delgadas y cadenas de conidios redondos (Figura 5), paralelamente también se logró observar ascosporas en el interior del ascocarpo (Figura 6).

Figura 5 Vista microscópica del hongo Monascus spp., se observan las estructuras ascosporas y los conidios característicos de este hongo (objetivo de 40x) 

Figura 6 Vista microscópica del hongo Monascus spp., se observa una mejor definición de las estructuras ascosporas, ascocarpos y tamaño características de este hongo (objetivo de 100x) 

^{Pineda-Insuasti et al. (2016)}, indican que el hongo Monascus crece fácilmente en residuos agroindustriales como es el capacho u hoja de maíz y raquis de palma de aceite, aunado a las condiciones de crecimiento: temperatura, pH, humedad y concentración de nutrientes (nitrógeno, zinc, manganeso y hierro) provocan que el hongo se desarrolle y propague en campo, lo que conlleva a uno de los principales problemas de contaminación del ensilaje (^{Kim et al., 2002}).

^{Bočarov-Stančić et al. (2014)}, realizaron estudios en ensilaje de maíz y alfalfa en Serbia encontrando hongos del género Monascus en sus muestras. ^{Garon et al. (2006)}, reportan la presencia de Monascus en ensilaje de maíz en Francia, ellos realizaron las tomas de muestras del ensilaje de maíz en los meses de noviembre, diciembre y febrero, datos que coinciden con nuestras tomas de muestras de los diferentes tipos de ensilaje y la presencia del hongo Monascus en los ensilajes de maíz, alfalfa, triticale y avena.

Las secuencias obtenidas del análisis molecular fueron comparadas con las secuencias reportadas en la base de datos del banco de genes del National Center for Biotechnology Information NCBI) de EE.UU (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), mediante el uso del programa BLAST, donde se obtuvo como resultado que 95.58% de las muestras aisladas mostraron similitud al hongo Monascus purpureus (Cuadro 1).